Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

אורגנואיד מוח אנושי מוקדם לא מונחה מידול נישה נוירו-וסקולרית לתוך קרום עובר אפרוח מתירני Chorioallantoic

Published: February 16, 2024 doi: 10.3791/65710
Automatic Translation
1,2, 3, 3,4, 3,4, 3,5, 5,6,7,8, 2,9, 9, 2,9, 1,2, 1,2, 3,4
1Instituto de Biología Celular y Neurociencias “Prof. E. De Robertis” (IBCN), CONICET - Universidad de Buenos Aires, 2Facultad de Medicina, Departamento de Biología Celular, Histología, Embriología y Genética, Universidad de Buenos Aires, 3Institute of Neurosciences, Pathology and Experimental Therapeutics Dept, University of Barcelona, 4Functional Neurogenomics Group, Neurodevelopmental Disorders, IDIBELL, L’Hospitalet de Llobregat, 5IBE, Institute of Evolutionary Biology (UPF-CSIC), Department of Medicine and Life Sciences, Universitat Pompeu Fabra, 6Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA) and Universitat Pompeu Fabra, 7Center for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology, 8BarcelonaBeta Brain Research Center, Pasqual Maragall Foundation, 9Instituto de Investigación en Biomedicina (IBioBA) – CONICET – Instituto Partner de la Sociedad Max Planck

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת אורגנואידים במוח האנושי בשלבי הבשלה מרובים לתוך קרום כוריואלנטואי אפרוח (CAM). אורגנואידים במוח גודלו בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים לא מונחים.

Abstract

השתלת אורגנואידים ברקמות כלי דם בחיות מודל, כגון עכבר מדוכא חיסון או קרום כוריואלנטואי של עובר אפרוח (CAM), הוכחה כיעילה עבור מודלים neovascularization. ה- CAM הוא קרום חוץ-עוברי עשיר בכלי הדם, אשר מראה תגובתיות חיסונית מוגבלת, ובכך הופך למודל אירוח מצוין להשתלות תאים ממקור אנושי.

מאמר זה מתאר את האסטרטגיה להשתלת אורגנואידים במוח האנושי המובחנים בשלבי הבשלה מרובים לתוך CAM. ההרכב התאי של אורגנואידים במוח משתנה עם הזמן, ומשקף את אבני הדרך של התפתחות המוח האנושי. השתלנו אורגנואידים במוח בשלבי הבשלה רלוונטיים: התרחבות נוירואפיתל (18 DIV), נוירוגנזה מוקדמת (60 DIV) וגליוגנזה מוקדמת (180 DIV) לתוך CAM של עוברי תרנגולות ביום העוברי (E)7. אורגנואידים מושתלים במוח נקטפו 5 ימים לאחר מכן ותכונותיהם ההיסטולוגיות נותחו.

לא התגלו סימנים היסטולוגיים של ניאו-וסקולריזציה באורגנואידים המושתלים או בכלי דם חריגים הסמוכים להשתלות. יתר על כן, שינויים מדהימים נצפו בהרכב התאי של האורגנואידים המושתלים, כלומר, עלייה במספר האסטרוציטים של חלבון גליה פיברילרי חומצי-חיובי-תגובתי. עם זאת, השינויים הציטוארכיטקטוניים היו תלויים בשלב ההבשלה האורגנואידי. בסך הכל, תוצאות אלה מצביעות על כך שאורגנואידים במוח יכולים לגדול ב- CAM, והם מראים הבדלים בציטוארכיטקטורה בהתאם לשלב ההבשלה שלהם בהשתלה.

Introduction

אורגנואידים של המוח האנושי הם טכניקה מתפתחת המאפשרת לנו לשחזר את ההתפתחות המוקדמת של המוח האנושי במבחנה 1,2,3. עם זאת, אחת המגבלות העיקריות של מודל זה היא חוסר כלי דם, אשר ממלא תפקידים חיוניים לא רק בהומאוסטזיס המוח אלא גם בהתפתחות המוח4. בנוסף לאספקת חמצן וחומרים מזינים, עדויות מצטברות מצביעות על כך שמערכת כלי הדם במוח מווסתת התמיינות עצבית, נדידה וסינפטוגנזה במהלך התפתחות 5,6. לכן, יש צורך דחוף להקים מודלים אמינים שיכולים לספק את האיתות והמבנה הווסקולרי החסר לאורגנואידים במוח, ולשפר את המורכבות של דור אורגנואיד המוח האנושי7.

בין השיטות המוצעות לכלי דם, ניתן לשקול שני ייעולים עיקריים: השתלת אורגנואידים לאורגניזם חי וטכנולוגיות חוץ גופיות גרידא בגידול משותף של תאי אנדותל ותאים עצביים 8,9,10,11,12. השתלה תוך-מוחית בעכברים היא יקרה וגוזלת זמן, מה שהופך טכנולוגיות אחרות לרלוונטיות עבור מודלים פשוטים יותר. בדיקת הממברנה הכוריאואלנטואית של אפרוח (CAM) שימשה באופן נרחב לחקר אנגיוגנזה 13,14,15. בעשור האחרון, מספר קבוצות הצליחו להשתיל סוגים שונים של אורגנואידים, כולל כליות16,17, לב18 ואורגנואידים סרטניים19,20, לתוך CAMs. עם זאת, מעט ידוע על היעילות, רעילות/דחייה, השפעה פיזיולוגית ושיטות להשתלת אורגנואידים במוח האנושי לתוך CAM. היבט מעניין נוסף שעדיין לא נחקר הוא היווצרות מחסום דם-מוח כימרי (BBB) בין ה-CAM לבין הממשק האסטרוציטי האורגנואידי. עבודה חלוצית קודמת הציעה את ההיתכנות המשוערת של יצירת BBB ב- CAM על ידי השתלת אסטרוציטים ותווך מותנה אסטרוציטים 21,22,23. עם זאת, נראה כי אסטרוציטים בוגרים אינם מסוגלים להשיג זאת24,25. לפיכך, היווצרות האסטרוציטים של BBB נותרה שנויה במחלוקת, והשתלת אורגנואידים במוח אנושי תאפשר לנו לשפוך אור על מחלוקת זו.

מאמר וידאו זה מתאר פרוטוקול להשתלת אורגנואיד מוח אנושי לתוך CAM המקדם צמיחה, שיפור וכלי דם, וכתוצאה מכך אורגנואידים הכוללים אלמנטים היסטולוגיים תואמים BBB. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבטיח את הישרדותו של עובר התרנגולת ומדווחים על המתירנות של CAM כדי לשמור על צמיחת אורגנואידים במוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עוברי תרנגולת הלגהורן הלבנה (Gallus gallus) טופלו על ידי מעקב אחר המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה מהמכון למשאבי חיות מעבדה, הוועדה למדעי החיים, המועצה הלאומית למחקר, ארה"ב, והניסויים אושרו על ידי המועצה לטיפול ושימוש בחיות ניסוי מאוניברסיטת ברצלונה.

1. הכנת אורגנואיד מוח לא מונחה

  1. שמור על תאי גזע עובריים אנושיים H9 (hESCs) ב- mTESR1 שחוממו מראש בטמפרטורת החדר (RT) תחת מפגש של 70% בצלחות 6 בארות מצופות במטריג'ל מומס ב- DMEM (1:40) באינקובטור 5% CO2 ב- 37 ° C.
    הערה: יש לשמור את המטריגל בקרח עד לשימוש בו כציפוי למניעת פילמור.
  2. יצירת אורגנואידים במוח בעקבות פרוטוקול המוח הלא מונחה 2.
    1. נתקו תאי גזע עובריים H9 באמצעות 500 μL של תמיסת הדיסוציאציה התאית ודגרו במשך 3-5 דקות ב-37°C. יש להשהות מחדש ב-mTESR1 המכיל מעכב ROCK Y27632 (ריכוז סופי 50 מיקרומטר) ולזרוע 9,000 תאים לבאר בצלחת 96 בארות בהדבקה נמוכה.
    2. ברגע שהאורגנואידים מצטברים ב-mTESR1 המכיל מעכב ROCK Y27632 (ריכוז סופי 50 מיקרומטר), מעבירים אותם למדיום אינדוקציה למשך 5-6 ימים.
    3. בעקבות פרוטוקול אורגנואיד מוח לא מונחה26, העבר את האורגנואידים למדיה אינדוקציה עצבית ב~ימים 4-5.
    4. ברגע שהם רוכשים את הגודל ואת טבעת neuroepithelium, להעביר אותם לתוך טיפת Matrigel קר כקרח. לאחר פולימריזציה של המטריגל, מעבירים את האורגנואידים לצלחת פטרי בקוטר 5 ס"מ, בעלת הדבקה נמוכה עם 5 מ"ל של מדיום התבגרות שחומם מראש.
    5. לאחר 4 ימים, לשים את המוח אורגנואידים תחת תסיסה מסלולית.
  3. אספו את האורגנואידים לקציר ב-DPBS טרי מיד לפני ההשתלה.

2. תחזוקת ביצים, הפעלת התפתחות וניקוב קליפות ביצים

  1. יש לאחסן ביצים מופרות (ביום 0) באינקובטור בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    הערה: בטמפרטורה זו, הם אינם מתפתחים, נשארים באותו שלב של התבגרות.
  2. כאשר יש צורך לשימוש, לדגור אותם ב 38 ° C ו 60% לחות יחסית עם סיבוב נדנדה רך בזווית של 45 ° C.
  3. ביום הראשון, נקו את משטח קליפת הביצה באתנול 70% וייבשו אותה במגבת נייר כדי לעקר אותה.
  4. הניחו תחבושת דבק נייר כירורגית, להלן "תחבושת", על גבי הביצה, המכסה את תא האוויר של הביצה.
    הערה: פעולה זו תמנע מאבק מקליפת הביצה ליפול לתוך ה- CAM שבו הוא נתקע.
  5. בצע את ניקוב תא האוויר, להלן חור תא האוויר (ACH), עם מחט סטרילית בגודל 21 גרם x 11/2 אינץ', המנקבת ברכות את קליפת הביצה. פתח את ה- ACH בקצה העליון של הביצה כדי למנוע הפרעה ל- CAM, אשר בשלב זה מוטל מופרד מהקליפה.
  6. כדי למצוא את המיקום הטוב ביותר לנקב את ה- ACH, השתמש במנורה כדי לקבוע את משטח קליפת הביצה הדק ביותר בקצה העליון של הביצה. שידור קרן האור הישירה מציין את המיקום הטוב ביותר לקדוח.
  7. כסו את ה-ACH בתחבושת חדשה כדי להגן על העובר מפני הסביבה החיצונית והחזירו את הביצית לאינקובטור.
  8. מרגע זה ואילך, להפסיק את הסיבוב באינקובטור ולשמור על הביצים במצב אנכי עם החלון למעלה.
    הערה: זה יקל על התפתחות העובר, וה- CAM הופך להיות זמין בחלק העליון עם תא אוויר בין העובר לקליפת הביצה, המאפשר השתלה לאחר מכן.
  9. פתח את ACH מיום 1 עד יום 4. הכדאיות עולה ביום 4 (3 ימים לפני יום ההשתלה).

3. השתלת אורגנואיד במוח

  1. בצע השתלה ביום 7 כאשר ה- CAM מפותח היטב וכלי דם, מכסה את הביצית בכל רחבי העובר.
  2. הסירו את התחבושת, ונגבו את משטח קליפת הביצה באתנול 70% כדי לעקר את קליפת הביצה, לפני הרחבתם בזהירות של ה-ACH לחלון השתלה.
  3. הניחו תחבושת חדשה וגדולה יותר המכסה את השלוחה מעבר לחלון ההשתלה הסופי כדי למנוע נפילת שברי קליפת ביצה לתוך ה-CAM תוך הגדלת חלון ההשתלה.
    הערה: חלון גדול יותר זה נחוץ כדי לבחור את תנוחת ההשתלה הטובה ביותר ולהשתלה לאחר מכן.
  4. מגדילים את חלון ההשתלה על ידי ניקוב עדין של קליפת הביצה עד שהחלון מגיע לקוטר של כ-2 ס"מ. הסירו בעדינות את שולי חלון קליפת הביצה בפינצטה עד להגדלת החלון. הסירו את שאריות האבק וקליפות הביצים שיישארו מחוברות לתחבושת על ידי קילוף רך של התחבושת.
  5. מניחים את האורגנואיד עם פיפט אוטומטי P200. גזרו את הקצוות במספריים סטריליים וחדים כדי להגדיל את הפתח בהתאם לגודל האורגנואיד ולמנוע נזק לאורגנואיד או השתמשו בקצוות סטריליים בעלי מד רחב. אספו את האורגנואיד בנפח מרבי של 50 מיקרוליטר PBS והעבירו אותו ישירות לתוך ה-CAM, בצד הפוך למיקום העובר.
  6. ודאו שמיקום השתל מרוחק מהחלמון כדי למנוע קרע שלו במהלך הקציר, ורצוי להניח אותו ליד כלי דם.
  7. מניחים טיפה של 7 μL של מטריג'ל סביב האורגנואיד לאחר הנחת האורגנואיד על CAM.
    הערה: פעולה זו תמנע מהאורגנואיד לנוע סביב הממברנה.
  8. סגרו את החלון באמצעות פיסת פרפילם קטנה המתאימה לגודל המדויק של החלון וחברו אותה למעטפת בעזרת תחבושת דבק.
    הערה: חשוב לכסות את החלון במלואו עם הפרפילם כדי למנוע מהעובר להתייבש תוך מתן אפשרות להחלפת גזים. לתחום כראוי את הרחבת כיסוי החלון, הימנעות חריגה מהחלון, שכן זה יכול לעכב את חילופי הגזים הדרושים להתפתחות נכונה של העובר27.

4. קצירת אורגנואידים מושתלים

  1. קצרו את האורגנואידים המושתלים ואת ה-CAM שמסביבם ביום ה-12 של התפתחות העוף, המתאים לשלב הפיתוח של המבורגר והמילטון (HH38)28, 5 ימים לאחר ההשתלה. בשלב זה, ה- CAM מובחן לחלוטין עם כלי דם בוגרים בעוד חיידקי הנוצות מכסים את הכנפיים כמו גם את העפעף העליון של העובר.
  2. עם הסרת תחבושת הדבק, הגדילו עוד יותר את החלון כדי להקל על קציר הדגימות באמצעות מספריים ופינצטה עדינה.
  3. דמיינו את האורגנואיד בעזרת מיקרוסקופ דיסקציה דו-עינית במידת הצורך, ולאחר מכן שלב קיבוע של 2 דקות עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) כדי לסייע בקצירת אורגנואיד ו-CAM.
  4. אסוף קטע בגודל 1.5 ס"מ2 של ה- CAM המכיל את האורגנואיד.
  5. קיבוע לדוגמה
    1. שטפו את הדגימות עם 1x PBS וקבעו אותן עם 4% PFA (ב-PBS, pH 7.2) למשך 30 דקות ב-4°C. לאחר מכן, שטפו את הדגימות במשך 3 x 5 דקות ב- PBS.
    2. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 4°C ב-PBS עם נתרן אזיד או הגנו עליהן ישירות ב-30% סוכרוז-PBS למשך הלילה ב-4°C.
    3. לאחר הגנה קריו-הגנה, הטמע את הדגימות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) ואחסן אותן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לחתך. חותכים פרוסות רקמה בעובי 20 מיקרומטר באמצעות הקפאה ואוספים אותם על שקופיות xylanized. אחסנו את המגלשות בטמפרטורה של -20°C עד שישמשו לצביעה.

5. אימונופלואורסנציה

  1. הסר את OCT. מהמקטעים עם תמיסת PBS עם 0.1% Triton X-100 (PBS-T) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  2. טפל בחלקים עם פתרון חסימה (BS) עם 2% BSA, 3% חמור בסרום PBS-T 0.01% פתרון למשך שעה אחת ב- RT.
  3. יש לדלל את הנוגדן הראשוני שנבחר (ראה טבלת חומרים) ב-BS ולדגור על דגימות למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
  4. למחרת, לשטוף את הדגימות 3 x 10 דקות ב 1x PBS ב RT.
  5. לדלל את הנוגדן המשני ב- BS ולדגור במשך שעתיים ב- RT (ראה טבלת חומרים).
  6. דגרו על הדגימות במשך 10 דקות עם 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי לסמן את גרעיני התא ב-RT, מדוללים ב-PBS-T בדילול של 1:1,000.
  7. הרכיבו את המגלשות עם אמצעי הרכבה וכסו בכיסויי זכוכית.
  8. צלם את כל התמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה ב- 2.5, 10, 20 ו- 40x.
  9. אחסנו את הפרוסות בטמפרטורה של 4°C.

6. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)

הערה: כדי להוכיח שההשתלה עבדה, בצעו צביעת H&E.

  1. הסר OCT עם PBS-T 0.1% למשך 10 דקות ב- RT.
  2. בצע התייבשות סדרתית במכסה מנוע באופן הבא: 10 דקות במים מזוקקים (DW), 45 שניות בהמטוקסילין, דקה אחת ב- DW, 20 שניות ב- PBS, 2 x 30 שניות ב- 70% EtOH, 2 x 30 שניות ב- 80% EtOH, 2 x 30 שניות ב- 96% EtOH, 30 שניות ב- eosin, 2 x 15 שניות ב- 96% EtOH, 2 x 15 שניות ב-100% EtOH, דקה אחת ב-xylol-100% ETOH, דקה אחת ב-xylol, דקה אחת ב-xylol (טרי).
  3. הרכיבו את כיסויי הזכוכית באמצעי הרכבה על בסיס קסילן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בחירת לוח הזמנים להבשלת העובר להשתלה
הניסוי מתחיל ב-D0 כאשר ביצים מופרות מודגרות בטמפרטורה של 38°C ו-60% לחות יחסית. הממברנה הכוריאואלנטואית (CAM) היא קרום חוץ-עוברי מאוד וסקולרי המתפתח לאחר דגירה של ביציות. הוא נוצר על ידי מיזוג של allantois ו chorion. ב-D1, לאחר 24 שעות של דגירה, תא האוויר מנוקב כדי למנוע מה-CAM להתחבר לקרום הקליפה הפנימי. ניקוב תא האוויר ב-D1 משפר את איכות תא האוויר בהשוואה לניקוב בשלבים מאוחרים יותר (D4). ה-CAM ממשיך לגדול עד D12, אז הוא עוטף את כל תכולת הביצה ונצמד בחוזקה לקרום הקליפה הפנימי (איור 1). החור שנוצר ב-D7 מוגדל כדי להקל על קציר הדגימות. D7 הוא הזמן האופטימלי להשתלה כאשר ה- CAM מגיע לבגרות ומכסה את שק החלמון ואת פני העובר. בשלב זה, חור תא האוויר מוגדל, והאורגנואידים מועברים ל- CAM בעזרת פיפטה אוטומטית.

השתלת אורגנואידים במוח
במהלך ההבשלה הטבועה של אורגנואידים במוח במבחנה, ההרכב התאי שלהם משתנה מאבות עצביים לנוירונים בוגרים ותאי גלייה. נוירו-וסקולטורה ונוירוגנזה הם תהליכים התפתחותיים מעורבים ותלויים זה בזה בבעלי חוליות, והאיתות המוביל לשיחה צולבת זו תלוי מאוד בשלב ההבשלה של המקבילה העצבית29. אבות עצביים הם המקור העיקרי לגורמים פרואנגיוגניים במוח המתפתח29,30. להיפך, נוירונים ואסטרוציטים תומכים בניאואנגיוגנזה בשלבים בוגרים ובבגרות באמצעות הפרשת גורם גדילה אנדותל כלי דם31,32. שינויים אלה בציטוארכיטקטורה של המוח, המשתקפים גם באורגנואידים במוח, עשויים להוביל לשינויים דיפרנציאליים באינטגרציה ובתגובה לחריטה של CAM, בהתאם לשלב ההבשלה של אורגנואידים במוח. לכן, השתלנו אורגנואידים במוח ביום התמיינות 13 במבחנה (DIV), כאשר תאים נוירואפיתליאליים וגליה רדיאלית מתרחבים; ב DIV 37, עם תחילת neurogenesis; ב DIV 60, כאשר נוירוגנזה היא חזקה נוירונים של זהויות שונות הם מובחנים סופנית; וב- DIV 120, כאשר שפע של נוירונים בוגרים מאכלסים את האורגנואיד, יצירת רשת עצבית מפותחת ואסטרוגנזה נפוצה גם היא.

בכל המקרים, הדגימות נאספו לאחר 5 ימים של דגירה ב ovo (DIO). כדי למנוע הטיות הנובעות מאפקט אצווה באורגנואידים במוח, כל ההשוואות בין אורגנואידים מושתלים ללא מושתלים בוצעו באותה אצווה באופן זוגי. אורגנואידים נגזרו משני ניסויים עצמאיים לפחות בכל נקודת זמן ובסך הכל שישה הבדלים בלתי תלויים. השתלה של שלבי הבשלה מרובים בוצעה במקביל בכל ניסוי השתלה. לאחר ההשתלה, אורגנואידים המשיכו את תהליך ההבשלה הסמוך לכלי הדם של CAM ללא כל עדות לחדירת כלי דם לתוך האורגנואיד (איור 2).

הישרדות אורגנואידים לאחר השתלה נעה בין 80% אצל הצעירים ביותר ויורדת ל~66% באורגנואידים בוגרים לאחר 5 ימים לאחר ההשתלה, דבר המצביע על כך שמתירנות ופלסטיות השתלת אורגנואידים עשויות להשתנות עם הזמן (טבלה 1). הכדאיות האורגנואידית נקבעה על ידי נוכחות גרעינים פיקנוטיים בכתמי H&E. מספר הגרעינים הפיקנוטיים היה דומה בין אורגנואידי הבקרה המושתלים לאורגנואידי הבקרה שלא הושתלו (איור 3), מה שמרמז על כך ש-CAM הוא מתירני לקיים את האורגנואיד החי לאחר ההשתלה. יתר על כן, לא זוהה שחרור היסטולוגי או המוגן ב- CAM, והעוברים נותרו בחיים, דבר המצביע על כך שלא הליך ההשתלה ולא האורגנואיד משבשים את שלמות ה- CAM או משפיעים באופן משמעותי על התפתחות העובר.

הרכב תאים באורגנואידים מושתלים במוח
לאורגנואידים לא מונחים במוח יש שונות תאית ניכרת בין ותוך אורגנואידים. עם זאת, הם בעיקר עצביים, ומייצרים גלים של אבות, נוירונים ואסטרוציטים בקצב רציף 2,26. לאחר מכן, הערכנו אם השתלה משנה את ההרכב העצבי באורגנואידים במוח. אורגנואידים צעירים יותר (13 DIV + 5 DIO: 18 ימים) אינם מראים הבדלים מאורגנואידי הבקרה שלהם שאינם מושתלים בנוכחות נוירונים (TUBB3+). בשלבי הבשלה מאוחרים יותר (60 DIV +5 DIO: 65 ימים ו-120 DIV + 5 DIO: 125 ימים), שיעור תאי העצב (TUBB3+) יורד באופן דרמטי בהשוואה לזה של אורגנואידים שאינם מושתלים (איור 4). באורגנואידים לא מושתלים שהבשילו ל-60 DIV, תאי עצב מפוזרים באופן נרחב בכל רחבי האורגנואידים.

יש לציין כי מספרם ולוקליזציה של אסטרוציטים חיוביים לחלבון גליה פיברילרי חומצי חיובי (GFAP+), העידו על עלייה בהשוואה לאלה שנצפו בקבוצת הביקורת שלא הושתלה. יתר על כן, אסטרוציטים אלה GFAP+ רכשו לוקליזציה בלתי צפויה בצד החיצוני של האורגנואיד. ב-18 DIV, אורגנואידים חופשיים (לא מושתלים), ניתן לראות מעט אסטרוציטים ולא ניתן היה לזהות התפלגות מבנית; להיפך, הם נראים מפוזרים בצורה הומוגנית ברחבי האורגנואיד (איור 3).

Figure 1
איור 1: ציר הזמן של הגדרת בדיקת CAM להשתלת אורגנואידים. (A) מריחת תחבושת דבק נייר כירורגי על גבי הביצה. (B) יצירת חור בקליפה עם מחט מעל תחבושת הדבק. (C) פתח את החלון של קליפת הביצה, מבט מלמעלה, מוכן להשתלה של (D) אורגנואיד מוח אנושי (יום 60). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (E) הדמיה של האורגנואיד המושתל ב- CAM לאחר 5 ימים של דגירה ב- ovo . (F) סימני היכר של התפתחות אורגנואידים במוח מהיום ה-0 עד היום ה-120. החץ מציין את מיקום האורגנואיד. קיצור: CAM = קרום chorioallantoic. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: צביעת המטוקסילין ואאוזין של אורגנואידים מושתלים בקרום הכוריאואלנטואי. (A) 13 DIV + 5 DIO organoid; (ב) 37 DIV + 5 DIO organoid; (C) 60 DIV + 5 DIO organoid; ו-(D) 120 DIV + 5 DIO organoid; ריבועים אדומים מסמנים את האורגנואיד. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. קיצורים: DIV = יום במבחנה; DIO = יום באובו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אימונוציטוכימיה של אורגנואידים בשלבי התפתחות שונים. GFAP שימש לצביעה ו-DAPI לגרעינים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (A,B) תמונות של אותו אורגנואיד מושתל 13 DIV + 5 DIO שבו אסטרוציטים נראים סביב קצה האורגנואיד. (C) תמונה של אורגנואיד חופשי 18 DIV שבו אסטרוציטים בקושי נראים. ההבדל בין אורגנואידים חופשיים ומושתלים בולט מאוד. (ד,ה) תמונות של אורגנואיד מושתל 37 DIV + 5 DIO שבו ניתן לראות מעט אסטרוציטים. (F) תמונה של אורגנואיד חופשי 42 DIV. חיצים צהובים מציינים את מיקומם של האסטרוציטים. קיצורים: DIV = יום במבחנה; DIO = יום באובו; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; GFAP = חלבון גליה פיברילרי חומצי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אימונוציטוכימיה של 120 אורגנואידים של DIV. TUBB3 שימש להכתמת תאי העצב ו-DAPI לגרעינים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר; התמונות צולמו במהירות של 20x. (A) אורגנואיד מושתל 120 DIV +5 DIO שבו ניתן לראות מעט נוירונים. (B) 125 DIV, אורגנואיד חופשי עם הרבה נוירונים. הכוכבית מציינת את מיקום האורגנואיד ואילו הקו המקווקו מייצג את הגבול בין האורגנואיד לבין ה-CAM (נקבע על ידי ניתוח היסטולוגי). קיצורים: DIV = יום במבחנה; DIO = יום באובו; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; CAM = קרום chorioallantoic. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

אורגנואידים 13 DIV 37 DIV 60 DIV 120 DIV
חי 6 (75%) 10 (83%) 6 (66%) 6 (66%)
מת 2 (25%) 2 (16%) 3 (34%) 3 (34%)

טבלה 1: שיעורי הישרדות עובריים לאחר השתלת אורגנואיד CAM. קיצורים: DIV = יום במבחנה; DIO = יום באובו; CAM = קרום chorioallantoic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עם שלבים מרכזיים רבים המספקים צמיחה והתפתחות חיובית של אורגנואידים במוח האנושי עם השתלתם מבלי להפריע להישרדותם של עוברי התרנגולות. המלצנו להשתמש במחטים סטריליות כדי לנקב את תא האוויר של הביצה לאחר 24 שעות של דגירה (יום 1). בנוסף, ניסינו גם לבצע את הניקור ביום 4 (לאחר בדיקה דרך קליפת הביצה באור כדי לבדוק את התפתחות כלי הדם כדי להיות בטוחים שאנחנו עובדים רק עם עוברים בריאים). עם זאת, הדבר הביא לירידה בכדאיות העובר בשל קרבתם של כלי הדם CAM לקליפת הביצה. יש לציין כי הפעלת כוח רב מדי עלולה לגרום לשבירת קליפת הביצה עם הנזק הבא של כלי הדם CAM. השימוש במקור אור לאיתור אזורים דלילים בקליפת הביצה סייע ליצירת חורים קהים ובו זמנית מנע חדירת יתר ומעבר דרך הביצה, מה שהוביל לפלישה ל-CAM.

למרות שסיבוב ביצים נראה חובה להתפתחות תקינה של עוברי התרנגולות במהלך הדגירה, יש להימנע מכך לאחר ניקוב תא האוויר. הסרת אלבומין לא הייתה מוצדקת עבור מודל זה וגם לא תוספת של PBS כדי למנוע התייבשות של הביצה. יתר על כן, השימוש בתמיסת אתנול 70% צריך להיעשות בחוכמה, עם זהירות יתרה לייבש כל תמיסת אתנול שנותרה על הקליפה כדי לשמור על הכדאיות העוברית. נקודה קריטית נוספת היא גודל חור קליפת הביצה המשמש לקליטה, מה שדורש איזון של החור הקטן ביותר האפשרי המאפשר את נוחות מניפולציית ההשתלה. בחירת השלב העוברי להשתלות (E7) הונעה על ידי שלב ההבשלה של ה- CAM וגודלו היחסי, לטובת שילוב השתל. עם זאת, במקרה בסופו של דבר שהאורגנואידים המושתלים דורשים זמן רב יותר בהבשלה, ניתן לבצע את ההשתלה ביום E5.5/6. השתנות אורגנואיד המוח מבוקרת כדי להבטיח את כדאיות הניסוי. אורגנואידים בני אותו גיל מציגים גדלים דומים, וחשוב לציין כי ללא קשר לגיל האורגנואידים, כולם הודגרו במשך 5 ימים לאחר ההשתלה. יתר על כן, עבור עקביות, אורגנואידי הבקרה נבחרו בקפידה כדי להתאים את הגודל המדויק של עמיתיהם המושתלים. היבט טכני נוסף, הרלוונטי לתמיכה בהישרדותם של האורגנואידים המושתלים והעובר, הוא סגירת חור ההשתלה עם חתיכה מרובעת של פרפילם, כדי לשמור על סביבה מבוקרת.

בניגוד להשערות הראשוניות שלנו, אורגנואידים צעירים שרדו טוב יותר לאחר תהליך ההשתלה ושילוב CAM מאשר המבוגרים יותר. שיערנו כי אורגנואידים צעירים הם פלסטיים יותר בשל נוכחותם המועשרת באבות בשלב מוקדם33, בעוד שתאי עצב בוגרים זקוקים לסביבה עצבית מתירנית לצורך תחזוקתם. יתר על כן, שינויים ציטוארכיטקטוניים בהשתלות אורגנואידים מוקדמות (D18) במוח התגלו בהתפלגות האסטרוציטים. יש לציין כי זיהינו כי אסטרוציטים התמינו בשלב מוקדם זה רק כאשר הושתלו והם פיזרו את עצמם כדי ליצור פסאודו-קפסולה מתחת לפני השטח של האורגנואידים. מבנה זה יכול להזכיר את הפוטנציאל של האורגנואיד ליצור ממשק נוירו-וסקולרי שיכול לחקות את מחסום הדם-מוח. לחלופין, התגובתיות המוגברת של אסטרוציטים, הממוקמים במבנה דמוי מחסום, יכולה להצביע על תגובה אימונוגנית של האורגנואיד לאיתות מופרש מה-CAM. עם זאת, נדרשת עבודה נוספת כדי להדגים השערה זו. לסיכום, מאמר זה מתאר את השלבים להשתלת אורגנואידים של שלבים התפתחותיים מרובים ב- CAM תרנגולת, שהם מצב מתירני יותר עבור אורגנואידים בהתפתחות מוקדמת, ואת ההשפעה התאית של השתלות אלה בנוירונים וב- GFAP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר אלקנטרה ולד"ר אורטגה מ-UB ולשאר החברים במעבדה של ד"ר אקוסטה על הדיונים מלאי התובנה. S.A. הוא סרה-האנטר עמית עוזר פרופסור מ Generalitat de Catalunya באוניברסיטת ברצלונה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse  BioLegend 801201 1:1,000
Anti-GFAP, rabbit GeneTex GTX108711 1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. Invitrogen A-21206 1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat Jackson ImmunoResearch 715-585-150 1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI Invitrogen D1306 1:10,000
DPX Sigma 100579 xylene-based mounting medium 
Gentle Dissociation Solution CreativeBiolabs ITS-0622-YT187 cell dissociation solution
Matrigel BD Biosciences 356234
Mowiol 4-88 mounting media Merk 81381
Paper towel, lab-grade Sigma-Aldrich Z188956
ROCK inhibitor Y27632 Millipore SCM075 10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors VWR 470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides Epredia J1800AMNZ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  3. Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. What makes organoids good models of human neurogenesis. Front Neurosci. 16, 872794 (2022).
  4. Sun, X. Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife. 11, e76707 (2022).
  5. Paredes, I., et al. Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk. Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).
  6. Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
  7. Apostolou, E., et al. Progress and challenges in stem cell biology. Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).
  8. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
  9. Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
  10. Shi, Y., et al. Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).
  11. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
  12. Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).
  13. Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).
  14. Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
  15. Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells. Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).
  16. Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).
  17. Kaisto, S., et al. Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging. J Vis Exp. (157), e60995 (2020).
  18. Varzideh, F., et al. Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants. Biomaterials. 192, 537-550 (2019).
  19. Komatsu, A., et al. The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine. Cells. 10 (10), 2613 (2021).
  20. Worsdorfer, P., et al. Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells. Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).
  21. Janzer, R. C., Jaff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
  22. Janzer, R. C. The blood-brain barrier: Cellular basis. J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).
  23. Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes. Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).
  24. Holash, J. A., Stewart, P. A. Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction. Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).
  25. Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction. Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).
  26. Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).
  27. Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane. Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).
  28. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
  29. Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. Neurovascular communication during cns development. Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).
  30. Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway. Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).
  31. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling. J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).
  32. Himmels, P., et al. Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord. Nat Commun. 8, 14583 (2017).
  33. Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 204
אורגנואיד מוח אנושי מוקדם לא מונחה מידול נישה נוירו-וסקולרית לתוך קרום עובר אפרוח מתירני Chorioallantoic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fiore, L., Arderiu, J.,… More

Fiore, L., Arderiu, J., Martí-Sarrias, A., Turpín, I., Pareja, R. I., Navarro, A., Holubiec, M., Bianchelli, J., Falzone, T., Spelzini, G., Scicolone, G., Acosta, S. Early Unguided Human Brain Organoid Neurovascular Niche Modeling into the Permissive Chick Embryo Chorioallantoic Membrane. J. Vis. Exp. (204), e65710, doi:10.3791/65710 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter