次世代シーケンシングのためのmRNAおよび亜硫酸水素-mRNAライブラリー調製の濃縮

サマリー

このプロトコルは、目的の生物学的サンプルに対して標準化された装置を使用して、ポリ(A)RNA精製、重亜硫酸塩変換、およびライブラリ調製を行うためのわかりやすいワークフローを提供します。

要約

様々なタイプのRNA転写物におけるRNA転写後修飾は、真核細胞における多様なRNA制御と関連している。RNAの5-メチルシトシン修飾の異常とRNAメチルトランスフェラーゼの発現異常は、がんを含むさまざまな疾患と関連していることが示されています。トランスクリプトームワイドの亜硫酸水素塩基配列決定は、塩基対の分解能で亜硫酸水素バイサルファイト変換RNAの位置と定量的シトシンメチル化レベルを特徴付けるために開発されました。本明細書では、このプロトコルは多(A) RNAの浄化の2つの円形、重亜硫酸塩の反作用の3周期、およびmRNA 5-methylcytosineの修正の場所のトランスクリプトーム広い地図を描くことを可能にするために図書館の準備のプロシージャを詳しく示す。主反応後のRNAの量と質の評価は、RNAの完全性をモニターするために不可欠であり、高品質のシーケンシングライブラリを確保するための重要なステップです。理想的には、手続きは3日以内に完了することができます。このプロトコルでは、高品質のトータルRNAをインプットとして使用することで、目的のサンプルから次世代シーケンシング用の堅牢な亜硫酸水素-mRNAライブラリを実際に構築できます。

概要

150種類以上の転写後修飾1のうち、5-メチルシトシン(^m5C)修飾は、リボソームRNA、トランスファーRNA、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、長鎖ノンコーディングRNA、ボールトRNA、エンハンサーRNA^、低分子カハール体特異的RNAなど、さまざまな種類のRNAで同定^{されています2。RNAm5C}は、植物の根の発生³、ウイルスの遺伝子発現⁴、^癌の進行5の調節など、多様な生物学的および病理学的メカニズムと関連している。このプロトコルの目的は、異なる発生段階または疾患設定における生物学的サンプルのトランスクリプトームワイドmRNA m⁵C修飾プロファイルを特徴付けるための合理化されたパイプラインを提供することです。トランスクリプトームワイドの亜硫酸バイサルファイトシーケンシングは、塩基対の分解能⁶、^7、8、9で亜硫酸水素バイサルファイト変換RNAの位置と定量的シトシンメチル化レベルを特徴付けるため....

プロトコル

1. ポリ(A)RNA精製

注:ポリ(A)RNA精製に進む前に、DNase Iで処理したトータルRNAを使用し、キャピラリーまたは従来のゲル電気泳動評価によってトータルRNAの品質と完全性を調べます。研究者は、高分子量フィールドの 28S および 18S rRNA リボソーム バンドと、低分子量フィールドの 5.8S rRNA バンドを、エレクトロフェログラムに有意な塗抹標本バンドなしで識別できる必要があります。精製ステップは、基本的にメーカーの指示に従い、特定のステップで示されている軽微な変更が加えられています。このプロトコルで使用されるすべての材料と機器に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。

1. 準備
   1. 試薬、洗浄バッファー、オリゴ(dT)ビーズ、溶解バッファーを室温で30分間温めてから、以下の手順を行ってください。
   2. ポリ(A)濃縮RNAを単離するには、ヌクレアーゼフリーの1.5 mL微量遠心チューブに十分な量のRNAを移し、出発物質として10〜20 μgの高品質トータルRNAアリコートを調製します。ヒートブロック内で 70°C で5分間インキュベートし、その後氷上で2 分間保持します。
      注:出発物質となるトータルRNAの量は、mRNAの所望量および使用する細胞の性....

結果

細胞株¹⁹ から得られた一連のbsRNA-seqライブラリーは、本レポート (図1)の手順に従って作製しました。細胞株サンプルに対してDNase処理を伴ったトータルRNA精製を行い、ゲル電気泳動およびUV-Vis分光光度法(A260/A280)で品質を確認した後、RNAサンプルはポリ(A)RNA濃縮に進むことができます。二重精製でリボソームRNAの大部分を除去できるかどうかを調べるために、rRNAコンタミネーション率を自動計算できるキャピラリー電気泳動トータルRNAアッセイにより、ポリ(A)RNAの精製効率を評価しました (図2)。RNAフラグメントのピークパターンとrRNAコンタミネーション率から、2回精製したRNAサンプルは、AsPC-1とBxPC-3でそれぞれ6.5%から2.2%、2.6%から1.1%にリボソームRNAのコンタミネーションが減少することを示しました。ヒト膵臓がん細胞株では、2回のビー.......

ディスカッション

このプロトコルでは、標準化されたコンポーネントを利用することで、ポリ(A)濃縮、重亜硫酸塩変換、およびライブラリ調製の詳細なパイプラインが達成されました。さらなるシーケンシング解析により、目的のサンプル中のmRNA 5-メチルシトシンが同定されました。

RNAの分解はポリ(A)RNA精製の回収率に影響を与えるため、重要なステップは出発物質であるトータルRNAの品質です。ポリ(A)RNA精製ステップを実施する前に、サンプルを慎重に取り扱い、RNaseの汚染を避ける必要があります。手順のもう一つの重要な部分は、ライブラリ調製におけるPCRサイクルの数です。サイクル数の決定は、ライブラリ調製に使用される重亜硫酸塩処理mRNAの量と、PCR前のステップで1つのサイズ選択または2倍のサイズ選択を使用するかどうかによって異なります。したがって、目的のサンプルに適したサイクル番号は、試運転が必要であり、キャピラリー電気泳動によってPCR産物のサイズ分布を評価して、同じ細胞株または組織に最適なサイクル番号を決定します。

このプロトコルでは、オ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Agilent 2100 電気泳動バイオアナライザー システム	アジレント、サンタクララ、カリフォルニア州		RNA 品質検出
AMpure XP ビーズ	ベックマン・コールター	A63881	DNA
を精製 バイオアナライザー DNA 高感度キット	アジレント、サンタクララ、CA	5067-4626	DNA 品質検出
バイオアナライザー RNA 6000 ピコキット	アジレント、サンタクララ、CA	5067-1513	RNA品質検出
DiaMag02 - 磁気ラック	Diagenode, Denville, NJ	B04000001	アシストライブラリ調製
DiaMag1.5 - 磁気ラック	Diagenode, Denville, NJ	B04000003	アシストポリ(A) RNA精製
Dynabeads mRNA DIRECT 精製キット	サーモフィッシャーサイエンティフィック, ウォルサム, MA	61011	ポリ(A) RNA精製;ウォッシュバッファー1およびウォッシュバッファー2
タノール	J.T.Baker	64-17-5
EZ RNAメチル化キット	Zymo, Irvine, CA	R5002	重亜硫酸塩処理
ホタルルシフェラーゼmRNA	プロメガ, マディソン, ウィスコンシン州, USA	L4561	制御シーケンスのスパイク
KAPA ライブラリ定量キット	ロシュ、スイス	KK4824	ライブラリ定量
ナノドロップ分光光度計	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ		総RNA量検出
NEBNextマルチプレックス イルミナ用オリゴ (インデックス プライマーセット1)	ニューイングランドバイオラボ、イプスウィッチ、マサチューセッツ	E7335S	ライブラリ調製
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7760S	library preparation
Nuclease-free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
P2 pipetman	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4641010
Qubit 2.0 fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		RNA 量検出
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32854	DNA 量検出
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32852	RNA 量検出

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