Isolement et identification des cellules de niche limbique

Summary

Nous présentons ici un protocole permettant d’isoler et d’identifier les cellules de niche limbique humaines.

Abstract

Nous rapportons ici une procédure standard pour l’isolement et l’identification des cellules de niche limbique (LNC). Le tissu limbique obtenu à partir d’une banque d’yeux a été utilisé pour l’isolement des LNC. Le tissu a été divisé en 12 morceaux dans des conditions aseptiques et digéré pendant 18 h à 37 °C dans l’incubateur de culture cellulaire à l’aide de la collagénase A pour obtenir des amas cellulaires avec des LNC et des cellules progénitrices de l’épithélium limbique. Les amas de cellules ont ensuite été digérés pendant 15 minutes à 37 °C en utilisant 0,25 % de trypsine-EDTA pour obtenir des cellules individuelles, puis cultivés dans un milieu de cellules souches embryonnaires modifiées (MESCM) sur une surface plastique recouverte de 5 % de Matrigel. Les cellules ont été transmises à 70 % de confluence, et les LNC ont été identifiés à l’aide de l’immunofluorescence, de la PCR quantitative en temps réel (qPCR) et de la cytométrie en flux. Les LNC primaires ont été isolés et sont passés plus de 12 fois. L’activité de prolifération des LNC de P4 à P6 a été la plus élevée. Les LNC ont exprimé des marqueurs de cellules souches plus élevés que les BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR et PDGFRβ). De plus, les résultats ont montré que les LNC P4 exprimaient uniformément VIM, CD90, CD105 et PDGFRβ, mais pas Pan-CK, qui pourrait être utilisé comme marqueur pour l’identification des LNC. L’analyse par cytométrie en flux a montré qu’environ 95 %, 97 %, 92 % et 11 % des LNC exprimaient respectivement CD73, CD90, CD105 et SCF, alors qu’ils étaient respectivement de 68 %, 99 %, 20 % et 3 % dans les BMMSC. Le procédé normalisé d’isolement et d’identification des LNC pourrait fournir une base de laboratoire fiable pour l’utilisation généralisée des LNC.

Introduction

L’incidence du déficit en cellules souches épithéliales cornéennes (CESD), également appelé déficit en cellules souches limbiques (LSCD)¹, et de la régénération épithéliale cornéenne (CES) devient de plus en plus urgente en raison des infections et des lésions cornéennes. Si elle n’est pas correctement traitée, la CESD peut entraîner une cécité qui nécessite une greffe de cornée. En conséquence, la régénération du CES devient plus importante. Il existe un groupe de cellules de soutien appelées cellules de niche limbique (LNC) qui fournissent un soutien essentiel à la fonction CES. Les cellules souches stromales limbiques ont d’abord été isolées par Polisetty et ^al.2 et identifiées par Xie et ^al.3 comme des LNC qui sont localisées dans l’épithélium limbique sous-jacent et le stroma du limbe. Les LNC sont les principales cellules souches de soutien du bord cornéen et, avec la fonction des CSM dérivées de la moelle osseuse (BMMSC), et pourraient être induites à se développer en cellules épithéliales cornéennes et en cellules stromales cornéennes, etc.3,4,5,6,7. Des études antérieures ont montré que les qualités des cellules souches des LNC sont plus primitives que celles des^{BMMSCs 8}, qui sont déjà largement utilisées en clinique. Les LNC pourraient même devenir la prochaine option viable après la CSM, en particulier pour le traitement du CESD. En tant que cellules de soutien importantes pour le CES, les LNC sont également des cellules souches dérivées de la structure de « niche » du limbe. Les LNC peuvent jouer un rôle clé dans la dédifférenciation des cellules épithéliales cornéennes matures (MCEC) en CES⁹. Cependant, les études sur les LNC sont encore relativement insuffisantes et il n’y a pas de consensus sur la terminologie, l’isolement, la purification, l’identification et les caractéristiques des LNC. Certains chercheurs ont nommé les cellules souches stromales dérivées de la biopsie limbique¹⁰, les cellules souches mésenchymateuses limbiques¹¹, les cellules souches fibroblastiques limbiques 12 et les cellules stromales mésenchymateuses limbiques¹³. Étant donné que les caractéristiques de croissance des LNC n’ont pas été décrites en détail, et en raison de leurs applications scientifiques et cliniques prometteuses, et qu’elles pourraient être l’un des outils cliniques les plus importants à l’avenir, il est nécessaire de résumer l’isolement, la purification, l’identification et les caractéristiques des LNC.

Selon une étude antérieure¹⁴, les LNC sont principalement présents au niveau de l’épithélium limbique sous-jacent et du stroma du limbe. Ce protocole comprend le traitement du tissu limbique à l’aide de la collagénase A, l’obtention d’un cluster composé de LEPC et de LNC, et sa digestion en cellules uniques avec 0,25 % de trypsine-EDTA (TE). Les LNC ont ensuite été sélectivement cultivés dans un milieu de cellules souches embryonnaires modifiées (MESCM) pour être purifiés. Le protocole décrit dans cet article est simple et très efficace pour obtenir des LNC humains en grande quantité.

La procédure détaillée d’isolement, de culture et d’identification du LNC a été enregistrée dans la vidéo pour les scientifiques intéressés par l’étude du LNC, et elle peut être facilement répétée en cas de besoin.

Protocol

Les tissus Limbus provenant de donneurs âgés de 50 à 60 ans ont été obtenus auprès de la banque d’yeux de la Croix-Rouge de l’hôpital de Tongji (Wuhan, Chine). Le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique de Tongji et a été mené conformément à la Déclaration d’Helsinki. 1. Isolement Obtenir du tissu limbique à partir d’un milieu de stockage cornéen à moyen terme et opérer dans des conditions aseptiques sur un établi ultra-propr…

Representative Results

Croissance de LNCLes LNC ont été isolés avec succès selon la méthode de digestion de la collagénase A (2 mg/mL) du tissu cornéo-scléral, telle que décrite ci-dessus (Figure 1). Conformément à une étude précédemment rapportée3, après la digestion de la collagénase A, des amas ressemblant à des chenilles ont été visualisés au microscope (Figure 2). La proportion de cellules fusiformes augmentait pro…

Discussion

La transparence cornéenne est généralement maintenue par la disposition et la distribution régulières de petites fibres (25 à 30 nm de diamètre) dans le stroma cornéen, ce qui est crucial pour l’acuité visuelle normale¹⁶. Il y a 253 millions de personnes malvoyantes dans le monde, dont 36 millions sont aveugles¹⁷. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) considère la cécité cornéenne comme l’un des risques les plus graves pour la vue humaine, représent…

Materials

4',6-Diamidino-2-Phenylindole	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
Amphotericin B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Bovine Serum Albumin	MERCK	A1933	–
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Cell Incubator	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Centrifuge system	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	–
Collagenase A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Confocal microscope	Zeiss	LSM700	–
Culture plate	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree Star	–
Flow Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	–
Fluorescence microscope	olympus	cx31
Gentamicin	Sigma	G1914	50 μg/mL
Hemocytometer	MERCK	Z359629	Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit	ThermoFisher	4374966
Inverted phase-contrast microscope	UOP	DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)	Sigma	I3146	5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	–
Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldehyde	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldehyde	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument	Applied Biosystems	Step One Plus	–
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit	Qiagen	74104	–
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stereomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade	Careforde	29500	size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20%
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40%
Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
Tween 20	MERCK	P9416	–
Ultra Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100