Limbal Niche 세포의 분리 및 식별
Summary
여기에서는 인간 limbal niche 세포를 분리하고 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
여기서는 변연 틈새 세포(LNC)의 분리 및 식별을 위한 표준 절차를 보고합니다. 안구 은행에서 얻은 림버스 조직을 LNC 분리에 사용했습니다. 조직을 무균 조건에서 12개의 조각으로 나누고, LNC 및 변연 상피 전구 세포가 있는 세포 클러스터를 얻기 위해 콜라겐분해효소 A를 사용하여 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 18시간 동안 절단했습니다. 세포 클러스터를 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 37°C에서 15분 동안 추가로 절단하여 단일 세포를 얻은 후 5% Matrigel로 코팅된 플라스틱 표면에 변형된 배아 줄기 세포 배지(MESCM)에서 배양했습니다. 세포는 70% 합류 시 통과되었으며 면역형광, 실시간 정량 PCR(qPCR) 및 유세포 분석을 사용하여 LNC를 식별했습니다. 1차 LNC는 12회 이상 격리 및 통과되었습니다. P4에서 P6까지 LNC의 확산 활동이 가장 높았습니다. LNC는 BMMSC보다 더 높은 줄기세포 마커를 발현했습니다(SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR, PDGFRβ). 또한, P4 LNC는 VIM, CD90, CD105 및 PDGFRβ를 균일하게 발현하는 것으로 나타났지만, LNC 식별을 위한 마커로 사용할 수 있는 Pan-CK는 발현하지 않았습니다. 유세포 분석 결과, LNC의 약 95%, 97%, 92% 및 11%가 각각 CD73, CD90, CD105 및 SCF를 발현한 반면, BMMSC에서는 68%, 99%, 20% 및 3%였습니다. LNC 분리 및 식별을 위한 표준 공정은 LNC의 광범위한 사용을 위한 신뢰할 수 있는 실험실 기반을 제공할 수 있습니다.
Introduction
각막 감염 및 손상으로 인해 각막 상피 줄기세포 결핍증(LSCD)1이라고도 하는 각막 상피 줄기세포 결핍증(CESD)과 각막 상피 재생(CES)의 발생률이 점점 더 시급해지고 있습니다. CESD를 제대로 치료하지 않으면 각막 이식이 필요한 실명으로 이어질 수 있습니다. 그 결과, CES 재생이 더욱 중요해지고 있습니다. CES 기능에 필수적인 지원을 제공하는 LNC(limbal niche cell)라고 하는 지지 세포 그룹이 있습니다. Limbal stromal stem cell은 Polisetty et al.2에 의해 처음 분리되었고, Xie et al.3에 의해 limbus의 limbal epithelium subjacent 및 stroma에 국한된 LNC로 확인되었습니다. LNC는 각막 가장자리의 핵심 지원 줄기세포이며 골수 유래 MSC(BMMSC)의 기능을 가지고 있으며 각막 상피 세포 및 각막 기질 세포 등으로 발달하도록 유도될 수 있습니다.3,4,5,6,7. 이전 연구에 따르면 LNC의 줄기세포 품질은 이미 임상에서 널리 사용되고 있는 BMMSCs8보다 더 원시적입니다. LNC는 특히 CESD 치료에 MSC 다음으로 실행 가능한 옵션이 될 수도 있습니다. CES의 중요한 지원 세포인 LNC는 림버스의 “틈새” 구조에서 파생된 줄기 세포이기도 합니다. LNC는 성숙한 각막 상피 세포(MCEC)를 CES9에 대한 역분화에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 그러나 LNC에 대한 연구는 여전히 상대적으로 미흡하며, LNC의 용어, 분리, 정제, 식별 및 특성에 대한 합의가 이루어지지 않고 있다. 일부 연구자들은 LNC를 윤부 생검 유래 기질 줄기 세포(limbal mesenchymal stem cells)10, 윤부 중간엽 줄기 세포(limbal mesenchymal stem cells)11, 윤부 섬유아세포 줄기 세포(limbal fibroblast stem cells) 12, 그리고 윤부 중간엽 기질 세포(limbal mesenchymal stromal cells)13로 명명했다. LNC의 성장 특성이 상세히 기술되지 않았고, 유망한 과학 및 임상 응용이 가능하고, 향후 가장 중요한 임상 도구 중 하나가 될 수 있기 때문에 LNC의 분리, 정제, 식별 및 특성을 요약할 필요가 있습니다.
선행 연구14에 따르면, LNC는 주로 변연 상피(limbal epithelium subjacent)와 변연(limbus)의 기질(stroma)에 존재한다. 이 프로토콜에는 콜라겐분해효소 A를 사용하여 변연 조직을 처리하고, LEPC 및 LNC로 구성된 클러스터를 얻고, 0.25% 트립신-EDTA(TE)를 사용하여 단일 세포로 분해하는 것이 포함됩니다. 그런 다음 LNC를 변형된 배아 줄기 세포 배지(MESCM)에서 선택적으로 배양하여 정제했습니다. 이 논문에 보고된 프로토콜은 간단하며 인간 LNC를 대량으로 얻는 데 높은 효율성을 가지고 있습니다.
LNC 연구에 관심이 있는 과학자들을 위해 LNC 분리, 배양, 동정에 대한 자세한 절차를 영상에 담았으며, 필요할 때 편리하게 반복할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
각막 투명도는 일반적으로 각막 기질에 작은 섬유(직경 25-30nm)의 규칙적인 배열과 분포에 의해 유지되며, 이는 정상 시력에 매우 중요하다16. 전 세계적으로 2억 5,300만 명의 시각 장애인이 있으며, 그 중 3,600만 명이 시각 장애인입니다17. 세계보건기구(WHO)는 각막 실명을 인간의 시력에 가장 심각한 위험 중 하나로 간주하며, 전 세계 실명의 5.1%를 차지합니다<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업을 지도해 준 Wei Wang, Lingjuan Xu, Rong Liu, 일부 자료를 제공한 Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You, Li Guigang, 원고를 작성해 준 Guanyu Su, 원고를 수정해 준 Xiao Zhou, Yihong Xiong, Huatao Xie, 완전한 지도를 해준 Guigang Li에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 82070936, 81470606, 81570819), 후베이 성 건강 및 가족 계획 과학 연구 프로젝트 (No. WJ2017M073), 퉁지병원 10대 중개의학 연구 프로젝트(No.2016ZHYX20), 우한시 젊은 의료 개척자 양성 프로젝트(No.2015whzqnyxggrc10), 글로벌 인재 모집 프로그램(G2022154028L), 2022년 후베이성 국가위생건강위원회 프로젝트(WJ2021ZH0005), 2022년 후베이성 재무부 주제 건설 재단(42000022815T000000102)
Materials
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | – |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | – |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | – |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | – |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | – |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | – |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | – |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | – |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | – |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
References
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