Summary
在这里，我们提出了一种将处于多个成熟阶段的人脑类器官移植到鸡绒毛膜尿囊膜 （CAM） 中的方案。大脑类器官是按照无指导的标准化协议生长的。
Abstract
将类器官移植到模型动物的血管化组织中，例如免疫缺陷小鼠或鸡胚绒毛膜尿囊膜 （CAM），已被证明对新生血管形成建模有效。CAM是一种富含血管化的胚外膜，其免疫反应性有限，因此成为人源性细胞移植的优良宿主模型。
本文描述了将多个成熟阶段分化的人脑类器官移植到CAM中的策略。大脑类器官的细胞组成随时间而变化，反映了人类大脑发育的里程碑。我们将相关成熟阶段的脑类器官移植到胚胎日（E）7鸡胚胎的CAM中：神经上皮扩增（18 DIV），早期神经发生（60 DIV）和早期胶质生成（180 DIV）。5 天后收获移植的脑类器官并分析其组织学特征。
在移植的类器官中未检测到新生血管形成的组织学迹象或与移植物相邻的异常血管。此外，在移植类器官的细胞组成中观察到显着变化，即胶质纤维酸性蛋白阳性反应性星形胶质细胞的数量增加。然而，细胞结构的变化取决于类器官成熟阶段。总而言之，这些结果表明，大脑类器官可以在CAM中生长，并且它们根据移植时的成熟阶段显示出细胞结构的差异。
Introduction
人脑类器官是一种新兴技术，使我们能够在体外概括人脑的早期发育1,2,3。然而，该模型的主要局限性之一是缺乏血管化，血管化不仅在大脑稳态中起着不可或缺的作用，而且在大脑发育中也起着不可或缺的作用4.除了输送氧气和营养物质外，越来越多的证据表明，大脑的血管系统在发育过程中调节神经分化、迁移和突触发生 5,6。因此，迫切需要建立可靠的模型，为大脑类器官提供缺失的血管信号和结构，从而增强人脑类器官生成7的复杂性。
在所提出的血管化方法中，可以考虑两种主要的流线型：类器官移植到活生物体中，以及共培养内皮细胞和神经细胞的纯体外技术8,9,10,11,12。小鼠脑移植既昂贵又耗时，这使得其他技术与更简单的模型相关。雏鸡绒毛膜尿囊膜 （CAM） 测定已广泛用于研究血管生成 13,14,15。在过去的十年中，几个小组成功地将不同类型的类器官（包括肾脏16,17、心脏18 和肿瘤类器官19,20）移植到 CAM 中。然而，人们对将人脑类器官移植到 CAM 中的功效、毒性/排斥反应、生理效应和方法知之甚少。另一个有趣但尚未探索的方面是在CAM和类器官星形胶质细胞界面之间形成嵌合血脑屏障（BBB）。先前的开创性工作表明，通过移植星形胶质细胞和星形胶质细胞条件培养基在CAM中产生BBB的假定可行性21,22,23。然而，成熟的星形胶质细胞似乎无法达到这个24,25。因此，星形胶质细胞诱导的BBB形成仍然存在争议，移植人脑类器官将使我们能够阐明这一争议。
这篇视频文章描述了一种 将卵 内人脑类器官移植到 CAM 中的方案，该方案可促进生长、改善和血管化，从而产生包含组织学相容的 BBB 元件的类器官。在这里，我们提出了一个确保鸡胚胎存活的方案，并报告了CAM维持大脑类器官生长的允许性。
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Protocol
白角鸡（Gallus gallus）胚胎按照美国国家研究委员会生命科学委员会实验动物资源研究所的实验动物护理和使用指南进行处理，实验由巴塞罗那大学实验动物护理和使用委员会批准。
1.非引导脑类器官制备
- 在室温（RT）下预热的mTESR1中维持H9人胚胎干细胞（hESCs），在6孔板中溶解在DMEM（1：40）中的溶解在5%CO2 培养箱中，溶解在DMEM（1：40）中。
注意：基质胶必须保存在冰中，直到用作涂层以防止其聚合。 - 按照无指导的大脑协议 2 生成大脑类器官。
- 使用500μL细胞解离溶液解离H9 hESCs，并在37°C下孵育3-5分钟。 重悬于含有 ROCK 抑制剂 Y27632（终浓度 50 μM）的 mTESR1 中，并在低粘附预处理的 96 孔板中每孔接种 9,000 个细胞。
- 一旦类器官聚集在含有ROCK抑制剂Y27632（终浓度50μM）的mTESR1中，将它们转移到诱导培养基中5-6天。
- 遵循非引导脑类器官方案26，在 ~ 天 4-5 时将类器官转移到神经诱导培养基中。
- 一旦它们获得大小和神经上皮环，将它们转移到冰冷的基质胶滴剂中。基质胶聚合后，将类器官转移到装有 5 mL 预热成熟培养基的 5 cm 低粘附培养皿中。
- 4天后，将大脑类器官置于眼眶搅动下。
- 在嫁接前立即收集类器官以在新鲜的DPBS中收获。
2.卵子维持、发育激活、蛋壳穿刺
- 将受精卵（第0天）储存在18°C的培养箱中直至使用。
注意：在此温度下，它们不会发育，而是保持在同一成熟阶段。 - 当需要使用时，将它们在38°C和60%相对湿度下孵育，并以45°C的角度轻柔地旋转。
- 在第 1 天，用 70% 乙醇清洁蛋壳表面，然后用纸巾擦干以消毒。
- 将手术纸粘性绷带（以下简称“绷带”）放在鸡蛋顶部，覆盖鸡蛋的气室。
注意： 这将防止蛋壳中的灰尘落入卡住的凸轮中。 - 用无菌针 21 G x 11/2'' 轻轻刺穿蛋壳，进行气室穿孔穿刺，以下简称气室孔 （ACH）。打开鸡蛋上端的 ACH，以免干扰 CAM，此时 CAM 与蛋壳分离。
- 要找到刺穿 ACH 的最佳位置，请使用灯确定鸡蛋上端最薄的蛋壳表面。直射光束透射指示最佳钻孔位置。
- 用新的绷带覆盖ACH以保护胚胎免受外部环境的影响，然后将卵子放回孵化器中。
- 从这一刻起，停止在孵化器中旋转，并将鸡蛋保持在垂直位置，窗口在顶部。
注意：这将促进胚胎的发育，并且CAM在顶部可用，胚胎和蛋壳之间有一个空气室，允许随后的嫁接。 - 从第 1 天到第 4 天打开 ACH。活力在第 4 天（移植日前 3 天）增加。
3.脑类器官移植
- 在第 7 天进行移植，此时 CAM 发育良好且血管化，将卵子覆盖整个胚胎。
- 取下绷带，用 70% 乙醇擦拭蛋壳表面以对蛋壳进行消毒，然后小心地将 ACH 拓宽到移植窗口中。
- 在最终移植窗口之外放置一个新的、更大的绷带覆盖延伸部分，以避免蛋壳碎片在扩大移植窗口时落入 CAM。
注意：需要这个更大的窗口来选择最佳嫁接位置和后续嫁接。 - 通过轻轻刺穿蛋壳来扩大嫁接窗口，直到窗口达到约 2 厘米的直径。用镊子轻轻去除蛋壳窗口的边缘，直到窗口放大。轻轻剥下绷带，去除剩余的灰尘和蛋壳碎片，这些灰尘和蛋壳碎片将保持附着在绷带上。
- 使用P200自动移液器放置类器官。用无菌和锋利的剪刀剪断尖端，以根据类器官的大小扩大开口，并防止损坏类器官或使用宽规格转移无菌尖端。将类器官收集在最大体积为50μL的PBS中，并将其直接转移到与胚胎位置相反的CAM中。
- 确保移植物的位置远离卵黄，以避免其在收获过程中破裂，最好将其放置在血管附近。
- 将类器官放在CAM上后，在类器官周围滴一滴7μL基质胶。
注意：这将防止类器官在膜周围移动。 - 使用一小块适合窗户确切尺寸的封口膜关闭窗户，并用粘性绷带将其固定在外壳上。
注意： 重要的是要用封口膜完全覆盖窗户，以避免胚胎变干，同时允许气体交换。正确划定窗口覆盖范围的延伸，避免超过窗口，因为它可能阻碍正确胚胎发育所需的气体交换27.
4. 移植类器官收获
- 在鸡发育的第 12 天收获嫁接的类器官和周围的 CAM，对应于 38 Hamburger 和 Hamilton 发育阶段 （HH38）28，嫁接后 5 天。在这个阶段，CAM与成熟的脉管系统完全分化，而羽毛胚芽覆盖了翅膀和胚胎的上眼睑。
- 取下粘性绷带后，进一步扩大窗口，以便于使用剪刀和细镊子采集样品。
- 如果需要，在双眼解剖显微镜的帮助下可视化类器官，然后用 4% 多聚甲醛 （PFA） 进行 2 分钟的预固定步骤，以帮助类器官和 CAM 收获。
- 收集含有类器官的 1.5 cm2 CAM 部分。
- 样品固定
- 用1x PBS洗涤样品，并在4°C下用4%PFA（PBS，pH 7.2）固定30分钟。 然后，在PBS中洗涤样品3×5分钟。
- 将样品储存在4°C的PBS中，或直接在4°C下将其冷冻保护在30%蔗糖 - PBS中过夜。
- 冷冻保护后，将样品嵌入最佳切割温度化合物（OCT）中，并将其储存在-20°C直至切片。使用低温恒温器切割20μm厚的组织切片，并将它们收集在木二甲苯化载玻片上。将载玻片储存在-20°C，直到它们用于染色。
5. 免疫荧光
- 用含有0.1%Triton X-100（PBS-T）的PBS溶液在室温（RT）下10分钟从切片中除去OCT.。
- 用封闭溶液（BS）和2%BSA，3%驴血清PBS-T 0.01%溶液在室温下处理1小时。
- 在BS中稀释选定的一抗（参见 材料表），并将样品在4°C下孵育过夜。
- 第二天，在室温下用1x PBS洗涤样品3×10分钟。
- 在BS中稀释二抗，并在室温下孵育2小时（参见 材料表）。
- 将样品与4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）一起孵育10分钟，以在室温下标记细胞核，在PBS-T中以1：1,000稀释度稀释。
- 用安装介质安装载玻片，并用玻璃盖玻片盖住。
- 使用宽视场荧光显微镜以 2.5、10、20 和 40 倍拍摄所有图像。
- 将切片储存在4°C。
6. 苏木精和伊红（H&E）染色
注意：为了证明移植有效，请进行H&E染色。
- 用 PBS-T 0.1% 在室温下去除 OCT 10 分钟。
- 在抽油烟机中进行连续脱水，如下所示：蒸馏水 （DW） 10 分钟，苏木精 45 秒，DW 1 分钟，PBS 20 秒，70% EtOH 2 x 30 秒，80% EtOH 2 x 30 秒，96% EtOH 2 x 30 秒，曙红 30 秒，96% EtOH 2 x 15 秒， 100%乙醇溶液2×15秒，木二甲酚-100%乙醇溶液1分钟，木二甲酚溶液1分钟（新鲜）溶液1分钟。
- 用二甲苯基封装介质安装玻璃盖玻片。
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Representative Results
选择移植的胚胎成熟时间表
当受精卵在38°C和60%相对湿度下孵化时，实验从D0开始。绒毛膜尿囊膜 （CAM） 是一种高度血管化的胚外膜，在卵子孵化后发育。它是由尿囊和绒毛膜融合而成的。在D1处，孵育24小时后，刺穿气室以防止CAM附着在内壳膜上。与后期穿刺 （D4） 相比，在 D1 处刺穿气室可提高气室的质量。CAM继续生长，直到D12，当它包裹整个卵子内容物并牢固地粘附在内壳膜上时（图1）。在 D7 处制作的孔被放大以方便样品收集。当CAM达到成熟并覆盖卵黄囊和胚胎表面时，D7是移植的最佳时间。在这个阶段，气室孔被扩大，类器官在自动移液器的帮助下被转移到CAM中。
脑类器官移植
在体外大脑类器官的固有成熟过程中，它们的细胞组成从神经祖细胞转变为成熟的神经元和神经胶质细胞。神经血管系统和神经发生是脊椎动物中相互混合和相互依赖的发育过程，导致这种串扰的信号传导高度依赖于神经对应物的成熟阶段29。神经祖细胞是发育中大脑中促血管生成因子的主要来源29,30。相反，神经元和星形胶质细胞通过分泌血管内皮生长因子31,32支持成熟期和成年期的新血管生成。大脑细胞结构的这些变化也反映在大脑类器官中，可能导致对CAM移植的整合和反应的差异变化，这取决于大脑类器官的成熟阶段。因此，我们在体外分化第 13 天 （DIV） 移植脑类器官，此时神经上皮细胞和放射状胶质细胞扩张;在 DIV 37，在神经发生开始时;在 DIV 60 时，当神经发生稳健且不同身份的神经元最终分化时;在DIV 120，当大量成熟的神经元填充类器官时，产生发达的神经元网络和星体发生也很普遍。
在所有情况下，样品都是在 卵内 （DIO） 孵育 5 天后收集的。为了避免由于脑类器官的批次效应而产生的偏差，移植和非移植类器官之间的所有比较都在同一批次中以成对方式进行。类器官来自每个时间点至少两个独立实验和总共六个独立分化。在每个嫁接实验中并行进行多个成熟阶段的嫁接。移植后，类器官继续在CAM血管附近进行成熟过程，没有任何血管浸润到类器官中的证据（图2）。
移植后的类器官存活率从最小的80%到移植后5天后成熟类器官的存活率下降到~66%，这表明允许性和类器官移植的可塑性可能会随着时间的推移而改变（表1）。类器官活力由 H&E 染色中 pyknotic 核的存在决定。移植和未移植对照类器官之间的 pyknotic 核数量相似（图 3），表明 CAM 允许在移植时维持活类器官。此外，在CAM中没有检测到组织学或血源释放，胚胎仍然活着，这表明移植程序和类器官都不会破坏CAM的完整性或显着影响胚胎发育。
移植脑类器官中的细胞组成
非引导脑类器官具有明显的类器官间和类器官内细胞变异性。然而，它们主要是神经性的，以顺序的速度产生祖细胞、神经元和星形胶质细胞的波 2,26。接下来，我们评估了移植是否会改变大脑类器官的神经组成。在神经元存在的情况下，较年轻的类器官（13 DIV + 5 DIO：18 天）与对照非移植类器官没有差异 （TUBB3+）。在后期成熟阶段（60 DIV +5 DIO：65 天和 120 DIV + 5 DIO：125 天），与未移植类器官相比，神经元 （TUBB3+） 的比例显着降低（图 4）。在成熟 60 DIV 的非嫁接类器官中，神经元广泛分布在类器官周围。
值得注意的是，与在非移植对照中观察到的星形胶质细胞相比，胶质纤维酸性蛋白阳性 （GFAP+） 星形胶质细胞的数量和定位有所增加。此外，这些GFAP+ 星形胶质细胞在类器官的外侧获得了意想不到的定位。在 18 个 DIV 中，游离类器官（非嫁接），可见星形胶质细胞很少，无法检测到结构分布;相反，它们似乎均匀地分布在整个类器官中（图3）。
图 1：类器官移植的 CAM 检测设置时间表。 （A）手术纸粘性绷带涂在鸡蛋上。（B） 用针在粘性绷带上在外壳上打一个孔。（C）打开蛋壳的窗口，从顶部观察，准备移植（D）人脑类器官（第60天）。比例尺 = 100 μm。 （E） 在卵 孵化 5 天后在 CAM 上可视化移植的类器官。（F） 从第 0 天到第 120 天的大脑类器官发育的标志。箭头表示类器官的位置。缩写：CAM=绒毛膜尿囊膜。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：苏木精和绒毛膜尿囊中移植类器官的伊红染色。 （A） 13 个 DIV + 5 个 DIO 类器官;（B） 37 个 DIV + 5 个 DIO 类器官;（C） 60 个 DIV + 5 个 DIO 类器官;（D） 120 个 DIV + 5 个 DIO 类器官;红色方块标记类器官。比例尺 = 500 μm。缩写：DIV = 体外天;DIO = 卵天。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：类器官在不同发育阶段的免疫细胞化学。 GFAP用于染色，DAPI用于细胞核。比例尺 = 100 μm。 （A，B） 相同的 13 个 DIV + 5 个 DIO 移植类器官的图像，其中在类器官边缘周围可以看到星形胶质细胞。（C） 18 个无 DIV 类器官的图像，其中星形胶质细胞几乎不可见。游离类器官和嫁接类器官之间的区别非常明显。（D，E）37 个 DIV + 5 个 DIO 移植类器官的图像，其中几乎看不到星形胶质细胞。（F） 42 个无 DIV 类器官的图像。黄色箭头表示星形胶质细胞的位置。缩写：DIV = 体外天;DIO = 卵天;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;GFAP = 胶质纤维酸性蛋白。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：120 个 DIV 类器官的免疫细胞化学。 TUBB3 用于神经元染色，DAPI 用于细胞核。比例尺 = 100 μm;图像是以20倍拍摄的。 （A） 一个120 DIV +5 DIO的移植类器官，可以看到很少的神经元。 （B） 一个 125 DIV 的自由类器官，具有大量神经元。星号表示类器官的位置，而虚线表示类器官和 CAM 之间的界限（通过组织学分析确定）。缩写：DIV = 体外天;DIO = 卵天;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;CAM = 绒毛膜尿囊膜。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 类器官 | 13 分区 | 37 分 | 60 分 | 120 分 |
| 活 着 | 6 (75%) | 10 (83%) | 6 (66%) | 6 (66%) |
| 死 | 2 (25%) | 2 (16%) | 3 (34%) | 3 (34%) |
表1：CAM类器官移植后的胚胎存活率。 缩写：DIV = 体外天;DIO = 卵天;CAM = 绒毛膜尿囊膜。
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Discussion
在这项研究中，我们描述了一个包含许多关键步骤的详细方案，这些步骤在移植时提供人脑类器官的有利生长和发育，而不会干扰鸡胚胎的存活。我们建议在孵育24小时（第1天）后使用无菌针刺穿鸡蛋的气室。此外，我们还尝试在第 4 天进行穿刺（在用光检查蛋壳以测试脉管系统的发育以确保我们只使用健康的胚胎后）。然而，由于CAM血管靠近蛋壳，这导致胚胎活力下降。应该注意的是，施加过大的力会导致蛋壳破裂，从而损坏 CAM 脉管系统。使用光源检测蛋壳的变薄区域有助于形成钝孔，同时防止过度渗透和穿过蛋，从而导致CAM的侵入。
尽管在孵化过程中，鸡蛋旋转对于鸡胚胎的正常发育似乎是强制性的，但在刺破气室后必须避免旋转。该模型不需要去除白蛋白，也不需要添加PBS以避免卵子脱水。此外，应明智地使用70%乙醇溶液，并格外小心地干燥壳上任何剩余的乙醇溶液，以保持胚胎活力。另一个关键点是用于植入的蛋壳孔的大小，这需要平衡尽可能小的孔，以使嫁接操作舒适。移植胚胎阶段（E7）的选择是由CAM的成熟阶段及其相对大小驱动的，有利于移植的整合。然而，如果移植的类器官最终需要更长的 卵 子成熟时间，则可以在第 E5.5/6 天进行移植。控制大脑类器官变异性以确保实验可行性。相同年龄的类器官表现出相似的大小，重要的是要注意，无论类器官的年龄如何，它们都在移植后孵育 5 天。此外，为了保持一致性，对照类器官经过精心选择，以匹配其移植对应物的确切大小。另一个与支持移植类器官和胚胎存活相关的技术方面是用一块方形的封口膜封闭移植孔，以维持 卵 子环境中的受控环境。
与我们最初的假设相反，年轻的类器官在嫁接过程和CAM整合后比年长的类器官存活得更好。我们假设年轻的类器官更具可塑性，因为它们在早期祖细胞33 中富集存在，而成熟的神经元需要一个宽松的神经元环境来维持它们。此外，在星形胶质细胞的分布中检测到早期（D18）脑类器官移植物的细胞结构变化。值得注意的是，我们检测到星形胶质细胞仅在移植时才在这个早期阶段分化，并且它们分布在类器官表面下产生假胶囊。这种结构可能让人想起类器官产生可以模仿BBB的神经血管界面的潜力。或者，位于屏障状结构中的星形胶质细胞的反应性增加可能表明类器官对CAM分泌信号的免疫原性反应。然而，需要进一步的工作来证明这一假设。综上所述，本文描述了在鸡CAM中植入多个发育阶段的类器官的步骤，这是早期发育类器官的更宽松情况，以及这些移植在神经元和GFAP中的细胞效应。
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Disclosures
作者没有报告任何利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢 UB 的 Alcántara 博士和 Ortega 博士以及 Acosta 博士实验室的其他成员进行了富有洞察力的讨论。S.A.是巴塞罗那大学加泰罗尼亚将军学院的Serra-Hunter研究员助理教授。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
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