Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para enxertar organoides cerebrais humanos em múltiplos estágios de maturação na membrana corioalantóide (CAM) de pintinhos. Os organoides cerebrais foram cultivados seguindo protocolos padronizados não guiados.
Abstract
A enxertia de organoides em tecidos vascularizados em animais modelo, como a membrana corioalantóide (CAM) imunodeficiente de camundongos ou embriões de pintinhos, tem se mostrado eficiente para a modelagem da neovascularização. A CAM é uma membrana extraembrionária ricamente vascularizada, que apresenta imunorreatividade limitada, tornando-se um excelente modelo hospedeiro para transplantes de células de origem humana.
Este trabalho descreve a estratégia para enxertar organoides cerebrais humanos diferenciados em múltiplos estágios de maturação no MAC. A composição celular dos organoides cerebrais muda com o tempo, refletindo os marcos do desenvolvimento do cérebro humano. Nós enxertamos organoides cerebrais em estágios de maturação relevantes: expansão neuroepitelial (18 DIV), neurogênese precoce (60 DIV) e gliogênese precoce (180 DIV) na CAM de embriões embrionários dia (E)7 de galinha. Organoides cerebrais enxertados foram colhidos 5 dias depois e suas características histológicas foram analisadas.
Não foram detectados sinais histológicos de neovascularização nos organoides enxertados ou vasos sanguíneos anormais adjacentes aos enxertos. Além disso, mudanças marcantes foram observadas na composição celular dos organoides enxertados, a saber, um aumento no número de astrócitos gliais fibrilares ácidos-positivos-reativos. Entretanto, as alterações citoarquiteturais foram dependentes do estágio de maturação dos organoides. Em conjunto, esses resultados sugerem que organoides cerebrais podem crescer no MAC e mostram diferenças na citoarquitetura dependendo do estágio de maturação na enxertia.
Introduction
Os organoides cerebrais humanos são uma técnica emergente que nos permite recapitular in vitro o desenvolvimento inicial do cérebro humano 1,2,3. No entanto, uma das principais limitações desse modelo é a falta de vascularização, que desempenha papéis indispensáveis não só na homeostase cerebral, mas também no desenvolvimentocerebral4. Além da oferta de oxigênio e nutrientes, evidências acumuladas sugerem que o sistema vascular cerebral regula a diferenciação neural, migração e sinaptogênese durante o desenvolvimento 5,6. Portanto, há uma necessidade urgente de estabelecer modelos confiáveis que possam fornecer a sinalização e a estrutura vascular ausente aos organoides cerebrais, aumentando a complexidade da geração de organoides cerebrais humanos7.
Dentre os métodos de vascularização propostos, duas principais linhas de atuação podem ser consideradas: enxertia organoide em organismo vivo e tecnologias puramente in vitro co-cultivando células endoteliais e neurais8,9,10,11,12. O transplante intracerebral em camundongos é caro e demorado, tornando outras tecnologias relevantes para modelos mais simples. O ensaio de membrana corioalantóide (CAM) em pintinhos tem sido amplamente utilizado para estudar a angiogênese 13,14,15. Na última década, vários grupos enxertaram com sucesso diferentes tipos de organoides, incluindo organoidesrenais16,17, cardíacos18 e tumorais19,20, em CAMs. No entanto, pouco se sabe sobre a eficácia, toxicidade/rejeição, efeito fisiológico e métodos para enxertar organoides cerebrais humanos no CAM. Outro aspecto interessante e ainda inexplorado é a formação de uma barreira hematoencefálica quimérica (BHE) entre as MAC e a interface astrocitária organoide. Trabalhos pioneiros anteriores sugeriram a viabilidade putativa de gerar uma BBB na CAM por meio do transplante de astrócitos e meio condicionado por astrócitos 21,22,23. No entanto, astrócitos maduros parecem ser incapazes de atingir esseobjetivo 24,25. Assim, a formação induzida por astrócitos do BBB permanece discutível, e o transplante de organoides cerebrais humanos nos permitiria lançar luz sobre essa controvérsia.
Este artigo em vídeo descreve um protocolo para um transplante in ovo de organoides cerebrais humanos em CAM que promove crescimento, melhora e vascularização, resultando em organoides que englobam elementos BBB histologicamente compatíveis. Aqui, apresentamos um protocolo garantindo a sobrevivência do embrião de galinha e relatamos a permissividade da CAM para sustentar o crescimento organoide cerebral.
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Protocol
Os embriões de galinha-de-leghorn (Gallus gallus) foram tratados seguindo o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals do Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, EUA, e os experimentos foram aprovados pelo Council for Care and Use of Experimental Animals da Universidade de Barcelona.
1. Preparação organoide cerebral não guiada
- Manter as células estaminais embrionárias humanas H9 (hESCs) em mTESR1 pré-aquecidas à temperatura ambiente (RT) sob uma confluência de 70% em placas de 6 poços revestidas com Matrigel dissolvido em DMEM (1:40) numa incubadora de 5% CO2 a 37 °C.
OBS: O matrigel deve ser mantido em gelo até sua utilização como revestimento para evitar sua polimerização. - Gerar organoides cerebrais seguindo o protocolo cerebral não guiado 2.
- Dissociar H9 hESCs usando 500 μL da Solução de Dissociação Celular e incubar por 3-5 min a 37 °C. Ressuspender em mTESR1 contendo um inibidor de ROCK Y27632 (concentração final de 50 μM) e semear 9.000 células por poço em uma placa de 96 poços pré-tratada de baixa adesão.
- Uma vez que os organoides se agregam em mTESR1 contendo um inibidor de ROCK Y27632 (concentração final de 50 μM), transfira-os para o meio de indução por 5-6 dias.
- Seguindo protocolo organoide cerebral não guiado26, transferir os organoides para meios de indução neural em ~dias 4-5.
- Uma vez que eles adquirem o tamanho e o anel do neuroepitélio, transfira-os para uma gota de Matrigel gelada. Uma vez polimerizado o Matrigel, transferir os organoides para uma placa de Petri de baixa adesão de 5 cm com 5 mL de meio de maturação pré-aquecido.
- Após 4 dias, colocar os organoides cerebrais sob agitação orbitária.
- Coletar os organoides para colheita em DPBS fresco imediatamente antes da enxertia.
2. Manutenção, ativação do desenvolvimento e punção da casca do ovo
- Conservar os ovos fertilizados (no dia 0) numa incubadora a 18 °C até à utilização.
OBS: Nesta temperatura, não se desenvolvem, permanecendo no mesmo estágio de maturação. - Quando necessário para uso, incubá-los a 38 °C e 60% de umidade relativa com rotação de balanço suave em um ângulo de 45 °C.
- No dia 1, limpe a superfície da casca do ovo com etanol 70% e seque-a com um papel toalha para esterilizá-la.
- Coloque uma bandagem adesiva de papel cirúrgico, doravante denominada "bandagem", em cima do ovo, cobrindo a câmara de ar do ovo.
NOTA: Isso evitará que a poeira da casca do ovo caia no CAM onde fica presa. - Realizar a punção da perfuração da câmara de ar, doravante denominada furo da câmara de ar (ACH), com agulha estéril 21 G x 11/2'', puncionando suavemente a casca do ovo. Abra o ACH na ponta superior do ovo para não perturbar o CAM, que neste ponto fica separado da casca.
- Para encontrar a melhor posição para perfurar a ACH, use uma lâmpada para determinar a superfície mais fina da casca do ovo na ponta superior do ovo. A transmissão direta do feixe de luz indica a melhor posição para perfurar.
- Cubra o ACH com um novo curativo para proteger o embrião do ambiente externo e coloque o ovo de volta na incubadora.
- A partir deste momento, pare a rotação na incubadora e mantenha os ovos na posição vertical com a janela em cima.
NOTA: Isso facilitará o desenvolvimento do embrião, e a CAM fica disponível na parte superior com uma câmara de ar entre o embrião e a casca do ovo, permitindo a posterior enxertia. - Abra o ACH do dia 1 ao dia 4. A viabilidade aumenta no dia 4 (3 dias antes do dia da enxertia).
3. Enxerto organoide cerebral
- Realizar enxertia no 7º dia, quando a CAM estiver bem desenvolvida e vascularizada, cobrindo o óvulo por todo o embrião.
- Remova o curativo e limpe a superfície da casca do ovo com etanol a 70% para esterilizar a casca do ovo, antes de alargar cuidadosamente o ACH em uma janela de enxertia.
- Coloque um curativo novo e maior cobrindo a extensão além da janela final de enxertia para evitar que fragmentos de casca de ovo caiam na CAM enquanto amplia a janela de enxertia.
NOTA: Esta janela maior é necessária para selecionar a melhor posição de enxertia e para posterior enxertia. - Ampliar a janela de enxertia puncionando suavemente a casca do ovo até que a janela atinja um diâmetro de aproximadamente 2 cm. Remova suavemente as bordas da janela da casca do ovo com uma pinça até que a janela seja ampliada. Remova o pó restante e os pedaços de casca de ovo que permanecerão presos ao curativo, descascando suavemente o curativo.
- Coloque o organoide com uma pipeta automática P200. Corte as pontas com tesouras estéreis e afiadas para ampliar a abertura de acordo com o tamanho do organoide e evitar danos ao organoide ou use pontas estéreis de transferência de calibre largo. Coletar o organoide em um volume máximo de 50 μL de PBS e transferi-lo diretamente para o CAM, em um lado oposto ao local do embrião.
- Certifique-se de que a posição do enxerto esteja distante da gema para evitar sua ruptura durante a colheita e, de preferência, coloque-o próximo a um vaso sanguíneo.
- Coloque uma gota de 7 μL de Matrigel ao redor do organoide depois de colocar o organoide no CAM.
NOTA: Isso impedirá que o organoide se mova ao redor da membrana. - Feche a janela usando um pequeno pedaço de parafilme que se encaixe no tamanho exato da janela e prenda-o à concha com uma bandagem adesiva.
NOTA: É importante cobrir totalmente a janela com o parafilme para evitar que o embrião seque, permitindo a troca gasosa. Delimitar adequadamente a extensão da cobertura da janela, evitando ultrapassar a janela, pois poderia dificultar as trocas gasosas necessárias para o correto desenvolvimento embrionário27.
4. Colheita de organoides transplantados
- Colher os organoides enxertados e as CAM circunvizinhas no 12º dia de desenvolvimento do frango, correspondendo a 38 estádios de desenvolvimento de Hamburger e Hamilton (HH38)28, 5 dias após a enxertia. Nesta fase, a CAM é totalmente diferenciada com a vasculatura madura, enquanto os germes das penas cobrem as asas, bem como a pálpebra superior do embrião.
- Ao remover a bandagem adesiva, amplie ainda mais a janela para facilitar a colheita da amostra usando tesoura e pinça fina.
- Visualize o organoide com a ajuda de uma microscopia de dissecção binocular, se necessário, seguida por uma etapa de 2 minutos de prefixação com paraformaldeído (PFA) a 4% para ajudar na coleta de organoides e CAM.
- Coletar uma seção de 1,5 cm2 da CAM contendo o organoide.
- Fixação da amostra
- Lavar as amostras com 1x PBS e fixá-las com PFA a 4% (em PBS, pH 7,2) durante 30 min a 4 °C. Em seguida, lave as amostras por 3 x 5 min em PBS.
- Conservar as amostras a 4 °C em PBS com azida sódica ou crioprotegê-las directamente em 30% de sacarose-PBS durante a noite a 4 °C.
- Após a crioproteção, embuta as amostras em composto de temperatura de corte ideal (OCT) e armazene-as a -20 °C até a secção. Cortar fatias de tecido de 20 μm de espessura usando um criostato e coletá-las em lâminas xilanizadas. Conservar as lâminas a -20 °C até serem utilizadas para coloração.
5. Imunofluorescência
- Remover OCT das seções com uma solução de PBS com Triton X-100 a 0,1% (PBS-T) por 10 min à temperatura ambiente (TR).
- Tratar os cortes com uma solução de bloqueio (BS) com uma solução de BSA a 2%, soro de burro a 3% PBS-T 0,01% durante 1 h em RT.
- Diluir o anticorpo primário selecionado (ver Tabela de Materiais) em BS e incubar amostras durante a noite a 4 °C.
- No dia seguinte, lave as amostras 3 x 10 min em 1x PBS no RT.
- Diluir o anticorpo secundário em BS e incubar durante 2 h em RT (ver Tabela de Materiais).
- Incubar as amostras por 10 min com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para marcar os núcleos celulares em RT, diluídos em PBS-T na diluição de 1:1.000.
- Monte as corrediças com meio de montagem e cubra com lamínulas de vidro.
- Tire todas as imagens usando um microscópio de fluorescência de campo largo a 2,5, 10, 20 e 40x.
- Conservar as fatias a 4 °C.
6. Coloração para hematoxilina e eosina (H&E)
OBS: Para comprovar que a enxertia funcionou, realizar coloração de H&E.
- Remova a OCT com PBS-T 0,1% por 10 min no TR.
- Realizar a desidratação seriada em uma coifa da seguinte forma: 10 min em água destilada (DW), 45 s em hematoxilina, 1 min em PS, 20 s em PBS, 2 x 30 s em EtOH 70%, 2 x 30 s em EtOH 80%, 2 x 30 s em EtOH 96%, 30 s em eosina, 2 x 15 s em EtOH 96%, 2 x 15 s em EtOH 100%, 1 min em xilol-100% ETOH, 1 min em xilol, 1 min em xilol (fresco).
- Monte as lamínulas de vidro com um meio de montagem à base de xileno.
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Representative Results
Seleção do cronograma de maturação do embrião para o transplante
O experimento inicia-se em D0, quando os ovos fertilizados são incubados a 38 °C e 60% de umidade relativa. A membrana corioalantóide (MAC) é uma membrana extraembrionária altamente vascularizada que se desenvolve após a incubação dos ovos. É formado pela fusão do alantois e córion. Em D1, após 24 h de incubação, a câmara de ar é puncionada para impedir que a CAM se fixe à membrana interna do invólucro. A punção da câmara de ar em D1 melhora a qualidade da câmara de ar em comparação com a punção em estágios posteriores (D4). A CAM continua a crescer até D12, quando envolve todo o conteúdo do ovo e adere firmemente à membrana interna da casca (Figura 1). O furo feito no D7 é ampliado para facilitar a colheita da amostra. D7 é o momento ideal para a enxertia quando a CAM atinge a maturidade e cobre o saco vitelínico e a superfície do embrião. Nesta fase, o orifício da câmara de ar é ampliado e os organoides são transferidos para o CAM com a ajuda de uma pipeta automática.
Enxerto organoide cerebral
Ao longo da maturação inerente dos organoides cerebrais in vitro, sua composição celular muda de progenitores neurais para neurônios maduros e células gliais. Neurovasculatura e neurogênese são processos de desenvolvimento intermemeados e interdependentes em vertebrados, e a sinalização que leva a esse crosstalk é altamente dependente do estágio de maturação da contraparte neural29. Os progenitores neurais são a principal fonte de fatores pró-angiogênicos no cérebro em desenvolvimento29,30. Ao contrário, neurônios e astrócitos sustentam a neoangiogênese em estágios maduros e na idade adulta através da secreção do fator de crescimento endotelial vascular31,32. Essas alterações na citoarquitetura cerebral, que também se refletem nos organoides cerebrais, podem levar a mudanças diferenciais na integração e resposta ao enxerto de CAM, dependendo do estágio de maturação dos organoides cerebrais. Portanto, enxertamos organoides cerebrais no 13º dia de diferenciação in vitro (DIV), quando as células neuroepiteliais e a glia radial se expandem; na DIV 37, no início da neurogênese; na DIV 60, quando a neurogênese é robusta e neurônios de diferentes identidades são terminalmente diferenciados; e na DIV 120, quando uma infinidade de neurônios maduros está povoando o organoide, gerando uma rede neuronal bem desenvolvida e a astrogênese também é generalizada.
Em todos os casos, as amostras foram coletadas após 5 dias de incubação in ovo (DIO). Para evitar vieses devido ao efeito de lote em organoides cerebrais, todas as comparações entre organoides enxertados e não enxertados foram realizadas no mesmo lote de forma pareada. Os organoides foram derivados de pelo menos dois experimentos independentes por ponto de tempo e um total de seis diferenciações independentes. A enxertia de múltiplos estágios de maturação foi realizada em paralelo em cada experimento de enxertia. Após a enxertia, os organoides continuaram o processo de maturação adjacente aos vasos das MAC, sem qualquer evidência de infiltração dos vasos sanguíneos no organoide (Figura 2).
A sobrevida dos organoides na enxertia varia de 80% nos mais jovens e cai para ~66% nos organoides maduros após 5 dias após a enxertia, sugerindo que a permissividade e a plasticidade da enxertia organoide podem mudar ao longo do tempo (Tabela 1). A viabilidade organoide foi determinada pela presença de núcleos picnóticos nas colorações de H&E. O número de núcleos picnóticos foi semelhante entre organoides controles transplantados e não transplantados (Figura 3), sugerindo que a CAM é permissiva para sustentar o organoide vivo no momento do transplante. Além disso, nenhuma liberação histológica ou hemogênica foi detectada no MAC e os embriões permanecem vivos, sugerindo que nem o procedimento de enxertia nem o organoide interrompem a integridade das MAC ou afetam significativamente o desenvolvimento embrionário.
Composição celular em organoides cerebrais enxertados
Os organoides cerebrais não guiados têm uma marcada variabilidade celular inter e intraorganóide. No entanto, são predominantemente neurais, gerando ondas de progenitores, neurônios e astrócitos em ritmo sequencial 2,26. Em seguida, avaliamos se o enxerto altera a composição neural nos organoides cerebrais. Organoides mais jovens (13 DIV + 5 DIO: 18 dias) não apresentam diferenças em relação aos organoides não enxertados controles na presença de neurônios (TUBB3+). Nos estágios maturacionais mais tardios (60 DIV +5 DIO: 65 dias e 120 DIV + 5 DIO: 125 dias), a proporção de neurônios (TUBB3+) é drasticamente reduzida em comparação com a dos organoides não enxertados (Figura 4). Em organoides não enxertados maturados para 60 DIV, os neurônios estão amplamente espalhados por todos os organoides.
Notavelmente, o número e a localização dos astrócitos gliais fibrilares ácidos-positivos para proteína ácida (GFAP+) evidenciaram um aumento em comparação com aqueles observados nos controles não enxertados. Além disso, esses astrócitos GFAP+ adquiriram uma localização inesperada na face externa do organoide. Em 18 DIV, organoides livres (não enxertados), poucos astrócitos podem ser vistos e nenhuma distribuição estrutural pôde ser detectada; ao contrário, apresentam-se homogeneamente espalhados por todo o organoide (Figura 3).
Figura 1: Linha do tempo da configuração do ensaio CAM para transplante de organoides. (A) Aplicação de atadura adesiva de papel cirúrgico na parte superior do ovo. (B) Fazer um furo na concha com uma agulha sobre a bandagem adesiva. (C) Abra a janela da casca do ovo, vista de cima, pronta para o transplante de um (D) organoide cerebral humano (dia 60). Barra de escala = 100 μm. (E) Visualização do organoide enxertado na CAM após 5 dias de incubação in ovo . (F) Características do desenvolvimento organoide cerebral do Dia 0 ao Dia 120. A seta indica a localização do organoide. Abreviação: CAM = membrana corioalantóide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Coloração hematoxilina e eosina dos organoides enxertados na membrana corioalantóide. (A) organoide 13 DIV + 5 DIO; (B) organoide 37 DIV + 5 DIO; (C) organoide 60 DIV + 5 DIO; e (D) organoide 120 DIV + 5 DIO; quadrados vermelhos marcam o organoide. Barra de escala = 500 μm. Abreviações: DIV = dia in vitro; DIO = dia em ovo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imunocitoquímica de organoides em diferentes estágios de desenvolvimento. GFAP foi usado para coloração e DAPI para os núcleos. Barra de escala = 100 μm. (A,B) Imagens do mesmo organoide enxertado com 13 DIV + 5 DIO onde os astrócitos são vistos ao redor da borda do organoide. (C) Imagem de 18 organoides livres de DIV onde os astrócitos são pouco visíveis. A diferença entre organoides livres e enxertados é muito perceptível. (D,E) Imagens de 37 DIV + 5 DIO enxertado organoide onde poucos astrócitos podem ser vistos. (F) Imagem de 42 organoides livres de DIV. As setas amarelas indicam a localização dos astrócitos. Abreviações: DIV = dia in vitro; DIO = dia em ovo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; GFAP = proteína glial fibrilar ácida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imunocitoquímica de 120 organoides DIV. TUBB3 foi usado para coloração dos neurônios e DAPI para os núcleos. Barra de escala = 100 μm; as imagens foram obtidas a 20x. (A) A 120 DIV +5 DIO enxertado organoide onde poucos neurônios podem ser vistos. (B) A 125 DIV, organoide livre com abundância de neurônios. O asterisco indica a localização do organoide, enquanto a linha tracejada representa o limite entre o organoide e a CAM (determinado por análise histológica). Abreviações: DIV = dia in vitro; DIO = dia em ovo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; CAM = membrana corioalantóide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Organoides | 13 DIV | 37 DIV | 60 DIV | 120 DIV |
| Vivo | 6 (75%) | 10 (83%) | 6 (66%) | 6 (66%) |
| Morto | 2 (25%) | 2 (16%) | 3 (34%) | 3 (34%) |
Tabela 1: Taxas de sobrevida embrionária após enxertia organoide CAM. Abreviações: DIV = dia in vitro; DIO = dia em ovo; CAM = membrana corioalantóide.
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Discussion
Neste estudo, descrevemos um protocolo detalhado com inúmeras etapas fundamentais que proporcionam crescimento e desenvolvimento favoráveis de organoides cerebrais humanos após a enxertia sem perturbar a sobrevivência dos embriões de galinha. Recomendamos o uso de agulhas estéreis para puncionar a câmara de ar do ovo após 24 h de incubação (dia 1). Além disso, também tentamos fazer a punção no 4º dia (após verificar a casca do ovo com luz para testar o desenvolvimento da vasculatura para ter certeza de que estávamos trabalhando apenas com embriões saudáveis). No entanto, isso resultou em um declínio na viabilidade embrionária devido à proximidade dos vasos CAM com a casca do ovo. Deve-se notar que a aplicação de muita força pode resultar na quebra da casca do ovo com o subsequente dano da vasculatura CAM. O uso de uma fonte de luz para detectar áreas adelgaçadas da casca do ovo foi útil para fazer furos rombos e, ao mesmo tempo, evitar a superpenetração e a passagem através do ovo, levando à invasão do CAM.
Embora a rotação de ovos pareça obrigatória para o desenvolvimento adequado dos embriões de galinha durante a incubação, é necessário evitá-la após a punção da câmara de ar. A remoção de albumina não foi justificada para este modelo nem a adição de PBS para evitar a desidratação do ovo. Além disso, o uso de solução de etanol a 70% deve ser feito com sabedoria, com cuidado extra para secar qualquer solução de etanol remanescente na casca para preservar a viabilidade embrionária. Outro ponto crítico é o tamanho do orifício da casca do ovo utilizado para a enxertia, que requer o balanceamento do menor orifício possível que permita o conforto da manipulação da enxertia. A seleção do estádio embrionário para enxertos (E7) foi orientada pelo estágio de maturação das MAC e seu tamanho relativo, favorecendo a integração do transplante. Entretanto, caso os organoides transplantados necessitem de maior tempo na ovomaturação , a enxertia pode ser realizada no dia E5.5/6. A variabilidade organoide cerebral é controlada para garantir a viabilidade experimental. Organoides da mesma idade apresentam tamanhos semelhantes, sendo importante ressaltar que, independentemente da idade dos organoides, todos foram incubados por 5 dias após o transplante. Além disso, para consistência, os organoides controle foram meticulosamente escolhidos para corresponder ao tamanho exato de seus homólogos enxertados. Outro aspecto técnico, relevante para apoiar a sobrevivência tanto dos organoides enxertados quanto do embrião, é o fechamento do orifício de enxertia com um pedaço quadrado de parafilme, para manter um ambiente controlado in ovo .
Ao contrário de nossas hipóteses iniciais, organoides jovens sobreviveram melhor após o processo de enxertia e integração das MAC do que os mais velhos. Levantamos a hipótese de que organoides mais jovens são mais plásticos devido à sua presença enriquecida em progenitores em estágio inicial33, enquanto neurônios maduros requerem um ambiente neuronal permissivo para sua manutenção. Além disso, alterações citoarquiteturais nos enxertos organoides cerebrais precoces (D18) foram detectadas na distribuição dos astrócitos. Notavelmente, detectamos que os astrócitos se diferenciaram nessa fase inicial apenas quando enxertados e se distribuíram para gerar uma pseudocápsula sob a superfície organoide. Essa estrutura poderia ser uma reminiscência do potencial do organoide em gerar uma interface neurovascular que pudesse mimetizar a BHE. Alternativamente, o aumento da reatividade dos astrócitos, posicionados em uma estrutura semelhante a uma barreira, poderia ser indicativo de uma resposta imunogênica do organoide à sinalização secretada pelo CAM. No entanto, mais trabalhos são necessários para demonstrar essa hipótese. Em resumo, este trabalho descreve os passos para enxertar organoides de múltiplos estágios de desenvolvimento no CMA de galinha, sendo uma situação mais permissiva para organoides de desenvolvimento inicial, e o efeito celular desses enxertos em neurônios e GFAP.
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Disclosures
Os autores não relatam conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Alcántara e ao Dr. Ortega do UB e ao resto dos membros do laboratório do Dr. Acosta pelas discussões perspicazes. S.A. é professor assistente da Generalitat de Catalunya da Universitat de Barcelona.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
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