Isolamento e identificazione delle cellule di nicchia limbari

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e identificare le cellule di nicchia limbare umane.

Abstract

Di seguito riportiamo una procedura standard per l’isolamento e l’identificazione delle cellule di nicchia limbare (LNC). Il tessuto di libus ottenuto da una banca degli occhi è stato utilizzato per l’isolamento degli LNC. Il tessuto è stato diviso in 12 pezzi in condizioni asettiche e digerito per 18 ore a 37 °C nell’incubatore di colture cellulari utilizzando la collagenasi A per ottenere cluster cellulari con LNC e cellule progenitrici epiteliali limbari. I cluster di cellule sono stati ulteriormente digeriti per 15 minuti a 37 °C utilizzando tripsina-EDTA allo 0,25% per ottenere singole cellule e quindi coltivati in terreno di coltura con cellule staminali embrionali modificate (MESCM) su una superficie di plastica rivestita con Matrigel al 5%. Le cellule sono state fatte passare dopo una confluenza del 70% e le LNC sono state identificate utilizzando l’immunofluorescenza, la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) e la citometria a flusso. Gli LNC primari sono stati isolati e attraversati più di 12 volte. L’attività di proliferazione dei LNC da P4 a P6 è stata la più alta. Le LNC esprimevano marcatori di cellule staminali più elevati rispetto alle BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR e PDGFRβ). Inoltre, i risultati hanno mostrato che gli LNC P4 esprimevano uniformemente VIM, CD90, CD105 e PDGFRβ, ma non Pan-CK, che potrebbe essere utilizzato come marcatore per l’identificazione degli LNC. L’analisi citofluorimetrica ha mostrato che circa il 95%, 97%, 92% e 11% degli LNC esprimeva rispettivamente CD73, CD90, CD105 e SCF, mentre erano rispettivamente il 68%, il 99%, il 20% e il 3% nelle BMMSC. Il processo standard per l’isolamento e l’identificazione degli LNC potrebbe fornire una base di laboratorio affidabile per l’uso diffuso degli LNC.

Introduction

L’incidenza del deficit di cellule staminali epiteliali corneali (CESD), chiamato anche deficit di cellule staminali limbari (LSCD)¹, e la rigenerazione epiteliale corneale (CES) stanno diventando sempre più urgenti a causa di infezioni e lesioni corneali. Se non adeguatamente trattata, la CESD può portare alla cecità che richiede il trapianto di cornea. Di conseguenza, la rigenerazione del CES sta diventando sempre più significativa. Esiste un gruppo di cellule di supporto chiamate cellule di nicchia limbare (LNC) che forniscono un supporto essenziale per la funzione CES. Le cellule staminali stromali limbari sono state isolate per la prima volta da Polisetty et ^al.2 e identificate da Xie et ^al.3 come LNC che sono localizzate nell’epitelio limbare sottostante e nello stroma del limbus. Le LNC sono le principali cellule staminali di supporto del bordo corneale e, con la funzione delle MSC derivate dal midollo osseo (BMMSC), potrebbero essere indotte a svilupparsi in cellule epiteliali corneali e cellule stromali corneali, ecc.3,4,5,6,7. Studi precedenti hanno dimostrato che le qualità delle cellule staminali delle LNC sono più primitive rispetto alle BMMSC⁸, che sono già ampiamente utilizzate in clinica. Le LNC possono anche diventare la prossima opzione praticabile dopo la MSC, soprattutto per il trattamento della CESD. In quanto importanti cellule di supporto per la CES, le LNC sono anche cellule staminali derivate dalla struttura “di nicchia” del limbus. Le LNC possono svolgere un ruolo chiave nella dedifferenziazione delle cellule epiteliali corneali mature (MCEC) in CES⁹. Tuttavia, gli studi sugli LNC sono ancora relativamente insufficienti e non c’è consenso sulla terminologia, l’isolamento, la purificazione, l’identificazione e le caratteristiche degli LNC. Alcuni ricercatori hanno chiamato cellule staminali stromali derivate da biopsia limbare^{LNC 10}, cellule staminali mesenchimali^{limbari 11}, cellule staminali dei fibroblasti limbari¹² e cellule stromali mesenchimali limbari¹³. Poiché le caratteristiche di crescita delle LNC non sono state descritte in dettaglio e a causa delle loro promettenti applicazioni scientifiche e cliniche, e potrebbero essere uno degli strumenti clinici più importanti in futuro, è necessario riassumere l’isolamento, la purificazione, l’identificazione e le caratteristiche delle LNC.

Secondo un precedente studio¹⁴, le LNC sono presenti principalmente a livello dell’epitelio limbare sottostante e dello stroma del limbus. Questo protocollo include il trattamento del tessuto limbus utilizzando la collagenasi A, l’ottenimento di un cluster costituito da LEPC e LNC e la digestione in singole cellule con lo 0,25% di tripsina-EDTA (TE). Le LNC sono state quindi coltivate selettivamente in un terreno di cellule staminali embrionali modificate (MESCM) per essere purificate. Il protocollo riportato in questo documento è semplice e ha un’elevata efficienza nell’ottenere LNC umani in grandi quantità.

La procedura dettagliata di isolamento, coltura e identificazione dell’LNC è stata registrata nel video per gli scienziati interessati allo studio dell’LNC e può essere comodamente ripetuta quando necessario.

Protocol

Il tessuto Limbus proveniente da donatori di età compresa tra i 50 e i 60 anni è stato ottenuto dalla Banca degli Occhi della Croce Rossa, Tongji Hospital (Wuhan, Cina). Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico di Tongji ed è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. 1. Isolamento Ottenere il tessuto limbus dal mezzo di conservazione corneale a medio termine e operare in condizioni asettiche su un banco di lavoro ultra-pulito….

Representative Results

Crescita di LNCLe LNC sono state isolate con successo secondo il metodo di digestione della collagenasi A (2 mg/mL) di digestione del tessuto corneosclerale, come descritto sopra (Figura 1). Coerentemente con uno studioprecedente riportato 3, dopo la digestione della collagenasi A, sono stati visualizzati al microscopio cluster simili a bruchi (Figura 2). La proporzione di cellule fusiformi aumentava gradualmente con …

Discussion

La trasparenza corneale è tipicamente mantenuta dalla disposizione e dalla distribuzione regolare di piccole fibre (25-30 nm di diametro) nello stroma corneale, che è fondamentale per una normale acuità visiva¹⁶. Ci sono 253 milioni di persone ipovedenti in tutto il mondo, 36 milioni delle quali sono cieche¹⁷. L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) considera la cecità corneale uno dei rischi più gravi per la vista umana, rappresentando il 5,1% di tutti i casi di…

Materials

4',6-Diamidino-2-Phenylindole	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
Amphotericin B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Bovine Serum Albumin	MERCK	A1933	–
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Cell Incubator	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Centrifuge system	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	–
Collagenase A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Confocal microscope	Zeiss	LSM700	–
Culture plate	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree Star	–
Flow Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	–
Fluorescence microscope	olympus	cx31
Gentamicin	Sigma	G1914	50 μg/mL
Hemocytometer	MERCK	Z359629	Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit	ThermoFisher	4374966
Inverted phase-contrast microscope	UOP	DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)	Sigma	I3146	5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	–
Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldehyde	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldehyde	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument	Applied Biosystems	Step One Plus	–
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit	Qiagen	74104	–
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stereomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade	Careforde	29500	size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20%
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40%
Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
Tween 20	MERCK	P9416	–
Ultra Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100