Enrichissement de la bibliothèque d’ARNm et de bisulfite-ARNm pour le séquençage de nouvelle génération
Summary
Ce protocole fournit un flux de travail facile à suivre pour effectuer la purification de l’ARN poly(A), la conversion du bisulfite et la préparation de la bibliothèque à l’aide d’un équipement normalisé pour un échantillon biologique d’intérêt.
Abstract
Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN dans divers types de transcrits d’ARN sont associées à une régulation diversifiée de l’ARN dans les cellules eucaryotes. Il a été démontré que les modifications aberrantes de l’ARN 5-méthylcytosine et l’expression dérégulée des ARN méthyltransférases sont associées à diverses maladies, y compris les cancers. Le séquençage au bisulfite à l’échelle du transcriptome a été développé pour caractériser les positions et les niveaux quantitatifs de méthylation de la cytosine dans l’ARN converti au bisulfite à la résolution de la paire de bases. Dans ce document, ce protocole présente en détail les procédures de deux cycles de purification de l’ARN poly(A), de trois cycles de réaction au bisulfite et de la préparation de la bibliothèque pour permettre la cartographie à l’échelle du transcriptome des sites de modification de l’ARNm 5-méthylcytosine. L’évaluation de la quantité et de la qualité de l’ARN après la réaction principale est essentielle pour surveiller l’intégrité de l’ARN et constitue une étape critique pour garantir des banques de séquençage de haute qualité. Idéalement, les procédures peuvent être terminées en trois jours. Avec ce protocole, l’utilisation d’ARN total de haute qualité comme entrée peut pratiquement constituer des banques robustes d’ARNm bisulfite pour le séquençage de nouvelle génération à partir de l’échantillon d’intérêt.
Introduction
Parmi plus de 150 types de modifications post-transcriptionnelles1, la modification de la 5-méthylcytosine (m5C) a été identifiée dans divers types d’ARN, y compris l’ARN ribosomique, l’ARN de transfert, l’ARN messager, le micro-ARN, l’ARN long non codant, l’ARN voûté, l’ARN enhancer et les ARN spécifiques du corps du petit cajal2. L’ARN m 5 C est associé à divers mécanismes biologiques et pathologiques tels que la régulation du développement racinaire des plantes 3, l’expressiondes gènes viraux4 et la progression du cancer5. L’objectif de ce protocole est de fournir des pipelines rationalisés pour caractériser le profil de modification de l’ARNm m5C à l’échelle du transcriptome d’échantillons biologiques à différents stades de développement ou dans le contexte de la maladie. Le séquençage au bisulfite à l’échelle du transcriptome a été développé pour caractériser les positions et les niveaux quantitatifs de méthylation de la cytosine dans l’ARN converti au bisulfite à la résolution de la paire de bases 6,7,8,9. Ceci est particulièrement utile lors de l’étude de l’association de m5C avec l’expression des gènes et le destin de l’ARN qui est impliqué dans les mécanismes de régulation biologique dans les cellules. Dans la cellule de mammifère, il existe deux lecteurs connus de m 5 C : ALYREF peut reconnaître m 5 C au niveau du noyau et sert de transporteur noyau d’ARNm vers cytosol10, tandis que YBX1 peut reconnaître m5C dans le cytoplasme et augmenter la stabilisation de l’ARNm11. Des ARNm m5C aberrants liés aux voies immunitaires ont été rapportés dans les lymphocytes T CD4+ du lupus érythémateux disséminé12. Des études ont révélé une association entre la modification de l’ARNm m5C et la modulation de l’immunité cancéreuse et la progression du cancer13,14. Par conséquent, la cartographie du profil de modification m5C sur l’ARNm peut fournir des informations cruciales pour élucider la machinerie réglementaire potentielle.
Pour étudier les rôles fonctionnels de lamodification de l’ARN m 5 C dans certaines conditions biologiques, les approches basées sur la conversion au bisulfite (bsRNA-seq) et l’enrichissement par affinité des anticorps telles que m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq et 5-Aza-seq peuvent être combinées avec la plate-forme de séquençage à haut débit pour fournir une détection efficace des régions et des séquences ciblées avec les modifications m5C à l’échelle du transcriptome15, Débloquer le niveau 16. L’avantage de ce protocole est d’obtenir le paysage complet de l’ARN m 5 C à une résolution à base unique, car l’approche basée sur l’enrichissement par affinité des anticorps repose sur la disponibilité d’anticorps de hautequalité et pourrait atteindre la résolution d’un seul fragment du paysage de méthylation m5C17.
Tous les échantillons d’ARN seront traités avec deux cycles d’enrichissement de l’ARNm à l’aide de billes d’oligo(dT), trois cycles de réaction au bisulfite et la préparation de la banque de séquençage. Pour surveiller la qualité de l’ARN, chaque échantillon d’ARN sera examiné par électrophorèse sur gel capillaire avant et après les procédures de purification de l’ARNm et de réaction au bisulfite afin d’évaluer la distribution des fragments. Les banques purifiées seront examinées en fonction de leurs qualités d’amplicon par PCR, de la distribution granulométrique des fragments d’ADN par électrophorèse sur gel capillaire et de leurs quantités globales examinées par des tests quantitatifs basés sur des colorants de fluorescence avant séquençage. Le système peut également être utilisé pour analyser un large éventail d’échantillons biologiques tels que des produits agricoles, des virions isolés, des lignées cellulaires, des organismes modèles et des échantillons pathologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, un pipeline détaillé d’enrichissement en poly(A), de conversion de bisulfite et de préparation de la bibliothèque a été réalisé en utilisant des composants standardisés. D’autres analyses de séquençage ont permis d’identifier l’ARNm 5-méthylcytosine dans des échantillons d’intérêt.
L’étape critique est la qualité du matériau de départ – l’ARN total – car la dégradation de l’ARN aurait un impact sur le taux de récupération de la purificat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Conseil national de la science et de la technologie de Taïwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Materials
| Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
| AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
| Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
| Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
| DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
| DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
| Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra  Directional RNA Library Prep Kit for Illumina |
New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
| Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |
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