Isolamento e identificazione delle cellule di nicchia limbari

Guanyu Su; Wei Wang; Lingjuan Xu; Rong Liu; Yongyao Tan; Bihui Jin; Chunxiu You; Xiao Zhou; Yihong Xiong; Huatao Xie; Guigang Li

doi:10.3791/65618

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Articolo metodologico

Isolamento e identificazione delle cellule di nicchia limbari

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DOI:

10.3791/65618

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27 ottobre 2023

Guanyu Su¹ , Wei Wang¹ , Lingjuan Xu¹ , Rong Liu¹ , Yongyao Tan¹ , Bihui Jin¹ , Chunxiu You¹ , Xiao Zhou¹ , Yihong Xiong² , Huatao Xie³ , Guigang Li¹

¹Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, ²Institute of Medicine Nursing, Hubei University of Medicine, ³Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e identificare le cellule di nicchia limbare umane.

Abstract

Di seguito riportiamo una procedura standard per l'isolamento e l'identificazione delle cellule di nicchia limbare (LNC). Il tessuto di libus ottenuto da una banca degli occhi è stato utilizzato per l'isolamento degli LNC. Il tessuto è stato diviso in 12 pezzi in condizioni asettiche e digerito per 18 ore a 37 °C nell'incubatore di colture cellulari utilizzando la collagenasi A per ottenere cluster cellulari con LNC e cellule progenitrici epiteliali limbari. I cluster di cellule sono stati ulteriormente digeriti per 15 minuti a 37 °C utilizzando tripsina-EDTA allo 0,25% per ottenere singole cellule e quindi coltivati in terreno di coltura con cellule staminali embrionali modificate (MESCM) su una superficie di plastica rivestita con Matrigel al 5%. Le cellule sono state fatte passare dopo una confluenza del 70% e le LNC sono state identificate utilizzando l'immunofluorescenza, la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) e la citometria a flusso. Gli LNC primari sono stati isolati e attraversati più di 12 volte. L'attività di proliferazione dei LNC da P4 a P6 è stata la più alta. Le LNC esprimevano marcatori di cellule staminali più elevati rispetto alle BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR e PDGFRβ). Inoltre, i risultati hanno mostrato che gli LNC P4 esprimevano uniformemente VIM, CD90, CD105 e PDGFRβ, ma non Pan-CK, che potrebbe essere utilizzato come marcatore per l'identificazione degli LNC. L'analisi citofluorimetrica ha mostrato che circa il 95%, 97%, 92% e 11% degli LNC esprimeva rispettivamente CD73, CD90, CD105 e SCF, mentre erano rispettivamente il 68%, il 99%, il 20% e il 3% nelle BMMSC. Il processo standard per l'isolamento e l'identificazione degli LNC potrebbe fornire una base di laboratorio affidabile per l'uso diffuso degli LNC.

Introduzione

L'incidenza del deficit di cellule staminali epiteliali corneali (CESD), chiamato anche deficit di cellule staminali limbari (LSCD)¹, e la rigenerazione epiteliale corneale (CES) stanno diventando sempre più urgenti a causa di infezioni e lesioni corneali. Se non adeguatamente trattata, la CESD può portare alla cecità che richiede il trapianto di cornea. Di conseguenza, la rigenerazione del CES sta diventando sempre più significativa. Esiste un gruppo di cellule di supporto chiamate cellule di nicchia limbare (LNC) che forniscono un supporto essenziale per la funzione CES. Le cellule staminali stromali limbari sono state isolate per la prima vo....