Limbal Niş Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması
Summary
Burada, insan limbal niş hücrelerini izole etmek ve tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Burada limbal niş hücrelerin (LNC’ler) izolasyonu ve tanımlanması için standart bir prosedür sunuyoruz. LNC’lerin izolasyonu için göz bankasından elde edilen limbus dokusu kullanıldı. Doku, aseptik koşullar altında 12 parçaya bölündü ve LNC’ler ve limbal epitelyal progenitör hücreler ile hücre kümeleri elde etmek için kollajenaz A kullanılarak hücre kültürü inkübatöründe 37 °C’de 18 saat sindirildi. Hücre kümeleri, tek hücreler elde etmek için% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak 37 ° C’de 15 dakika boyunca sindirildi ve daha sonra% 5 Matrigel ile kaplanmış plastik bir yüzey üzerinde modifiye embriyonik kök hücre ortamında (MESCM) kültürlendi. Hücreler %70 birleşme üzerine geçirildi ve LNC’ler immünofloresan, gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) ve akış sitometrisi kullanılarak tanımlandı. Birincil LNC’ler izole edildi ve 12 defadan fazla geçti. LNC’lerin P4’ten P6’ya proliferasyon aktivitesi en yüksekti. LNC’ler, BMMSC’lerden (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR ve PDGFRβ) daha yüksek kök hücre belirteçleri ifade etti. Ayrıca, sonuçlar, P4 LNC’lerin VIM, CD90, CD105 ve PDGFRβ’yi tekdüze olarak eksprese ettiğini, ancak LNC’lerin tanımlanması için bir belirteç olarak kullanılabilecek Pan-CK’yi eksprese etmediğini gösterdi. Akış sitometrik analizi, LNC’lerin yaklaşık %95, %97, %92 ve %11’inin sırasıyla CD73, CD90, CD105 ve SCF eksprese ettiğini, BMMSC’lerde ise %68, %99, %20 ve %3 olduğunu gösterdi. LNC izolasyonu ve tanımlanması için standart süreç, LNC’lerin yaygın kullanımı için güvenilir bir laboratuvar temeli sağlayabilir.
Introduction
Limbal kök hücre eksikliği (LSCD)1 olarak da adlandırılan kornea epitelyal kök hücre eksikliği (CESD) ve kornea epitel rejenerasyonu (CES) insidansı, kornea enfeksiyonu ve yaralanması nedeniyle giderek daha acil hale gelmektedir. Uygun şekilde tedavi edilmezse, CESD kornea nakli gerektiren körlüğe yol açabilir. Sonuç olarak, CES rejenerasyonu daha önemli hale geliyor. CES işlevi için gerekli desteği sağlayan limbal niş hücreler (LNC’ler) adı verilen bir grup destekleyici hücre vardır. Limbal stromal kök hücreler ilk olarak Polisetty ve ark.2 tarafından izole edilmiş ve Xie ve ark.3 tarafından limbal epitel, subjacent ve limbusun stromasında lokalize olan LNC’ler olarak tanımlanmıştır. LNC’ler, kornea kenarının anahtar destekleyici kök hücresidir ve kemik iliği kaynaklı MSC’nin (BMMSC’ler) işlevi ile kornea epitel hücrelerine ve kornea stromal hücrelerine vb. dönüşmeye teşvik edilebilir.3,4,5,6,7. Önceki çalışmalar, LNC’lerin kök hücre özelliklerinin, klinikte zaten yaygın olarak kullanılan BMMSC8’den daha ilkel olduğunu göstermiştir. LNC’ler, özellikle CESD tedavisi için MSC’den sonra bir sonraki uygun seçenek haline gelebilir. CES için önemli destekleyici hücreler olan LNC’ler aynı zamanda limbusun “niş” yapısından türetilen kök hücrelerdir. LNC’ler, olgun kornea epitel hücrelerinin (MCEC) CES9’a farklılaşmasında önemli bir rol oynayabilir. Bununla birlikte, LNC’ler ile ilgili çalışmalar hala nispeten yetersizdir ve LNC’lerin terminolojisi, izolasyonu, saflaştırılması, tanımlanması ve özellikleri konusunda bir fikir birliği yoktur. Bazı araştırmacılar LNC’leri limbal biyopsiden türetilmiş stromal kök hücreler10, limbal mezenkimal kök hücreler11, limbal fibroblast kök hücreler12 ve limbal mezenkimal stromal hücreler13 olarak adlandırmışlardır. LNC’lerin büyüme özellikleri ayrıntılı olarak tanımlanmadığından, umut verici bilimsel ve klinik uygulamaları nedeniyle ve gelecekte en önemli klinik araçlardan biri olabileceğinden, LNC’lerin izolasyonu, saflaştırılması, tanımlanması ve özelliklerini özetlemek gerekir.
Daha önceki bir çalışmayagöre 14, LNC’ler esas olarak limbal epitelin subjacent ve limbusun stromasında bulunur. Bu protokol, limbus dokusunun kollajenaz A kullanılarak işlenmesini, LEPC ve LNC’lerden oluşan bir küme elde edilmesini ve %0.25 tripsin-EDTA (TE) ile tek hücrelere sindirilmesini içerir. LNC’ler daha sonra saflaştırılmak üzere modifiye edilmiş bir embriyonik kök hücre ortamında (MESCM) seçici olarak kültürlendi. Bu yazıda bildirilen protokol basittir ve büyük miktarlarda insan LNC’lerinin elde edilmesinde yüksek verimliliğe sahiptir.
LNC izolasyonu, kültürü ve tanımlanmasının ayrıntılı prosedürü, LNC çalışmasıyla ilgilenen bilim adamları için videoya kaydedildi ve gerektiğinde rahatlıkla tekrarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kornea şeffaflığı tipik olarak, normal görme keskinliği için çok önemli olan kornea stromasındaki küçük liflerin (25-30 nm çapında) düzenli olarak düzenlenmesi ve dağıtılmasıyla sağlanır16. Dünyada 36 milyonu kör olmak üzere 253 milyon görme engelliinsan var 17. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), kornea körlüğünü insan görme duyusuna yönelik en ciddi tehlikelerden biri olarak kabul etmektedir ve dünya çapındaki tüm körlüklerin %5,1’ini …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmayla ilgili rehberlik için Wei Wang, Lingjuan Xu ve Rong Liu’ya, materyalin bir kısmını sağladıkları için Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You ve Li Guigang’a, el yazmasını yazdığı için Guanyu Su’ya, el yazmasını düzelttiği için Xiao Zhou, Yihong Xiong ve Huatao Xie’ye ve tam rehberliği için Guigang Li’ye teşekkürler. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82070936, 81470606, 81570819), Hubei Eyaleti sağlık ve aile planlaması bilimsel araştırma projesi (No. WJ2017M073), Tongji Hastanesi’nden İlk On Translasyonel Tıbbi Araştırma Projesi (No.2016ZHYX20), Wuhan Şehrindeki Genç Tıp Öncülerinin Eğitim Projesi (No.2015whzqnyxggrc10), Küresel Yetenekler İşe Alım Programı (G2022154028L), 2022’de Hubei Eyaleti Ulusal Sağlık Komisyonu projesi(WJ2021ZH0005) ve 2022’de Hubei Finans Departmanının Konu İnşaat Vakfı(42000022815T000000102)
Materials
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | – |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | – |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | – |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | – |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | – |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | – |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | – |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | – |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | – |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
References
- Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
- Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
- Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
- Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
- Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
- Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
- Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16 (2020).
- Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1 (2022).
- Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172 (2014).
- Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
- Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
- Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471 (2022).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
- Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566 (2018).
- Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. Regenerative therapy for the cornea. Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011 (2022).
- Pineda, R. . World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , 299-305 (2020).
- Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441 (2022).
- Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562 (2022).
- Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
- Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
- O’Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265 (2020).
- Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
- Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115 (2017).
- Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
- Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
- Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
- Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
- González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
- Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
- Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. Stem cells in the limbal stroma. Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).
- Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
- Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).
