Isolamento e Identificação de Células de Nicho Limbal

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e identificar as células do nicho limbal humano.

Abstract

Relatamos aqui um procedimento padrão para o isolamento e identificação de células de nicho limbal (LNCs). Tecido do limbo obtido de um banco de olhos foi utilizado para o isolamento dos NCN. O tecido foi dividido em 12 pedaços sob condições assépticas e digerido por 18 h a 37 °C em incubadora de cultura celular usando colagenase A para obter aglomerados celulares com CNLS e células progenitoras epiteliais límbicas. Os aglomerados celulares foram posteriormente digeridos por 15 min a 37 °C usando tripsina-EDTA a 0,25% para obtenção de células únicas e, em seguida, cultivados em meio de células-tronco embrionárias modificado (MESCM) em uma superfície plástica revestida com Matrigel a 5%. As células foram passadas em confluência de 70%, e os LNCs foram identificados por imunofluorescência, PCR quantitativo em tempo real (qPCR) e citometria de fluxo. Os NCL primários foram isolados e passados mais de 12 vezes. A atividade proliferativa de LNCs de P4 a P6 foi a mais alta. Os LNCs expressaram marcadores de células-tronco mais elevados do que os BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR e PDGFRβ). Além disso, os resultados mostraram que os LNCs P4 expressaram uniformemente VIM, CD90, CD105 e PDGFRβ, mas não Pan-CK, o que poderia ser usado como um marcador para a identificação de LNCs. A análise por citometria de fluxo mostrou que aproximadamente 95%, 97%, 92% e 11% dos LNCs expressaram CD73, CD90, CD105 e SCF, respectivamente, enquanto foram 68%, 99%, 20% e 3% nos BMMSCs. O processo padrão para isolamento e identificação de LNC poderia fornecer uma base laboratorial confiável para o uso generalizado de LNCs.

Introduction

A incidência de deficiência de células-tronco epiteliais corneanas (CESD), também chamada de deficiência de células-tronco do limbo (LSCD)¹, e regeneração epitelial corneana (ECC) estão se tornando cada vez mais urgentes devido à infecção e lesão corneana. Se não tratada adequadamente, a CESD pode levar à cegueira que requer transplante de córnea. Como resultado, a regeneração da CES está se tornando mais significativa. Existe um grupo de células de suporte chamadas células de nicho limbal (LNCs) que fornecem suporte essencial para a função da CES. As células-tronco estromais do limbo foram primeiramente isoladas por Polisetty et ^al.2 e identificadas por Xie et ^al.3 como CNLs que estão localizadas no epitélio limbal subjacente e estroma do limbo. Os NCLs são as principais células-tronco de suporte da borda corneana e, com a função de CTMs derivadas da medula óssea (BMMSCs), e podem ser induzidos a se desenvolver em células epiteliais da córnea e células estromais da córnea, etc.3,4,5,6,7. Estudos anteriores mostraram que as qualidades de células-tronco dos LNCs são mais primitivas do que as BMMSCs⁸, que já são amplamente utilizadas na clínica. Os LNCs podem até se tornar a próxima opção viável após as CTM, especialmente para o tratamento de CESD. Como importantes células de suporte para a CES, os LNCs também são células-tronco derivadas da estrutura de “nicho” do limbo. Os NCLs podem desempenhar um papel fundamental na desdiferenciação de células epiteliais maduras da córnea (MCEC) para a CES⁹. No entanto, os estudos sobre NCL ainda são relativamente insuficientes, e não há consenso sobre a terminologia, isolamento, purificação, identificação e características dos NCL. Alguns pesquisadores denominaram células-tronco estromais derivadas de biópsia limbal 10, células-tronco mesenquimais do limbo 11, células-tronco fibroblásticas do limbo¹² e células estromais mesenquimais do limbo¹³. Como as características de crescimento dos NCN não foram descritas em detalhes, e devido às suas promissoras aplicações científicas e clínicas, e podem ser uma das ferramentas clínicas mais importantes no futuro, é necessário resumir o isolamento, purificação, identificação e características dos NCL.

De acordo com estudo^prévio14, os NCL estão presentes principalmente no epitélio limbal subjacente e no estroma do limbo. Esse protocolo inclui o tratamento do tecido do limbo com colagenase A, a obtenção de um cluster composto por LEPC e LNCs e a digestão em células únicas com tripsina-EDTA (ET) a 0,25%. Os NCL foram então cultivados seletivamente em um meio de células-tronco embrionárias modificado (MESCM) para serem purificados. O protocolo relatado neste trabalho é simples e tem alta eficiência na obtenção de NCLs humanos em grandes quantidades.

O procedimento detalhado de isolamento, cultura e identificação do LNC foi gravado no vídeo para cientistas interessados no estudo do LNC, e pode ser convenientemente repetido quando necessário.

Protocol

O tecido do limbo de doadores com idade entre 50 e 60 anos foi obtido do Banco de Olhos da Cruz Vermelha, Hospital Tongji (Wuhan, China). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Tongji e foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque. 1. Isolamento Obter tecido do limbo a partir de meio de armazenamento corneano de médio prazo intermediário e operar sob condições assépticas em uma bancada de trabalho ultralimpa. Raspar e remover a ?…

Representative Results

Crescimento do LNCOs NCL foram isolados com sucesso de acordo com o método de digestão da colagenase A (2 mg/mL) do tecido da borda corneoescleral, conforme descrito acima (Figura 1). Consistente com um estudo relatado anteriormente3, após a digestão da colagenase A, aglomerados semelhantes a lagartas foram visualizados ao microscópio (Figura 2). A proporção de células fusiformes aumentou gradualmente com a pa…

Discussion

A transparência corneana é tipicamente mantida pelo arranjo e distribuição regulares de pequenas fibras (25-30 nm de diâmetro) no estroma corneano, o que é crucial para a acuidade visual normal¹⁶. Existem 253 milhões de deficientes visuais em todo o mundo, dos quais 36 milhões são cegos¹⁷. A Organização Mundial da Saúde (OMS) considera a cegueira corneana um dos mais sérios agravos à visão humana, sendo responsável por 5,1% de toda a cegueira no mundo<sup cl…

Materials

4',6-Diamidino-2-Phenylindole	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
Amphotericin B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Bovine Serum Albumin	MERCK	A1933	–
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Cell Incubator	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Centrifuge system	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	–
Collagenase A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Confocal microscope	Zeiss	LSM700	–
Culture plate	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree Star	–
Flow Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	–
Fluorescence microscope	olympus	cx31
Gentamicin	Sigma	G1914	50 μg/mL
Hemocytometer	MERCK	Z359629	Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit	ThermoFisher	4374966
Inverted phase-contrast microscope	UOP	DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)	Sigma	I3146	5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	–
Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldehyde	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldehyde	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument	Applied Biosystems	Step One Plus	–
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit	Qiagen	74104	–
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stereomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade	Careforde	29500	size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20%
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40%
Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
Tween 20	MERCK	P9416	–
Ultra Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100