בידוד וזיהוי תאי נישה לימבליים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וזיהוי תאי הנישה הלימבליים האנושיים.
Abstract
כאן אנו מדווחים על הליך סטנדרטי לבידוד וזיהוי של תאי נישה לימבליים (LNCs). רקמת לימבוס שהתקבלה מבנק עיניים שימשה לבידוד LNCs. הרקמה חולקה ל -12 חתיכות בתנאים אספטיים ועוכלה במשך 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית התא באמצעות collagenase A כדי להשיג אשכולות תאים עם LNCs ותאי אב אפיתל לימבלי. אשכולות התאים עוכלו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C תוך שימוש ב-0.25% טריפסין-EDTA כדי להשיג תאים בודדים, ולאחר מכן גודלו בתרבית במדיום תאי גזע עובריים מהונדסים (MESCM) על משטח פלסטיק מצופה ב-5% מטריג’ל. תאים הועברו במפגש של 70%, ו- LNCs זוהו באמצעות immunofluorescence, PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) וציטומטריית זרימה. LNCs ראשוניים בודדו ועברו יותר מ -12 פעמים. פעילות ההתפשטות של LNCs מ-P4 ל-P6 הייתה הגבוהה ביותר. LNCs ביטאו סמנים גבוהים יותר של תאי גזע מאשר BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR ו- PDGFRβ). יתר על כן, התוצאות הראו כי P4 LNCs ביטאו באופן אחיד VIM, CD90, CD105 ו- PDGFRβ, אך לא Pan-CK, שיכול לשמש כסמן לזיהוי LNCs. ניתוח ציטומטרי זרימה הראה כי כ- 95%, 97%, 92% ו- 11% מה- LNCs ביטאו CD73, CD90, CD105 ו- SCF בהתאמה, בעוד שהם היו 68%, 99%, 20% ו- 3% ב- BMMSC. התהליך הסטנדרטי לבידוד וזיהוי LNC יכול לספק בסיס מעבדה אמין לשימוש נרחב ב- LNCs.
Introduction
השכיחות של מחסור בתאי גזע אפיתל בקרנית (CESD), המכונה גם מחסור בתאי גזע לימבליים (LSCD)1, והתחדשות אפיתל הקרנית (CES) הופכים דחופים יותר ויותר בגלל זיהום ופציעה בקרנית. אם לא מטופלים כראוי, CESD יכול להוביל לעיוורון הדורש השתלת קרנית. כתוצאה מכך, התחדשות CES הופכת משמעותית יותר. קיימת קבוצה של תאים תומכים הנקראים תאי נישה לימבליים (LNCs) המספקים תמיכה חיונית לתפקוד CES. תאי גזע סטרומה לימבליים בודדו לראשונה על ידי Polisetty et al.2 וזוהו על ידי Xie et al.3 כ- LNCs אשר ממוקמים באפיתל הלימבלי, subjacent וסטרומה של הלימבוס. LNCs הם תאי הגזע התומכים העיקריים של שפת הקרנית, ועם הפונקציה של MSC הנגזר ממח עצם (BMMSCs), וניתן לגרום להם להתפתח לתאי אפיתל בקרנית ולתאי סטרומה בקרנית, וכו ‘.3,4,5,6,7. מחקרים קודמים הראו כי תכונות תאי הגזע של LNCs הן פרימיטיביות יותר מאשר BMMSCs8, אשר כבר בשימוש נרחב במרפאה. LNCs עשויים אפילו להפוך את האפשרות המעשית הבאה לאחר MSC, במיוחד לטיפול CESD. כתאים תומכים חשובים עבור CES, LNCs הם גם תאי גזע הנגזרים מהמבנה “הנישתי” של הלימבוס. LNCs עשויים למלא תפקיד מפתח בהתמיינות של תאי אפיתל קרנית בוגרים (MCEC) ל- CES9. עם זאת, מחקרים על LNCs עדיין אינם מספיקים יחסית, ואין הסכמה על המינוח, הבידוד, הטיהור, הזיהוי והמאפיינים של LNCs. כמה חוקרים קראו לתאי גזע סטרומה שמקורם בביופסיה לימבלית 10, תאי גזע מזנכימליים לימבליים 11, תאי גזע פיברובלסטים לימבליים12 ותאי סטרומה מזנכימליים לימבליים13. מכיוון שמאפייני הצמיחה של LNCs לא תוארו בפירוט, ובגלל היישומים המדעיים והקליניים המבטיחים שלהם, ועשויים להיות אחד הכלים הקליניים החשובים ביותר בעתיד, יש צורך לסכם את הבידוד, הטיהור, הזיהוי והמאפיינים של LNCs.
על פי מחקר קודם14, LNCs נמצאים בעיקר באפיתל הלימבל subjacent וסטרומה של הלימבוס. פרוטוקול זה כולל טיפול ברקמת לימבוס באמצעות collagenase A, קבלת אשכול המורכב מ- LEPC ו- LNCs, ועיכול לתאים בודדים עם 0.25% טריפסין-EDTA (TE). לאחר מכן LNCs תורבתו באופן סלקטיבי בתווך תאי גזע עובריים שונה (MESCM) כדי להיות מטוהרים. הפרוטוקול המדווח במאמר זה הוא פשוט ובעל יעילות גבוהה בהשגת LNCs אנושיים בכמויות גדולות.
ההליך המפורט של בידוד, תרבית וזיהוי LNC תועד בסרטון עבור מדענים המעוניינים במחקר LNC, וניתן לחזור עליו בנוחות בעת הצורך.
Protocol
Representative Results
Discussion
שקיפות הקרנית נשמרת בדרך כלל על ידי סידור ופיזור קבוע של סיבים קטנים (בקוטר 25-30 ננומטר) בסטרומה של הקרנית, שהוא חיוני לחדות ראייה תקינה16. ישנם 253 מיליון אנשים לקויי ראייה ברחבי העולם, מתוכם 36 מיליון עיוורים17. ארגון הבריאות העולמי (WHO) מחשיב עיוורון קרנית כאחד הסיכונ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תודה לוויי וואנג, לינג-ג’ואן שו ורונג ליו על ההדרכה בעבודה זו, יונגיאו טאן, בי-הווי ג’ין, צ’ון-שיו יו ולי גוויגאנג על אספקת חלק מהחומר, גואניו סו על כתיבת כתב היד, שיאו ג’ואו, יי-הונג שיונג והואטאו שיה על תיקון כתב היד, וגוויגאנג לי על הדרכתו המלאה. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘82070936, 81470606, 81570819), פרויקט מחקר מדעי לבריאות ותכנון המשפחה במחוז חוביי (מס ‘. WJ2017M073), עשרת פרויקטי המחקר הרפואי התרגומי המובילים מבית החולים טונג’י (No.2016ZHYX20), פרויקט הכשרה של חלוצים רפואיים צעירים בעיר ווהאן (No.2015whzqnyxggrc10), תוכנית גיוס כישרונות גלובלית (G2022154028L), פרויקט ועדת הבריאות הלאומית של מחוז חוביי בשנת 2022 (WJ2021ZH0005), ופרויקט בניית נושא של מחלקת הכספים של חוביי בשנת 2022 (42000022815T000000102)
Materials
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | – |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | – |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | – |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | – |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | – |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | – |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | – |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | – |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | – |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
References
- Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
- Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
- Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
- Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
- Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
- Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
- Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16 (2020).
- Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1 (2022).
- Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172 (2014).
- Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
- Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
- Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471 (2022).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
- Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566 (2018).
- Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. Regenerative therapy for the cornea. Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011 (2022).
- Pineda, R. . World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , 299-305 (2020).
- Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441 (2022).
- Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562 (2022).
- Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
- Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
- O’Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265 (2020).
- Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
- Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115 (2017).
- Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
- Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
- Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
- Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
- González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
- Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
- Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. Stem cells in the limbal stroma. Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).
- Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
- Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).
