Summary

Anrikning av mRNA- och bisulfit-mRNA-biblioteksberedning för nästa generations sekvensering

Published: July 07, 2023
doi:

Summary

Detta protokoll ger ett arbetsflöde som är lätt att följa för att utföra poly(A) RNA-rening, bisulfitomvandling och biblioteksberedning med hjälp av standardiserad utrustning för ett biologiskt prov av intresse.

Abstract

RNA-posttranskriptionsmodifieringar i olika typer av RNA-transkript är associerade med olika RNA-reglering i eukaryota celler. Avvikande RNA 5-metylcytosinmodifieringar och det dysreglerade uttrycket av RNA-metyltransferaser har visat sig vara associerade med olika sjukdomar, inklusive cancer. Transkriptomomfattande bisulfitsekvensering utvecklades för att karakterisera positionerna och de kvantitativa cytosinmetyleringsnivåerna i det bisulfitomvandlade RNA:t vid basparsupplösningen. Häri presenterar detta protokoll procedurerna för två omgångar av poly(A) RNA-rening, tre cykler av bisulfitreaktion och biblioteksförberedelse i detalj för att möjliggöra transkriptomomfattande kartläggning av mRNA 5-metylcytosinmodifieringsställen. Bedömningen av RNA-kvantitet och -kvalitet efter huvudreaktionen är avgörande för att övervaka RNA-integriteten och är ett kritiskt steg för att säkerställa sekvenseringsbibliotek av hög kvalitet. Helst kan procedurerna slutföras inom tre dagar. Med detta protokoll kan man genom att använda högkvalitativt total-RNA som ingång praktiskt bygga upp robusta bisulfit-mRNA-bibliotek för nästa generations sekvensering från det aktuella provet.

Introduction

Bland över 150 typer av post-transkriptionella modifieringar1 har modifiering av 5-metylcytosin (m5C) identifierats i olika typer av RNA, inklusive ribosomalt RNA, transfer-RNA, budbärar-RNA, mikro-RNA, långt icke-kodande RNA, valv-RNA, förstärkar-RNA och små cajal-kroppsspecifika RNA2. RNA m 5 C är associerat med olika biologiska och patologiska mekanismer såsom reglering av växtrotutveckling3, viralt genuttryck4 och cancerprogression5. Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla strömlinjeformade pipelines för att karakterisera den transkriptomomfattande mRNA m5C-modifieringsprofilen för biologiska prover i olika utvecklingsstadier eller i sjukdomsmiljön. Transkriptomomfattande bisulfitsekvensering utvecklades för att karakterisera positionerna och de kvantitativa cytosinmetyleringsnivåerna i det bisulfitomvandlade RNA:t vid basparsupplösning 6,7,8,9. Detta är särskilt användbart när man studerar sambandet mellanm5C och genuttryck och RNA-öde som är involverat i de biologiska regleringsmekanismerna i celler. I däggdjurscellen finns det två kända m 5 C-läsare: ALYREF kan känna igen m 5 C vid kärnan och fungerar som en mRNA-kärna-till-cytosol-transportör10, medan YBX1 kan känna igen m5C i cytoplasman och ökamRNA-stabiliseringen11. Avvikande m5C-mRNArelaterade till immunvägar rapporterades i systemiska lupus erythematosus CD4+ T-celler12. Studier har visat ett samband mellan mRNAm5C-modifiering och modulering av cancerimmunitet och cancerprogression13,14. Kartläggning avm5C-modifieringsprofilen på mRNA kan därför ge viktig information för att belysa det potentiella regulatoriska maskineriet.

För att undersöka de funktionella rollerna för RNA m5 C-modifiering under vissa biologiska förhållanden kan de bisulfitomvandlingsbaserade (bsRNA-seq) och antikroppsaffinitetsanrikningsbaserade metoderna såsom m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq och 5-Aza-seq kombineras med sekvenseringsplattformen med hög genomströmning för att ge effektiv detektion av målregioner och sekvenser med m5C-modifieringarna på en transkriptomomfattande skala15, 16. veckor Fördelen med detta protokoll ger det omfattande RNA m 5 C-landskapet med en enda basupplösning eftersom den antikroppsaffinitetsanrikningsbaserade metoden är beroende av tillgången på antikroppar av hög kvalitet och kan uppnå upplösningen av ett fragment av m5C-metyleringslandskap17.

Alla RNA-prover kommer att bearbetas med två omgångar mRNA-anrikning med oligo(dT)-pärlor, tre cykler av bisulfitreaktion och sekvenseringsbibliotekets beredning. För att övervaka RNA-kvaliteten kommer varje RNA-prov att undersökas med kapillärgelelektrofores före och efter procedurerna för mRNA-rening och bisulfitreaktion för att bedöma fragmentfördelningen. De renade biblioteken kommer att undersökas med hjälp av deras PCR-amplikonkvaliteter, DNA-storleksfördelningsfragment med kapillärgelelektrofores och deras totala kvantiteter kommer att undersökas med fluorescensfärgningsbaserade kvantitativa analyser före sekvensering. Systemet kan också användas för att analysera ett brett spektrum av biologiska prover såsom jordbruksprodukter, isolerade virioner, cellinjer, modellorganismer och patologiska prover.

Protocol

1. Rening av poly(A)RNA OBS: Använd det totala RNA som behandlats med DNas I och undersök den totala RNA-kvaliteten och integriteten genom kapillär eller konventionell gelelektroforesbedömning innan du fortsätter till poly(A) RNA-rening. Utredarna bör kunna identifiera 28S och 18S rRNA-ribosombanden i högmolekylviktsfältet och 5,8S rRNA-bandet i lågmolekylviktsfältet utan några signifikanta utstryksband i elektroferogrammet. Reningsstegen följer i huvudsak tillverkar…

Representative Results

En serie bsRNA-seq-bibliotek från cellinjer19 genererades genom att följa procedurerna i denna rapport (Figur 1). Efter total RNA-rening åtföljd av DNase-behandling utförd på cellinjeprover och kvaliteten kontrollerad med gelelektrofores och UV-Vis-spektrofotometri (A260/A280), kan RNA-provet gå vidare till poly(A) RNA-anrikning. För att avgöra om dubbelreningen kunde avlägsna majoriteten av ribosomalt RNA, bedömdes reningseffektiviteten f?…

Discussion

I detta protokoll uppnåddes en detaljerad pipeline av poly(A)-anrikning, bisulfitkonvertering och biblioteksförberedelse genom att använda standardiserade komponenter. Ytterligare sekvenseringsanalys gav identifiering av mRNA 5-metylcytosin i prover av intresse.

Det kritiska steget är kvaliteten på startmaterialet – totalt RNA – eftersom nedbrytningen av RNA skulle påverka återvinningshastigheten för poly(A) RNA-rening. Provet ska hanteras noggrant och RNas-kontaminering undvikas innan…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av Taiwans nationella vetenskaps- och teknikråd. [NSTC 111-2314-B-006-003]

Materials

Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System Agilent, Santa Clara, CA RNA quality detection
AMpure XP beads Beckman Coulter A63881 purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-4626 DNA quality dection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-1513 RNA quality dection
DiaMag02 – magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000001 assist library preparation
DiaMag1.5 – magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000003 assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 61011 poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol J.T.Baker 64-17-5
EZ RNA methylation kit Zymo, Irvine, CA R5002 bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA Promega, Madison, WI, USA L4561 spike in control seqeunce 
KAPA Library Quantification Kits Roche, Switzerland KK4824 library quantification
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) New England Biolabs, Ipswich, MA E7335S library preparation
NEBNext Ultra Equation 1 Directional RNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs, Ipswich, MA E7760S library preparation
Nuclease-free Water Thermo Fisher Scientific AM9932
P2 pipetman Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 4641010
Qubit 2.0 fluorometer  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32854 DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32852 RNA quantity detection

References

  1. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
  2. Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102 (2019).
  3. Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959 (2023).
  4. Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
  5. Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
  6. Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
  7. Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
  8. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).
  9. Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40 (2020).
  10. Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export – NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606 (2017).
  11. Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
  12. Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430 (2020).
  13. Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15 (2022).
  14. Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43 (2020).
  15. Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
  16. Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
  17. Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231 (2020).
  18. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , (2009).
  19. Chen, S. -. Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
  20. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  21. Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
  22. Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
  23. Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
  24. Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
  25. Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
  26. Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281 (2019).
  27. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602 (2013).
  28. Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
  29. Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198 (2021).
  30. Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
  31. Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045 (2022).
  32. Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
  33. Chao, H. -. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
check_url/65352?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Chen, S., Huang, P. Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (197), e65352, doi:10.3791/65352 (2023).

View Video