Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie
Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die ex vivo Kalziumbildgebung in GCaMP6-exprimierenden adulten Drosophila vor, um epileptiforme Aktivitäten zu überwachen. Das Protokoll bietet ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von iktalen Ereignissen in adulten Drosophila durch ex vivo Kalzium-Bildgebung und ermöglicht die Erforschung der potenziellen Mechanismen der Epilepsie auf zellulärer Ebene.
Abstract
Epilepsie ist eine neurologische Erkrankung, die durch wiederkehrende Anfälle gekennzeichnet ist, die teilweise mit dem genetischen Ursprung korrelieren und weltweit über 70 Millionen Menschen betreffen. Trotz der klinischen Bedeutung der Epilepsie muss die funktionelle Analyse der neuronalen Aktivität im zentralen Nervensystem noch entwickelt werden. Jüngste Fortschritte in der Bildgebungstechnologie in Kombination mit einer stabilen Expression genetisch kodierter Kalziumindikatoren wie GCaMP6 haben die Untersuchung von Epilepsie sowohl bei der Auflösung des Gehirns als auch bei Einzelzellen revolutioniert. Drosophila melanogaster hat sich aufgrund seiner ausgefeilten Molekulargenetik und Verhaltensassays zu einem Werkzeug zur Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen entwickelt, die Epilepsie zugrunde liegen. In dieser Studie stellen wir ein neuartiges und effizientes Protokoll für die ex vivo Kalzium-Bildgebung in GCaMP6-exprimierender adulter Drosophila vor, um epileptiforme Aktivitäten zu überwachen. Das gesamte Gehirn wird aus cac, einem bekannten Epilepsie-Gen, präpariert, Knockdown-Fliegen für die Kalzium-Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop, um die neuronale Aktivität als Folgemaßnahme zum knallsensitiven anfallsähnlichen Verhaltenstest zu identifizieren. Die cac-knockdown-Fliegen zeigten eine höhere Rate an anfallsartigem Verhalten und abnormalen Kalziumaktivitäten, einschließlich mehr großer Stacheln und weniger kleiner Stacheln als Wildtyp-Fliegen. Die Kalziumaktivitäten korrelierten mit anfallsähnlichem Verhalten. Diese Methodik dient als effiziente Methodik, um die pathogenen Gene auf Epilepsie zu untersuchen und den potenziellen Mechanismus der Epilepsie auf zellulärer Ebene zu erforschen.
Introduction
Epilepsie, eine komplexe chronische neurologische Erkrankung, die durch das Wiederauftreten spontaner und unprovozierter Anfälle und abnormer neuronaler Netzwerkaktivität gekennzeichnet ist, hat weltweit über 70 Millionen Menschen betroffen, was sie zu einer der häufigsten neurologischenErkrankungen 1 macht und zu schweren Belastungen für Familien und Gesellschaft führt. Unter Berücksichtigung der Auswirkungen von Epilepsie wurden viele Studien durchgeführt, um die Ätiologie von Anfällen zu identifizieren, von denen die Genetik als Hauptursache für viele Arten von Epilepsien oder epileptischen Syndromen zugelassen wurde2. In den letzten Jahrzehnten haben Fortschritte in der Genomtechnologie zu einem raschen Anstieg der Entdeckung neuer Epilepsie-assoziierter Gene geführt, die eine entscheidende Rolle beim Auftreten von Anfällen spielen, einschließlich Ionenkanälen und Nicht-Ionenkanal-Genen 3,4. Die zugrundeliegenden Mechanismen und die funktionelle Analyse zwischen den Genen und den epileptischen Phänotypen sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Die Identifizierung von Epilepsie-assoziierten Genen und Mechanismen bietet die Möglichkeit, Patienten effizient zu behandeln 5,6.
Zytosolische Kalziumsignale sind zentrale Elemente der neuronalen Aktivität und der synaptischen Übertragung. Seit den 1970er Jahren wird die Kalzium-Bildgebung, einschließlich Gehirnschnitte7, in vivo 8,9 und ex vivo10, zur Überwachung der neuronalen Aktivität11 als Marker für neuronale Erregbarkeit eingesetzt12,13. Jüngste Fortschritte in der Bildgebungstechnologie in Kombination mit den genetisch kodierten Kalziumindikatoren (GECIs) wie GCaMP6 haben die Untersuchung von Epilepsie sowohl bei der hirnweiten als auch bei der Einzelzellauflösungrevolutioniert 14,15,16, was ein hohes Maß an raumzeitlicher Präzision aufweist. Es wurden Veränderungen der Kalziumkonzentration und der Transienten in den Aktionspotentialen bzw. der synaptischen Übertragung beobachtet14, was darauf hindeutet, dass die Veränderung des intrazellulären Kalziumspiegels eine strikte Korrelation mit der elektrischen Erregbarkeit von Neuronen aufweist17,18. Die Kalzium-Bildgebung wurde auch als Entwicklungsanfallsmodell9 angewendet und in Drosophila zum Screening von krampflösenden Substanzen durchgeführt19.
Drosophila melanogaster hat sich aufgrund seiner ausgefeilten molekulargenetischen und Verhaltenstests zu einem leistungsstarken Modellorganismus in der wissenschaftlichen Forschung, wie z. B. Epilepsie, entwickelt 20,21,22. Darüber hinaus haben die fortschrittlichen genetischen Werkzeuge in Drosophila zur Expression des genetisch kodierten Kalziumindikators GCaMP6 beigetragen. Zum Beispiel ermöglichen die Gal4- und UAS-basierten binären Transkriptionssysteme eine spezifische Expression des GCaMP6 auf räumlich und zeitlich kontrollierte Weise. Da es sich bei Drosophila um einen winzigen Organismus handelt, erfordert die In-vivo-Kalziumbildgebung kompetente chirurgische Fähigkeiten, um einen chirurgischen Eingriff durchzuführen, bei dem nur ein kleiner Teil des dorsalen Gehirns durch ein kleines Fenster freigelegt wurde14,23. Gleichzeitig kann die Ex-vivo-Kalziumbildgebung im intakten Gehirn von Drosophila verwendet werden, um die Regionen von Interesse (ROIs) des gesamten Gehirns zu überwachen.
In dieser Studie präsentieren wir ex vivo Calcium-Imaging in GCaMP6-exprimierenden adulten Drosophila, um epileptiforme Aktivitäten zu überwachen. CACNA1A ein bekanntes Epilepsie-Gen ist, gehört cac zum Cav2-Kanal, der ein Homolog zu CACNA1A ist. Wir begannen damit, die Gehirne von cac-knockdown-Fliegen tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi zu sezieren und sie mit einem konfokalen Mikroskop im xyt-Scanning-Modus abzubilden. Anschließend analysierten wir die Veränderungen der Kalziumsignale von ROIs, indem wir Indikatoren berechneten, die spontane anfallsartige Ereignisse quantifizieren, wie z.B. den %ΔF/F-Wert und Kalziumereignisse der GCaMP6-Fluoreszenz. Zusätzlich führten wir einen mechanischen Stimulus mit einer Vortex-Maschine durch, um Tests zum Anfallsverhalten an Cac-Knockdown-Fliegen zu induzieren und die Ergebnisse der Kalziumbildgebung zu validieren. Insgesamt bietet dieses Protokoll ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von iktalen Ereignissen in adulten Drosophila durch ex vivo Kalzium-Bildgebung, was die Erforschung der potenziellen Mechanismen der Epilepsie auf zellulärer Ebene ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Kalziumion dient als entscheidender zweiter Botenstoff und spielt eine zentrale Rolle bei einer Reihe von physiologischen und pathophysiologischen Reaktionen auf chemische und elektrische Störungen. Darüber hinaus wurde das topologische Element der präsynaptischen P/Q-Kanäle, das vom menschlichen CACNA1A-Gen kodiert wird, als verantwortlich für die Vermittlung der Ausschüttung verschiedener Neurotransmitter, einschließlich Glutamat 30,31,32, identifiziert und ist eng mit Epilepsie verbunden<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (Fördernummer 2022A1515111123 an Jing-Da Qiao) unterstützt und plant, die wissenschaftliche Forschung in GMU (Jing-Da Qiao) zu verbessern. Diese Arbeit wurde auch durch den Student Innovation Ability Enihancement Plan der Guangzhou Medical University (Fördernummer 02-408-2304-02038XM) unterstützt.
Materials
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
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