Isolatie en identificatie van limbale nichecellen

Summary

Hier presenteren we een protocol om de menselijke limbale nichecellen te isoleren en te identificeren.

Abstract

Hier rapporteren we een standaardprocedure voor de isolatie en identificatie van limbale nichecellen (LNC’s). Limbusweefsel verkregen uit een oogbank werd gebruikt voor de isolatie van LNC’s. Het weefsel werd onder aseptische omstandigheden in 12 stukken verdeeld en gedurende 18 uur bij 37 °C verteerd in de celkweekincubator met behulp van collagenase A om celclusters met LNC’s en limbale epitheliale voorlopercellen te verkrijgen. De celclusters werden verder verteerd gedurende 15 minuten bij 37 °C met 0,25% trypsine-EDTA om afzonderlijke cellen te verkrijgen en vervolgens gekweekt in gemodificeerd embryonaal stamcelmedium (MESCM) op een plastic oppervlak bedekt met 5% Matrigel. Cellen werden gepasseerd bij 70% samenvloeiing en LNC’s werden geïdentificeerd met behulp van immunofluorescentie, real-time kwantitatieve PCR (qPCR) en flowcytometrie. Primaire LNC’s werden geïsoleerd en meer dan 12 keer gepasseerd. De proliferatieactiviteit van LNC’s van P4 naar P6 was het hoogst. LNC’s brachten hogere stamcelmarkers tot expressie dan BMMSC’s (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR en PDGFRβ). Bovendien toonden de resultaten aan dat P4-LNC’s VIM, CD90, CD105 en PDGFRβ uniform tot expressie brachten, maar niet Pan-CK, dat kon worden gebruikt als marker voor de identificatie van LNC’s. Flowcytometrische analyse toonde aan dat ongeveer 95%, 97%, 92% en 11% van de LNC’s respectievelijk CD73, CD90, CD105 en SCF tot expressie brachten, terwijl ze 68%, 99%, 20% en 3% waren in BMMSC’s. Het standaardproces voor LNC-isolatie en -identificatie zou een betrouwbare laboratoriumbasis kunnen bieden voor het wijdverbreide gebruik van LNC’s.

Introduction

De incidentie van cornea-epitheliale stamceldeficiëntie (CESD), ook wel limbale stamceldeficiëntie (LSCD)¹ genoemd, en cornea-epitheliale regeneratie (CES) wordt steeds urgenter vanwege hoornvliesinfectie en -letsel. Als CESD niet goed wordt behandeld, kan het leiden tot blindheid waarvoor een hoornvliestransplantatie nodig is. Als gevolg hiervan wordt CES-regeneratie steeds belangrijker. Er is een groep ondersteunende cellen, limbale nichecellen (LNC’s) genaamd, die essentiële ondersteuning bieden voor de CES-functie. Limbale stromale stamcellen werden voor het eerst geïsoleerd door Polisetty et ^al.2 en geïdentificeerd door Xie et ^al.3 als LNC’s die gelokaliseerd zijn in het limbale epitheel subjacent en stroma van de limbus. LNC’s zijn de belangrijkste ondersteunende stamcel van de hoornvliesrand en, met de functie van beenmerg-afgeleide MSC (BMMSC’s), en kunnen worden geïnduceerd om zich te ontwikkelen tot hoornvliesepitheelcellen en hoornvliesstromale cellen, enz.3,4,5,6,7. Eerdere studies toonden aan dat de stamcelkwaliteiten van LNC’s primitiever zijn dan BMMSC’s⁸, die al veel in de kliniek worden gebruikt. LNC’s kunnen zelfs de volgende haalbare optie worden na MSC, vooral voor de behandeling van CESD. Als belangrijke ondersteunende cellen voor CES zijn LNC’s ook stamcellen die zijn afgeleid van de “niche”-structuur van de limbus. LNC’s kunnen een sleutelrol spelen bij de dedifferentiatie van rijpe cornea-epitheelcellen (MCEC) naar CES⁹. Studies over LNC’s zijn echter nog steeds relatief ontoereikend en er is geen consensus over de terminologie, isolatie, zuivering, identificatie en kenmerken van LNC’s. Sommige onderzoekers hebben LNC’s limbale biopsie-afgeleide stromale stamcellen¹⁰, limbale mesenchymale stamcellen 11, limbale fibroblaststamcellen 12 en limbale mesenchymale stromale cellen¹³ genoemd. Aangezien de groeikenmerken van LNC’s niet in detail zijn beschreven, en vanwege hun veelbelovende wetenschappelijke en klinische toepassingen, en in de toekomst een van de belangrijkste klinische hulpmiddelen kunnen zijn, is het noodzakelijk om de isolatie, zuivering, identificatie en kenmerken van LNC’s samen te vatten.

Volgens een eerdere studie¹⁴ zijn LNC’s voornamelijk aanwezig in het limbale epitheel subjacent en stroma van de limbus. Dit protocol omvat het behandelen van limbusweefsel met collagenase A, het verkrijgen van een cluster bestaande uit LEPC en LNC’s en het verteren ervan in afzonderlijke cellen met 0,25% trypsine-EDTA (TE). LNC’s werden vervolgens selectief gekweekt in een gemodificeerd embryonaal stamcelmedium (MESCM) om te worden gezuiverd. Het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, is eenvoudig en heeft een hoge efficiëntie bij het verkrijgen van menselijke LNC’s in grote hoeveelheden.

De gedetailleerde procedure van LNC-isolatie, kweek en identificatie is opgenomen in de video voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in LNC-onderzoek, en kan indien nodig gemakkelijk worden herhaald.

Protocol

Limbusweefsel van donoren tussen 50 en 60 jaar werd verkregen van de Rode Kruis Eye Bank, Tongji Hospital (Wuhan, China). Het protocol werd goedgekeurd door de Tongji Ethics Committee en werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. 1. Isolatie Verkrijg limbusweefsel uit het tussenliggende opslagmedium van het hoornvlies en werk onder aseptische omstandigheden op een ultraschone werkbank. Schraap en verwijder de iris en het endotheel ro…

Representative Results

Groei van LNCDe LNC’s werden met succes geïsoleerd volgens de verteringsmethode van collagenase A (2 mg/ml) vertering van corneosclerale randweefsel, zoals hierboven beschreven (figuur 1). In overeenstemming met een eerder gerapporteerde studie3 werden na de vertering van collagenase A rupsachtige clusters onder de microscoop gevisualiseerd (Figuur 2). Het aandeel spoelcellen nam geleidelijk toe met de celpassage. Sp…

Discussion

De transparantie van het hoornvlies wordt doorgaans gehandhaafd door regelmatige rangschikking en verdeling van kleine vezels (25-30 nm in diameter) in het hoornvliesstroma, wat cruciaal is voor een normale gezichtsscherpte¹⁶. Wereldwijd zijn er 253 miljoen mensen met een visuele beperking, van wie 36 miljoen blinden¹⁷. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) beschouwt hoornvliesblindheid als een van de ernstigste gevaren voor het menselijk gezichtsvermogen, goed voor 5,1% va…

Materials

4',6-Diamidino-2-Phenylindole	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
Amphotericin B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Bovine Serum Albumin	MERCK	A1933	–
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Cell Incubator	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Centrifuge system	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	–
Collagenase A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Confocal microscope	Zeiss	LSM700	–
Culture plate	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree Star	–
Flow Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	–
Fluorescence microscope	olympus	cx31
Gentamicin	Sigma	G1914	50 μg/mL
Hemocytometer	MERCK	Z359629	Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit	ThermoFisher	4374966
Inverted phase-contrast microscope	UOP	DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)	Sigma	I3146	5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	–
Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldehyde	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldehyde	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument	Applied Biosystems	Step One Plus	–
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit	Qiagen	74104	–
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stereomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade	Careforde	29500	size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20%
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40%
Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
Tween 20	MERCK	P9416	–
Ultra Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100