Isolering og identifisering av limbale nisjeceller

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å isolere og identifisere de menneskelige limbale nisjecellene.

Abstract

Her rapporterer vi en standard prosedyre for isolering og identifisering av limbale nisjeceller (LNC). Limbusvev hentet fra en øyebank ble brukt til LNCs isolasjon. Vevet ble delt inn i 12 stykker under aseptiske forhold og fordøyd i 18 timer ved 37 °C i cellekulturinkubatoren ved bruk av kollagenase A for å oppnå celleklynger med LNC og limbale epiteliale stamceller. Celleklyngene ble videre fordøyd i 15 minutter ved 37 °C ved bruk av 0,25 % trypsin-EDTA for å oppnå enkeltceller og deretter dyrket i modifisert embryonalt stamcellemedium (MESCM) på en plastoverflate belagt med 5 % Matrigel. Cellene ble passert ved 70% konfluens, og LNCs ble identifisert ved hjelp av immunfluorescens, sanntids kvantitativ PCR (qPCR) og flowcytometri. Primære LNCer ble isolert og passert mer enn 12 ganger. Spredningsaktiviteten av LNCs fra P4 til P6 var den høyeste. LNC uttrykte høyere stamcellemarkører enn BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR og PDGFRβ). Videre viste resultatene at P4 LNC uttrykte VIM, CD90, CD105 og PDGFRβ, men ikke Pan-CK, som kunne brukes som en markør for identifisering av LNC. Flowcytometrisk analyse viste at ca. 95 %, 97 %, 92 % og 11 % av LNC uttrykte henholdsvis CD73, CD90, CD105 og SCF, mens de var 68 %, 99 %, 20 % og 3 % i BMMSC. Standardprosessen for LNC-isolering og identifisering kan gi et pålitelig laboratoriegrunnlag for utstrakt bruk av LNC.

Introduction

Forekomsten av hornhinneepitelial stamcellemangel (CESD), også kalt limbal stamcellemangel (LSCD)¹, og hornhinneepitelial regenerering (CES) blir mer og mer presserende på grunn av hornhinneinfeksjon og skade. Hvis ikke riktig behandlet, kan CESD føre til blindhet som krever hornhinnetransplantasjon. Som et resultat blir CES-regenerering stadig viktigere. Det er en gruppe støttende celler kalt limbale nisjeceller (LNC) som gir viktig støtte til CES-funksjonen. Limbale stromale stamceller ble først isolert av Polisetty et ^al.2 og identifisert av Xie et ^al.3 som LNCer som er lokalisert i limbalepitelet subjacent og stroma i limbus. LNC er den viktigste støttende stamcellen i hornhinnen, og med funksjonen av benmargsavledet MSC (BMMSC), og kan induseres til å utvikle seg til hornhinneepitelceller og hornhinnestromale celler, etc.3,4,5,6,7. Tidligere studier viste at stamcellekvalitetene til LNC er mer primitive enn BMMSC⁸, som allerede er mye brukt i klinikken. LNC kan til og med bli det neste levedyktige alternativet etter MSC, spesielt for behandling av CESD. Som viktige støtteceller for CES er LNC også stamceller avledet fra “nisje” -strukturen i limbus. LNC kan spille en nøkkelrolle i dedifferensiering av modne hornhinneepitelceller (MCEC) til CES⁹. Imidlertid er studier på LNC fortsatt relativt utilstrekkelige, og det er ingen konsensus om terminologi, isolasjon, rensing, identifikasjon og egenskaper ved LNC. Noen forskere har kalt LNCs limbale biopsi-avledede stromale stamceller 10, limbale mesenkymale stamceller 11, limbale fibroblast stamceller¹² og limbale mesenkymale stromale celler¹³. Siden vekstegenskapene til LNC ikke er beskrevet i detalj, og på grunn av deres lovende vitenskapelige og kliniske anvendelser, og kan være et av de viktigste kliniske verktøyene i fremtiden, er det nødvendig å oppsummere isolasjon, rensing, identifikasjon og egenskaper av LNC.

Ifølge en tidligere studie¹⁴ er LNC hovedsakelig tilstede ved limbalepitelet subjacent og stroma i limbus. Denne protokollen inkluderer behandling av limbusvev ved bruk av kollagenase A, oppnå en klynge bestående av LEPC og LNC, og fordøye den i enkeltceller med 0,25% trypsin-EDTA (TE). LNC ble deretter selektivt dyrket i et modifisert embryonalt stamcellemedium (MESCM) for å bli renset. Protokollen rapportert i denne artikkelen er enkel og har høy effektivitet i å skaffe menneskelige LNCs i store mengder.

Den detaljerte prosedyren for LNC-isolasjon, kultur og identifikasjon ble registrert i videoen for forskere som er interessert i LNC-studien, og det kan enkelt gjentas når det er nødvendig.

Protocol

Limbusvev fra givere i alderen mellom 50 og 60 år ble hentet fra Røde Kors Eye Bank, Tongji Hospital (Wuhan, Kina). Protokollen ble godkjent av Tongjis etiske komité og ble gjennomført i samsvar med Helsinkideklarasjonen. 1. Isolasjon Hent limbusvev fra mellomliggende hornhinnelagringsmedium og bruk under aseptiske forhold på en ultraren arbeidsbenk. Skrap og fjern iris og endotel rundt hornhinnen ved hjelp av et sterilt kirurgisk rundt blad. <li…

Representative Results

Vekst av LNCLNCene ble vellykket isolert i henhold til metoden for fordøyelse av kollagenase A (2 mg/ml) fordøyelse av corneoscleralt rimvev, som beskrevet ovenfor (figur 1). I samsvar med en tidligere rapportert studie3, etter kollagenase A-fordøyelsen, ble larvelignende klynger visualisert under mikroskopet (figur 2). Andelen spindelceller økte gradvis med cellepassasjen. Spindelformede celler kan vokse på bela…

Discussion

Korneal gjennomsiktighet opprettholdes vanligvis ved regelmessig arrangement og distribusjon av små fibre (25-30 nm i diameter) i hornhinnen stroma, noe som er avgjørende for normal synsstyrke¹⁶. Det er 253 millioner synshemmede over hele verden, hvorav 36 millioner er blinde¹⁷. Verdens helseorganisasjon (WHO) anser hornhindeblindhet som en av de alvorligste farene for menneskelig syn, og står for 5.1% av all blindhet over hele verden¹⁶. Defekt i …

Materials

4',6-Diamidino-2-Phenylindole	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
Amphotericin B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Bovine Serum Albumin	MERCK	A1933	–
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Cell Incubator	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Centrifuge system	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	–
Collagenase A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Confocal microscope	Zeiss	LSM700	–
Culture plate	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree Star	–
Flow Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	–
Fluorescence microscope	olympus	cx31
Gentamicin	Sigma	G1914	50 μg/mL
Hemocytometer	MERCK	Z359629	Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit	ThermoFisher	4374966
Inverted phase-contrast microscope	UOP	DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)	Sigma	I3146	5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	–
Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldehyde	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldehyde	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument	Applied Biosystems	Step One Plus	–
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit	Qiagen	74104	–
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stereomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade	Careforde	29500	size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20%
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40%
Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
Tween 20	MERCK	P9416	–
Ultra Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100