Summary
여기에서는 여러 성숙 단계에서 인간 뇌 오가노이드를 병아리 융모막(CAM)에 생착하는 프로토콜을 제시합니다. 뇌 오가노이드는 유도되지 않은 표준화된 프로토콜에 따라 성장했습니다.
Abstract
면역 결핍 마우스 또는 병아리 배아 융모막(CAM)과 같은 모델 동물의 혈관 조직에 오가노이드를 생착하는 것은 신생혈관 형성 모델링에 효율적인 것으로 입증되었습니다. CAM은 혈관이 풍부하게 형성된 배아외 막으로, 면역 반응이 제한되어 인간 유래 세포 이식을 위한 훌륭한 호스팅 모델이 되었습니다.
본 논문은 여러 성숙 단계에서 분화된 인간 뇌 오가노이드를 CAM에 이식하는 전략을 설명합니다. 뇌 오가노이드의 세포 구성은 시간이 지남에 따라 변화하며, 이는 인간 뇌 발달의 이정표를 반영합니다. 신경 상피 확장(18 DIV), 초기 신경 발생(60 DIV) 및 초기 신경 형성(180 DIV)과 같은 관련 성숙 단계의 뇌 오가노이드를 배아일(E)7 닭 배아의 CAM에 이식했습니다. 생착된 뇌 오가노이드를 5일 후에 수확하고 조직학적 특징을 분석했습니다.
이식된 오가노이드에서 신생혈관 형성의 조직학적 징후나 이식편에 인접한 비정상적인 혈관은 발견되지 않았습니다. 또한, 이식된 오가노이드의 세포 구성에서 현저한 변화, 즉 신경교세포(glial fibrillary acidic protein-positive-reactive astrocyte)의 수가 증가하는 것이 관찰되었습니다. 그러나 세포구조적 변화는 오가노이드 성숙 단계에 따라 달라졌습니다. 이러한 결과는 뇌 오가노이드가 CAM에서 자랄 수 있음을 시사하며, 이식 시 성숙 단계에 따라 세포 구조의 차이를 보여줍니다.
Introduction
인간 뇌 오가노이드는 인간 뇌의 초기 발달을 in vitro 1,2,3으로 요약할 수 있는 새로운 기술입니다. 그럼에도 불구하고 이 모델의 주요 한계 중 하나는 뇌 항상성뿐만 아니라 뇌 발달에도 필수적인 역할을 하는 혈관화가 부족하다는 것이다4. 축적된 증거에 따르면 산소와 영양소의 전달 외에도 뇌의 혈관계는 발달 과정에서 신경 분화, 이동 및 시냅스 형성을 조절합니다 5,6. 따라서 뇌 오가노이드에 누락된 혈관 신호전달 및 구조를 제공하여 인간 뇌 오가노이드 세대의 복잡성을 높일 수 있는 신뢰할 수 있는 모델 구축이 시급하다7.
제안된 혈관화 방법 중 두 가지 주요 유선형을 고려할 수 있습니다: 살아있는 유기체에 오가노이드 생착과 내피 세포와 신경 세포를 공동 배양하는 순수 시험관 내 기술 8,9,10,11,12. 생쥐의 뇌내 이식은 비용과 시간이 많이 들기 때문에 다른 기술은 더 간단한 모델과 관련이 있습니다. 병아리 융모막 막(CAM) 분석은 혈관신생을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다 13,14,15. 지난 10년 동안 여러 그룹이 신장 16,17, 심장18 및 종양 오가노이드19,20을 포함한 다양한 유형의 오가노이드를 CAM에 성공적으로 생착했습니다. 그럼에도 불구하고 인간의 뇌 오가노이드를 CAM에 생착시키는 효능, 독성/거부 반응, 생리학적 효과 및 방법에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 또 다른 흥미롭지만 아직 탐구되지 않은 측면은 CAM과 오가노이드 성상세포 인터페이스 사이에 키메라 혈액-뇌 장벽(BBB)이 형성된다는 것입니다. 이전의 선구적인 연구는 성상교세포와 성상교세포가 조건화된 배지를 이식하여 CAM에서 BBB를 생성하는 추정 가능성을 제안했습니다 21,22,23. 그러나 성숙한 성상교세포는 이24,25를 달성할 수 없는 것으로 보인다. 따라서 성상교세포에 의한 BBB의 형성은 여전히 논쟁의 여지가 있으며, 인간 뇌 오가노이드를 이식하면 이 논란에 대한 실마리를 제공할 수 있습니다.
이 비디오 기사는 성장, 개선 및 혈관화를 촉진하여 조직학적으로 호환되는 BBB 요소를 포함하는 오가노이드를 생성하는 CAM으로의 난형 인간 뇌 오가노이드 이식 프로토콜에 대해 설명합니다. 여기에서 우리는 닭 배아의 생존을 보장하는 프로토콜을 제시하고 뇌 오가노이드 성장을 유지하기 위한 CAM의 허용성에 대해 보고합니다.
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Protocol
흰다리뿔닭(Gallus gallus) 배아는 미국 국립연구위원회(National Research Council) 생명과학위원회 실험동물자원연구소(Institute of Laboratory Animals Resources)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 처리되었으며, 실험은 바르셀로나 대학의 실험동물 관리 및 사용 위원회(Council for Care and Use of Experimental Animals)의 승인을 받았습니다.
1. 비유도식 뇌 오가노이드 준비
- 37°C의 5%CO2 인큐베이터에서 DMEM(1:40)에 용해된 Matrigel로 코팅된 6웰 플레이트에서 70%의 합류 하에서 실온(RT)으로 예열된 mTESR1의 H9 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 유지합니다.
참고: Matrigel은 중합을 방지하기 위해 코팅으로 사용할 때까지 얼음에 보관해야 합니다. - 유도되지 않은 뇌 프로토콜에 따라 뇌 오가노이드 생성 2.
- 500μL의 세포 해리 용액을 사용하여 H9 hESC를 해리하고 37°C에서 3-5분 동안 배양합니다. ROCK 억제제 Y27632(최종 농도 50μM)가 포함된 mTESR1에 재현탁하고 저접착 전처리된 96웰 플레이트에 웰당 9,000개의 세포를 파종합니다.
- 오가노이드가 ROCK 억제제 Y27632(최종 농도 50μM)를 포함하는 mTESR1에 응집되면 5-6일 동안 유도 배지로 옮깁니다.
- 유도되지 않은 뇌 오가노이드 프로토콜26에 따라 4-5~일에 오가노이드를 신경 유도 배지로 옮깁니다.
- 크기와 신경 상피 고리를 얻으면 얼음처럼 차가운 Matrigel 방울로 옮깁니다. Matrigel이 중합되면 오가노이드를 5mL의 예열된 성숙 배지가 있는 5cm의 저접착 페트리 접시로 옮깁니다.
- 4일 후 뇌 오가노이드를 궤도 교반 상태로 둡니다.
- 접목 직전에 신선한 DPBS에서 수확할 오가노이드를 수집합니다.
2. 달걀 유지, 발달 활성화, 달걀 껍질 천자
- 수정란(0일째)을 사용할 때까지 18°C의 인큐베이터에 보관합니다.
알림: 이 온도에서는 발달하지 않고 동일한 성숙 단계에 남아 있습니다. - 사용이 필요한 경우 38°C 및 60% 상대 습도에서 45°C 각도로 부드럽게 흔들며 배양합니다.
- 1일째에는 달걀 껍질 표면을 에탄올 70%로 세척하고 종이 타월로 말려 살균합니다.
- 수술용 종이 접착 붕대(이하 "붕대"라고 함)를 계란 위에 놓고 계란의 공기실을 덮습니다.
알림: 이렇게 하면 달걀 껍질의 먼지가 CAM으로 떨어져 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. - 멸균 바늘 21G x 11/2''를 사용하여 계란 껍질을 부드럽게 뚫는 기포 천공(이하 ACH)이라고 하는 기실 천공을 수행합니다. 이 시점에서 껍질에서 분리되어 있는 CAM을 방해하지 않도록 계란의 위쪽 끝에 있는 ACH를 엽니다.
- ACH에 구멍을 뚫기에 가장 좋은 위치를 찾으려면 램프를 사용하여 달걀 위쪽 끝에서 가장 얇은 달걀 껍질 표면을 결정합니다. 직사광선 투과율은 천공하기에 가장 좋은 위치를 나타냅니다.
- 외부 환경으로부터 배아를 보호하기 위해 새 붕대로 ACH를 덮고 난자를 다시 인큐베이터에 넣습니다.
- 이 순간부터 인큐베이터의 회전을 멈추고 창이 위로 오도록 계란을 수직 위치로 유지하십시오.
알림: 이렇게 하면 배아의 발달이 촉진되고 CAM은 배아와 달걀 껍질 사이에 공기실이 있는 상단에서 사용할 수 있게 되어 후속 이식이 가능합니다. - 1일차부터 4일차까지 ACH를 엽니다. 생존력은 4일째(접목일 3일 전)에 증가합니다.
3. 뇌 오가노이드 이식
- CAM이 잘 발달하고 혈관화되어 난자를 배아 전체로 덮는 7일째에 이식을 수행합니다.
- 붕대를 제거하고 달걀 껍질 표면을 70% 에탄올로 닦아 달걀 껍질을 살균한 다음 ACH를 접목 창으로 조심스럽게 넓힙니다.
- 이식 창을 확대하는 동안 달걀 껍질 조각이 CAM으로 떨어지는 것을 방지하기 위해 최종 이식 창 너머로 확장을 덮는 더 큰 새 붕대를 놓습니다.
알림: 이 더 큰 창은 최상의 접목 위치를 선택하고 후속 접목을 위해 필요합니다. - 달걀 껍질의 지름이 약 2cm가 될 때까지 부드럽게 구멍을 뚫어 접목 창을 확대합니다. 창이 커질 때까지 핀셋으로 달걀 껍질 창의 가장자리를 부드럽게 제거합니다. 붕대를 부드럽게 벗겨 붕대에 붙어 있을 남아 있는 먼지와 달걀 껍질 조각을 제거합니다.
- P200 자동 피펫으로 오가노이드를 놓습니다. 멸균 및 날카로운 가위로 팁을 절단하여 오가노이드의 크기에 맞게 개구부를 확대하고 오가노이드의 손상을 방지하거나 와이드 게이지 이송 멸균 팁을 사용하십시오. 최대 50μL의 PBS 부피로 오가노이드를 수집하여 배아 위치와 반대쪽에 있는 CAM으로 직접 옮깁니다.
- 수확 중 파열을 방지하기 위해 접목의 위치가 노른자에서 멀리 떨어져 있는지 확인하고 가급적이면 혈관 근처에 두는 것이 좋습니다.
- 오가노이드를 CAM에 놓은 후 오가노이드 주위에 7μL의 Matrigel 한 방울을 떨어뜨립니다.
알림: 이렇게 하면 오가노이드가 멤브레인 주위를 이동하는 것을 방지할 수 있습니다. - 창의 정확한 크기에 맞는 작은 파라필름 조각을 사용하여 창을 닫고 접착 붕대로 쉘에 부착합니다.
알림: 가스 교환을 허용하면서 배아가 건조되는 것을 방지하기 위해 파라필름으로 창을 완전히 덮는 것이 중요합니다. 창 커버리지의 확장을 적절하게 구분하고, 창을 초과하지 않도록 하면 올바른 배아 발달에 필요한 가스 교환을 방해할 수 있으므로27.
4. 이식된 오가노이드 수확
- 접목 후 5일째인 38 Hamburger and Hamilton 발달 단계(HH38)28에 해당하는 닭 발달 12일째에 접목된 오가노이드와 주변 CAM을 수확합니다. 이 단계에서 CAM은 성숙한 혈관 조직으로 완전히 분화되고 깃털 세균은 날개와 배아의 위쪽 눈꺼풀을 덮습니다.
- 접착 붕대를 제거한 후 가위와 미세한 핀셋을 사용하여 샘플 채취를 용이하게 하기 위해 창을 더 확대합니다.
- 필요한 경우 양안 해부 현미경을 사용하여 오가노이드를 시각화한 다음 오가노이드 및 CAM 수확을 돕기 위해 4% 파라포름알데히드(PFA)로 2분 접두사 단계를 수행합니다.
- 오가노이드를 포함하는 CAM의 1.5cm2 섹션을 수집합니다.
- 시료 고정
- 샘플을 1x PBS로 세척하고 4°C에서 30분 동안 4% PFA(PBS, pH 7.2)로 고정합니다. 그런 다음 PBS에서 3 x 5분 동안 샘플을 세척합니다.
- 샘플을 아지드화나트륨과 함께 PBS에서 4°C에 보관하거나 4°C에서 밤새 30% 자당-PBS에서 직접 냉동 보호합니다.
- 동결 보호 후 샘플을 최적의 절단 온도 화합물(OCT)에 넣고 절단할 때까지 -20°C에서 보관합니다. 저온 유지 장치를 사용하여 20μm 두께의 조직 조각을 자르고 자일란화 슬라이드에 수집합니다. 슬라이드는 염색에 사용될 때까지 -20°C에서 보관합니다.
5. 면역형광
- 실온(RT)에서 10분 동안 0.1% Triton X-100(PBS-T)이 포함된 PBS 용액이 있는 섹션에서 OCT.를 제거합니다.
- RT에서 1시간 동안 2% BSA, 3% 당나귀 혈청 PBS-T 0.01% 용액으로 차단 용액(BS)으로 절편을 처리합니다.
- 선택한 1차 항체( 재료 표 참조)를 BS에 희석하고 4°C에서 밤새 샘플을 배양합니다.
- 다음날 샘플을 RT에서 1x PBS에서 3 x 10 분 세척합니다.
- 2차 항체를 BS에 희석하고 RT에서 2시간 동안 배양합니다( 재료 표 참조).
- 샘플을 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 10분 동안 배양하여 RT에서 세포핵을 표시하고 PBS-T에 1:1,000 희석으로 희석합니다.
- 장착 매체로 슬라이드를 장착하고 유리 커버슬립으로 덮습니다.
- 광시야 형광 현미경을 사용하여 2.5, 10, 20 및 40x에서 모든 이미지를 촬영합니다.
- 슬라이스를 4 °C에서 보관하십시오.
6. 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색
참고: 이식이 효과가 있었음을 증명하려면 H&E 염색을 수행하십시오.
- RT에서 0.1분 동안 PBS-T 10%로 OCT를 제거합니다.
- 증류수(DW)에서 10분, 헤마톡실린에서 45초, DW에서 1분, PBS에서 20초, 70% EtOH에서 2 x 30초, 80% EtOH에서 2 x 30초, 96% EtOH에서 2 x 30초, 에오신에서 30초, 96% EtOH에서 2 x 15초, 100% EtOH에서 2 x 15초, 자일롤-100% ETOH에서 1분, 자일롤에서 1분, 자일롤(신선)에서 1분.
- 크실렌 기반 장착 매체를 사용하여 유리 커버슬립을 장착합니다.
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Representative Results
이식을 위한 배아 성숙 일정 선택
실험은 수정란이 38°C 및 60% 상대 습도에서 배양될 때 D0에서 시작됩니다. 융모막막(chorioallantoic membrane, CAM)은 난자 배양 후 발달하는 고도로 혈관화된 배아외 막입니다. 그것은 알란토아와 융모막의 융합에 의해 형성됩니다. D1에서 24시간의 배양 후 CAM이 내부 쉘 멤브레인에 부착되는 것을 방지하기 위해 공기 챔버에 구멍이 뚫립니다. D1에서 공기 챔버를 뚫으면 나중에 펑크가 날 때보다 공기 챔버의 품질이 향상됩니다.tage(D4). CAM은 D12까지 계속 성장하여 전체 계란 내용물을 감싸고 내부 껍질 막에 단단히 부착됩니다(그림 1). D7에 만들어진 구멍은 샘플 채취를 용이하게 하기 위해 확대됩니다. D7은 CAM이 성숙하고 난황낭과 배아 표면을 덮을 때 이식을 위한 최적의 시기입니다. 이 단계에서 공기 챔버 구멍이 확대되고 자동 피펫을 사용하여 오가노이드가 CAM으로 옮겨집니다.
뇌 오가노이드 이식
체외에서 뇌 오가노이드의 내재적 성숙을 통해 세포 구성은 신경 전구 세포에서 성숙한 뉴런 및 신경교세포로 변화합니다. 신경혈관과 신경발생은 척추동물의 뒤섞이고 상호 의존적인 발달 과정이며, 이러한 누화로 이어지는 신호는 신경 대응물(29)의 성숙 단계에 크게 의존한다. 신경 전구 세포는 발달 중인 뇌에서 혈관 형성 인자의 주요 공급원이다29,30. 반대로, 뉴런과 성상세포는 혈관 내피 성장 인자31,32의 분비를 통해 성숙 단계와 성인기의 신생혈관 신생을 지원합니다. 뇌 오가노이드에도 반영되는 이러한 뇌 세포 구조의 변화는 뇌 오가노이드의 성숙 단계에 따라 CAM 생착에 대한 통합 및 반응에 차등적인 변화를 초래할 수 있습니다. 따라서 우리는 신경 상피 세포와 요골 아교세포가 확장되는 분화 13일째 in vitro(DIV)에 뇌 오가노이드를 이식했습니다. DIV 37에서, 신경 발생의 시작시; DIV 60에서, 신경 발생이 강건하고 다른 정체성의 뉴런이 말단으로 분화될 때; 그리고 DIV 120에서는 성숙한 뉴런이 오가노이드를 채우고 있을 때 잘 발달된 뉴런 네트워크와 천체 발생을 생성하는 것도 널리 퍼져 있습니다.
모든 경우에, 샘플은 in ovo (DIO) 배양 5일 후에 수집되었습니다. 뇌 오가노이드의 배치 효과로 인한 편향을 피하기 위해 이식된 오가노이드와 이식되지 않은 오가노이드 간의 모든 비교를 동일한 배치에서 쌍으로 수행했습니다. 오가노이드는 시점당 최소 2개의 독립적인 실험과 총 6개의 독립적인 분화에서 파생되었습니다. 여러 성숙 단계의 접목은 각 접목 실험에서 병렬로 수행되었습니다. 이식 시 오가노이드는 혈관이 오가노이드에 침투했다는 증거 없이 CAM 혈관에 인접한 성숙 과정을 계속했습니다(그림 2).
이식 시 오가노이드 생존율은 가장 어린 오가노이드의 경우 80%, 이식 후 5일 후 성숙한 오가노이드의 경우 ~66%로 떨어지며, 이는 시간이 지남에 따라 허용성 및 오가노이드 이식 가소성이 변할 수 있음을 시사합니다(표 1). 오가노이드 생존율은 H&E 염색에서 pyknotic nuclei의 존재에 의해 결정되었습니다. pyknotic nuclei의 수는 이식된 대조군과 이식되지 않은 대조군 오가노이드 간에 유사했으며(그림 3), 이는 CAM이 이식 시 살아있는 오가노이드를 유지하는 데 허용됨을 시사합니다. 더욱이, CAM에서 조직학적 또는 혈원적 방출이 검출되지 않았으며, 배아는 살아 있으며, 이는 이식 절차나 오가노이드가 CAM의 무결성을 방해하거나 배아 발달에 큰 영향을 미치지 않음을 시사합니다.
이식된 뇌 오가노이드의 세포 구성
유도되지 않은 뇌 오가노이드는 오가노이드 간 및 오가노이드 내 세포 변동성이 뚜렷합니다. 그러나 그들은 주로 신경이며, 전구 세포, 뉴런 및 성상 세포의 파동을 순차적 인 속도로 생성합니다 2,26. 다음으로 이식이 뇌 오가노이드의 신경 구성을 변화시키는지 여부를 평가했습니다. 더 어린 오가노이드(13 DIV + 5 DIO: 18일)는 뉴런(TUBB3+)이 있는 대조군 비이식 오가노이드와 차이가 없습니다. 후기 성숙 단계(60 DIV +5 DIO: 65일 및 120 DIV + 5 DIO: 125일)에서 뉴런(TUBB3+)의 비율은 이식되지 않은 오가노이드에 비해 급격히 감소합니다(그림 4). 60 DIV로 성숙한 이식되지 않은 오가노이드에서는 뉴런이 오가노이드 전체에 널리 퍼져 있습니다.
특히, 신경교세포(glial fibrillary acidic protein-positive, GFAP+) 성상세포(astrocyte)의 수와 국소화는 이식되지 않은 대조군에서 관찰된 것에 비해 증가를 보였다. 더욱이, 이러한 GFAP+ 성상세포는 오가노이드의 바깥쪽에서 예상치 못한 국소화를 획득했습니다. 18 DIV에서는 유리 오가노이드(비이식)를 볼 수 있으며 성상세포가 거의 보이지 않으며 구조적 분포를 감지할 수 없습니다. 반대로, 이들은 오가노이드 전체에 균질하게 퍼져 있는 것처럼 보입니다(그림 3).
그림 1: 오가노이드 이식을 위한 CAM 분석 설정 타임라인. (A) 달걀 위에 수술용 종이 접착 붕대를 붙입니다. (B) 접착 붕대 위에 바늘로 껍질에 구멍을 뚫습니다. (C) 달걀 껍질의 창을 열고 위에서 보면 (D) 인간 뇌 오가노이드를 이식할 준비가 됩니다(60일). 스케일 바 = 100 μm. (E) 난자 배양 5일 후 CAM에서 생착된 오가노이드를 시각화합니다. (F) 0일에서 120일까지의 뇌 오가노이드 발달의 특징. 화살표는 오가노이드의 위치를 나타냅니다. 약어: CAM = chorioallantoic membrane. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 융모막에서 이식된 오가노이드의 헤마톡실린 및 에오신 염색. (A) 13 DIV + 5 DIO 오가노이드; (B) 37 DIV + 5 DIO 오가노이드; (C) 60 DIV + 5 DIO 오가노이드; 및 (D) 120 DIV + 5 DIO 오가노이드; 빨간색 사각형은 오가노이드를 표시합니다. 스케일 바 = 500μm. 약어: DIV = 시험관 내 일; DIO = 오보의 날. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 다양한 발달 단계에서 오가노이드의 면역세포화학. GFAP는 염색에 사용되었고 DAPI는 핵에 사용되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. (A,B) 오가노이드의 가장자리 주위에 성상세포가 보이는 동일한 13 DIV + 5 DIO 이식 오가노이드의 이미지. (C) 성상교세포가 거의 보이지 않는 18 DIV free 오가노이드 이미지. 자유 오가노이드와 이식 오가노이드의 차이는 매우 두드러집니다. (디,이) 성상교세포가 거의 보이지 않는 37 DIV + 5 DIO 이식 오가노이드 이미지. (F) 42 DIV free 오가노이드 이미지. 노란색 화살표는 성상교세포의 위치를 나타냅니다. 약어: DIV = 시험관 내 일; DIO = ovo의 날; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌; GFAP = 신경교세포섬유산성 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 120 DIV 오가노이드의 면역세포화학. TUBB3는 뉴런을 염색하는 데 사용되었고 DAPI는 핵을 염색하는 데 사용되었습니다. 눈금 막대 = 100μm; 이미지는 20x로 촬영되었습니다. (A) 뉴런이 거의 보이지 않는 120 DIV +5 DIO 이식 오가노이드. (B) 125 DIV, 뉴런이 많은 자유 오가노이드. 별표는 오가노이드의 위치를 나타내고 점선은 오가노이드와 CAM 사이의 한계를 나타냅니다(조직학적 분석에 의해 결정됨). 약어: DIV = 시험관 내 일; DIO = ovo의 날; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌; CAM = 융모막막. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 오가노이드 | 13 구분 | 37 구분 | 60 사업부 | 120 사업부 |
| 살아 | 6 (75%) | 10 (83%) | 6 (66%) | 6 (66%) |
| 죽은 | 2 (25%) | 2 (16%) | 3 (34%) | 3 (34%) |
표 1: CAM 오가노이드 이식 후 배아 생존율. 약어: DIV = 시험관 내 일; DIO = ovo의 날; CAM = 융모막막.
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Discussion
이 연구에서는 닭 배아의 생존을 방해하지 않으면서 이식 시 인간 뇌 오가노이드의 유리한 성장과 발달을 제공하는 수많은 주요 단계가 포함된 자세한 프로토콜을 설명합니다. 멸균 바늘을 사용하여 배양 24시간(1일) 후 난자의 공기실에 구멍을 뚫을 것을 권장했습니다. 또한, 우리는 또한 4일째에 구멍을 뚫으려고 시도했습니다(건강한 배아에서만 일하고 있는지 확인하기 위해 혈관 발달을 테스트하기 위해 달걀 껍질을 빛으로 확인한 후). 그러나, 이것은 CAM 혈관이 달걀 껍질에 근접하기 때문에 배아 생존력의 감소를 초래했다. 너무 많은 힘을 가하면 달걀 껍질이 깨지고 CAM 혈관이 손상될 수 있습니다. 광원을 사용하여 달걀 껍질의 얇아진 부분을 감지하면 뭉툭한 구멍을 만드는 동시에 과침투와 달걀 통과를 방지하여 CAM의 침입을 방지하는 데 도움이 되었습니다.
부화 중 닭 배아의 적절한 발달을 위해 계란 회전이 필수인 것처럼 보이지만 공기실에 구멍을 뚫은 후에는 이를 피해야 합니다. 이 모델에서는 알부민 제거가 보증되지 않았으며 난자의 탈수를 피하기 위해 PBS를 추가하지도 않았습니다. 또한, 70% 에탄올 용액의 사용은 현명하게 이루어져야 하며, 배아 생존력을 보존하기 위해 껍질에 남아 있는 에탄올 용액을 건조시키는 데 각별한 주의를 기울여야 합니다. 또 다른 중요한 점은 생착에 사용되는 달걀 껍질 구멍의 크기로, 이식 조작이 편안할 수 있도록 가능한 가장 작은 구멍의 균형을 맞춰야 합니다. 이식을 위한 배아 단계(E7)의 선택은 CAM의 성숙 단계와 상대적 크기에 의해 주도되어 이식의 통합을 선호했습니다. 그러나 이식된 오가노이드가 난자 성숙에 더 오래 걸리는 경우 E5.5/6일에 이식을 수행할 수 있습니다. 뇌 오가노이드 변동성은 실험 생존 가능성을 보장하기 위해 제어됩니다. 같은 연령의 오가노이드는 비슷한 크기를 나타내며, 오가노이드의 연령에 관계없이 이식 후 5일 동안 모두 배양되었다는 점에 유의해야 합니다. 또한 일관성을 위해 대조군 오가노이드는 생착된 오가노이드의 정확한 크기와 일치하도록 세심하게 선택되었습니다. 이식된 오가노이드와 배아의 생존을 지원하는 것과 관련된 또 다른 기술적 측면은 제어된 난자 환경을 유지하기 위해 정사각형 파라필름 조각으로 이식 구멍을 막는 것입니다.
초기 가설과 달리 젊은 오가노이드는 이식 과정과 CAM 통합 후 오래된 오가노이드보다 더 잘 생존했습니다. 우리는 젊은 오가노이드가 초기 단계의 전구세포(progenitor)에 풍부하게 존재하기 때문에 더 가소성(plastic)인 반면, 성숙한 뉴런은 유지를 위해 관대한 뉴런 환경이 필요하다는 가설을 세웠다. 또한, 초기(D18) 뇌 오가노이드 이식의 세포구조적 변화는 성상교세포의 분포에서 발견되었습니다. 특히, 우리는 성상교세포가 이식될 때만 초기 단계에서 분화하고 스스로 분포하여 오가노이드 표면 아래에 유사 캡슐을 생성한다는 것을 발견했습니다. 이 구조는 BBB를 모방할 수 있는 신경혈관 인터페이스를 생성하는 오가노이드의 잠재력을 연상시킬 수 있습니다. 대안적으로, 장벽과 같은 구조에 위치한 성상교세포의 증가된 반응성은 CAM에서 분비된 신호전달에 대한 오가노이드의 면역원성 반응을 나타낼 수 있습니다. 그러나 이 가설을 입증하기 위해서는 추가 작업이 필요합니다. 요약하면, 이 논문은 초기 발달 오가노이드에 더 관대한 상황인 닭 CAM에서 여러 발달 단계의 오가노이드를 생착하는 단계와 뉴런 및 GFAP에서 이러한 접목의 세포 효과에 대해 설명합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 보고하지 않습니다.
Acknowledgments
통찰력 있는 토론을 해주신 UB의 Alcántara 박사님과 Ortega 박사님, 그리고 Acosta 박사님 연구실의 다른 분들께 감사드립니다. S.A.는 바르셀로나 대학교(Universitat de Barcelona)의 카탈루냐 총대주교(Generalitat de Catalunya)의 세라-헌터(Serra-Hunter) 동료 조교수입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
References
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