عزل وتحديد الخلايا المتخصصة في الحوفي
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل وتحديد الخلايا المتخصصة في الحوفي البشري.
Abstract
نبلغ هنا عن إجراء قياسي لعزل وتحديد الخلايا المتخصصة القزحية (LNCs). تم استخدام أنسجة الليمبوس التي تم الحصول عليها من بنك العين لعزل LNCs. تم تقسيم الأنسجة إلى 12 قطعة تحت ظروف معقمة وهضمها لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا باستخدام كولاجيناز A للحصول على مجموعات الخلايا مع LNCs والخلايا السلفية الظهارية القزحية. تم هضم مجموعات الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام 0.25٪ trypsin-EDTA للحصول على خلايا مفردة ثم زرعها في وسط الخلايا الجذعية الجنينية المعدلة (MESCM) على سطح بلاستيكي مغطى ب 5٪ Matrigel. تم تمرير الخلايا عند التقاء 70٪ ، وتم تحديد LNCs باستخدام التألق المناعي ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) ، وقياس التدفق الخلوي. تم عزل LNCs الأولية ومرورها أكثر من 12 مرة. كان نشاط انتشار LNCs من P4 إلى P6 هو الأعلى. عبرت LNCs عن علامات خلايا جذعية أعلى من BMMSCs (SCF و Nestin و Rex1 و SSEA4 و CD73 و CD90 و MSX1 و P75NTR و PDGFRβ). علاوة على ذلك ، أظهرت النتائج أن P4 LNCs عبرت بشكل موحد عن VIM و CD90 و CD105 و PDGFRβ ، ولكن ليس Pan-CK ، والتي يمكن استخدامها كعلامة لتحديد LNCs. أظهر تحليل التدفق الخلوي أن ما يقرب من 95٪ و 97٪ و 92٪ و 11٪ من LNCs عبرت عن CD73 و CD90 و CD105 و SCF على التوالي ، بينما كانت 68٪ و 99٪ و 20٪ و 3٪ في BMMSCs. ويمكن أن توفر العملية المعيارية لعزل البلدان غير الطبيعية وتحديد هويتها أساسا مختبريا موثوقا به للاستخدام الواسع النطاق للبلدان غير الطبيعية.
Introduction
أصبح حدوث نقص الخلايا الجذعية الظهارية القرنية (CESD) ، ويسمى أيضا نقص الخلايا الجذعية الطرفية (LSCD) 1 ، وتجديد ظهارة القرنية (CES) أكثر إلحاحا بسبب عدوى القرنية وإصابتها. إذا لم يتم علاجها بشكل صحيح ، يمكن أن يؤدي CESD إلى العمى الذي يتطلب زرع القرنية. نتيجة لذلك ، أصبح تجديد CES أكثر أهمية. هناك مجموعة من الخلايا الداعمة تسمى الخلايا المتخصصة القزحية (LNCs) التي توفر الدعم الأساسي لوظيفة CES. تم عزل الخلايا الجذعية اللحمية القزحية لأول مرة بواسطة Polisetty et al.2 وتم تحديدها بواسطة Xie et al.3 على أنها LNCs المترجمة في ظهارة القزحية تحت الانبساط وسدى الليمبوس. LNCs هي الخلايا الجذعية الداعمة الرئيسية لحافة القرنية ، ومع وظيفة MSC المشتقة من نخاع العظم (BMMSCs) ، ويمكن تحريضها على التطور إلى خلايا ظهارية القرنية وخلايا انسجة القرنية ، إلخ.3،4،5،6،7. أظهرت الدراسات السابقة أن صفات الخلايا الجذعية ل LNCs أكثر بدائية منBMMSCs 8 ، والتي تستخدم بالفعل على نطاق واسع في العيادة. قد تصبح LNCs الخيار التالي القابل للتطبيق بعد MSC ، خاصة لعلاج CESD. كخلايا داعمة مهمة ل CES ، فإن LNCs هي أيضا خلايا جذعية مشتقة من البنية “المتخصصة” للطرف. قد تلعب LNCs دورا رئيسيا في إلغاء تمايز الخلايا الظهارية القرنية الناضجة (MCEC) إلى CES9. ومع ذلك، لا تزال الدراسات المتعلقة بالشركات غير المحلية غير كافية نسبيا، ولا يوجد توافق في الآراء بشأن مصطلحات الشركات غير الساحلية وعزلها وتنقيتها وتحديدها وخصائصها. قام بعض الباحثين بتسمية LNCs الخلايا الجذعية اللحمية المشتقة من الخزعة الطرفية 10 ، والخلايا الجذعية الوسيطة الطرفية11 ، والخلايا الجذعية الليفية الطرفية12 ، والخلايا اللحمية المتوسطةالطرفية 13. نظرا لأن خصائص نمو LNCs لم يتم وصفها بالتفصيل ، وبسبب تطبيقاتها العلمية والسريرية الواعدة ، وقد تكون واحدة من أهم الأدوات السريرية في المستقبل ، فمن الضروري تلخيص عزل وتنقية وتحديد وخصائص LNCs.
وفقا لدراسة سابقة14 ، توجد LNCs بشكل رئيسي في ظهارة القزحية تحت وسدى الليمبوس. يتضمن هذا البروتوكول علاج أنسجة الأطراف باستخدام كولاجيناز أ ، والحصول على مجموعة تتكون من LEPC و LNCs ، وهضمها في خلايا مفردة مع 0.25٪ trypsin-EDTA (TE). ثم تم استزراع LNCs بشكل انتقائي في وسط الخلايا الجذعية الجنينية المعدلة (MESCM) لتنقيتها. البروتوكول المذكور في هذه الورقة بسيط وله كفاءة عالية في الحصول على LNCs البشرية بكميات كبيرة.
تم تسجيل الإجراء التفصيلي لعزل LNC وثقافته وتحديد هويته في الفيديو للعلماء المهتمين بدراسة LNC ، ويمكن تكراره بسهولة عند الحاجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
عادة ما يتم الحفاظ على شفافية القرنية من خلال الترتيب والتوزيع المنتظم للألياف الصغيرة (قطرها 25-30 نانومتر) في سدى القرنية ، وهو أمر بالغ الأهمية لحدة الرؤية الطبيعية16. هناك 253 مليون شخص يعانون من ضعف البصر في جميع أنحاء العالم ، 36 مليون منهم مكفوفون17. تعتبر منظمة ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكرا ل Wei Wang و Lingjuan Xu و Rong Liu على التوجيه بشأن هذا العمل ، و Yongyao Tan و Bihui Jin و Chunxiu You و Li Guigang لتوفير بعض المواد ، و Guanyu Su لكتابة المخطوطة ، و Xiao Zhou و Yihong Xiong و Huatao Xie لتصحيح المخطوطة ، و Guigang Li لتوجيهاته الكاملة. ودعمت هذه الدراسة المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82070936، 81470606، 81570819)، ومشروع البحث العلمي للصحة وتنظيم الأسرة في مقاطعة هوبى (No. WJ2017M073) ، أفضل عشرة مشاريع بحثية طبية متعدية من مستشفى تونغجي (رقم 2016ZHYX20) ، مشروع تدريب الرواد الطبيين الشباب في مدينة ووهان (رقم 2015whzqnyxggrc10) ، برنامج توظيف المواهب العالمية (G2022154028L) ، مشروع اللجنة الوطنية للصحة في مقاطعة هوبي في عام 2022 (WJ2021ZH0005) ، ومؤسسة البناء الموضوعي لقسم المالية في هوبى في عام 2022 (42000022815T000000102)
Materials
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | – |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | – |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | – |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | – |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | – |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | – |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | – |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | – |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | – |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
References
- Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
- Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
- Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
- Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
- Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
- Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
- Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16 (2020).
- Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1 (2022).
- Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172 (2014).
- Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
- Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
- Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471 (2022).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
- Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566 (2018).
- Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. Regenerative therapy for the cornea. Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011 (2022).
- Pineda, R. . World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , 299-305 (2020).
- Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441 (2022).
- Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562 (2022).
- Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
- Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
- O’Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265 (2020).
- Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
- Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115 (2017).
- Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
- Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
- Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
- Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
- González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
- Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
- Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. Stem cells in the limbal stroma. Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).
- Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
- Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).
