Ex Vivo Calciumbeeldvorming voor Drosophila-model van epilepsie
Summary
Hier presenteren we een protocol voor ex vivo calciumbeeldvorming bij volwassen Drosophila met GCaMP6-expressie om epileptiforme activiteiten te monitoren. Het protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van ictale gebeurtenissen bij volwassen Drosophila door middel van ex vivo calciumbeeldvorming, waardoor de mogelijke mechanismen van epilepsie op cellulair niveau kunnen worden onderzocht.
Abstract
Epilepsie is een neurologische aandoening die wordt gekenmerkt door terugkerende aanvallen, gedeeltelijk gecorreleerd met genetische oorsprong, die wereldwijd meer dan 70 miljoen mensen treft. Ondanks het klinische belang van epilepsie, moet de functionele analyse van neurale activiteit in het centrale zenuwstelsel nog worden ontwikkeld. Recente ontwikkelingen in beeldvormingstechnologie, in combinatie met stabiele expressie van genetisch gecodeerde calciumindicatoren, zoals GCaMP6, hebben een revolutie teweeggebracht in de studie van epilepsie op zowel hersenbrede als eencellige resolutieniveaus. Drosophila melanogaster is naar voren gekomen als een hulpmiddel voor het onderzoeken van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan epilepsie vanwege de geavanceerde moleculaire genetica en gedragstesten. In deze studie presenteren we een nieuw en efficiënt protocol voor ex vivo calciumbeeldvorming bij volwassen Drosophila die GCaMP6 tot expressie brengt om epileptiforme activiteiten te monitoren. Het hele brein is voorbereid op cac, een bekend epilepsie-gen, knockdown-vliegen voor calciumbeeldvorming met een confocale microscoop om de neurale activiteit te identificeren als vervolg op de knalgevoelige aanvalsachtige gedragstest. De cac-knockdown-vliegen vertoonden een hogere mate van epileptisch gedrag en abnormale calciumactiviteiten, waaronder meer grote pieken en minder kleine pieken dan wild-type vliegen. De calciumactiviteiten waren gecorreleerd met epileptisch gedrag. Deze methodologie dient als een efficiënte methodologie bij het screenen van de pathogene genen op epilepsie en het onderzoeken van het mogelijke mechanisme van epilepsie op cellulair niveau.
Introduction
Epilepsie, een complexe chronische neurologische aandoening die wordt gekenmerkt door de herhaling van spontane en niet-uitgelokte aanvallen en afwijkende neuronale netwerkactiviteit, heeft wereldwijd meer dan 70 miljoen mensen getroffen, waardoor het een van de meest voorkomende neurologischeaandoeningen is 1 en leidt tot de zware lasten van gezinnen en de samenleving. Met het oog op de impact van epilepsie zijn er veel onderzoeken uitgevoerd om de etiologie van aanvallen te identificeren, waarvan genetica is goedgekeurd als een primaire oorzaak van vele soorten epilepsie of epileptische syndromen2. In de afgelopen decennia heeft de vooruitgang in genomische technologieën geleid tot een snelle toename van de ontdekking van nieuwe epilepsie-geassocieerde genen, die een cruciale rol spelen bij het optreden van aanvallen, waaronder ionkanalen en niet-ionkanaalgenen 3,4. De onderliggende mechanismen en functionele analyse tussen de genen en epileptische fenotypes worden echter niet volledig begrepen. Het identificeren van epilepsie-geassocieerde genen en mechanismen biedt de mogelijkheid om patiënten efficiënt te behandelen 5,6.
Cytosolische calciumsignalen zijn cruciale elementen in neuronale activiteit en synaptische transmissie. Calciumbeeldvorming, waaronder hersenplakjes7, in vivo 8,9 en ex vivo10, wordt sinds de jaren 1970 gebruikt om neuronale activiteit11 te volgen als een marker voor neuronale prikkelbaarheid12,13. Recente ontwikkelingen in beeldvormingstechnologie, in combinatie met de genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI’s), zoals GCaMP6, hebben een revolutie teweeggebracht in de studie van epilepsie op zowel hersenbrede als eencellige resolutieniveaus 14,15,16, die een hoge mate van spatiotemporele precisie heeft. Veranderingen in calciumconcentratie en transiënten werden waargenomen in actiepotentialen en synaptische transmissie, respectievelijk14, wat aangeeft dat de verandering van intracellulaire calciumspiegels een strikte correlatie vertoont met de elektrische prikkelbaarheid van neuronen17,18. Calciumbeeldvorming is ook toegepast als een ontwikkelingsaanvalsmodel9 en uitgevoerd in Drosophila voor het screenen van anticonvulsieve stoffen19.
Drosophila melanogaster is naar voren gekomen als een krachtig modelorganisme in wetenschappelijk onderzoek, zoals epilepsie, vanwege zijn geavanceerde moleculaire genetica en gedragstesten 20,21,22. Bovendien hebben de geavanceerde genetische hulpmiddelen in Drosophila bijgedragen aan de expressie van de genetisch gecodeerde calciumindicator GCaMP6. De op Gal4 en UAS gebaseerde binaire transcriptiesystemen maken bijvoorbeeld specifieke expressie van de GCaMP6 mogelijk op een ruimtelijk en temporeel gecontroleerde manier. Aangezien Drosophila een klein organisme is, vereist in vivo calciumbeeldvorming bekwame operatievaardigheden om een chirurgische ingreep uit te voeren, waarbij slechts een klein deel van de dorsale hersenhelft werd blootgesteld door een klein venster14,23. Tegelijkertijd kan ex vivo calciumbeeldvorming in de intacte hersenen van Drosophila worden gebruikt om de interessegebieden (ROI’s) van de hele hersenen te volgen.
In deze studie presenteren we ex vivo calciumbeeldvorming bij volwassen Drosophila die GCaMP6 tot expressie brengt om epileptiforme activiteiten te monitoren. CACNA1A een bekend epilepsie-gen is, behoort cac tot het Cav2-kanaal, dat een homoloog is voor CACNA1A. We begonnen met het ontleden van de hersenen van cac knockdown vliegen tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi en beeldden ze af met behulp van een confocale microscoop met xyt-scanmodus. Vervolgens analyseerden we de veranderingen in calciumsignalen van ROI’s door indicatoren te berekenen die spontane aanvalsachtige gebeurtenissen kwantificeren, zoals %ΔF/F-waarde en calciumgebeurtenissen van GCaMP6-fluorescentie. Daarnaast voerden we mechanische stimulus uit door een vortexmachine om aanvalsgedragstests op cac-knockdown-vliegen te induceren en om de resultaten van calciumbeeldvorming te valideren. Over het algemeen biedt dit protocol een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van ictale gebeurtenissen bij volwassen Drosophila door middel van ex vivo calciumbeeldvorming, waardoor de mogelijke mechanismen van epilepsie op cellulair niveau kunnen worden onderzocht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het calciumion dient als een cruciale tweede boodschapper en speelt een cruciale rol in een reeks fysiologische en pathofysiologische reacties op zowel chemische als elektrische verstoringen. Bovendien is het topologische element van de presynaptische P/Q-kanalen, gecodeerd door het menselijke CACNA1A-gen, geïdentificeerd als verantwoordelijk voor het mediëren van de afvoer van verschillende neurotransmitters, waaronder glutamaat 30,31,32, en is het nauw verbonden met <sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (subsidie nr. 2022A1515111123 aan Jing-Da Qiao) en is van plan het wetenschappelijk onderzoek in GMU (Jing-Da Qiao) te verbeteren. Dit werk werd ook ondersteund door het Guangzhou Medical University Student Innovation Ability Enihancement Plan (financieringsnummer 02-408-2304-02038XM).
Materials
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O’brien, T. J., Sander, J. W. Epilepsy in adults. Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al. Epilepsy-associated genes. Seizure. 44, 11-20 (2017).
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O’dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O’dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -. Q., Lin, Y. -. M., Zhang, X. -. X., Peng, R. -. C., Qiao, J. -. D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i., Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. Plos Genetics. 15 (11), e1008421 (2019).
