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Neuroscience

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウ ジョウバエ モデルに対するカルシウムイメージング

Published: October 13, 2023
doi:
10.3791/65825
, , , , ,
1Department of Neurology, Institute of Neuroscience, Key Laboratory of Neurogenetics and Channelopathies of Guangdong Province and the Ministry of Education of China,the Second Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, 2The Second Clinical Medicine School of Guangzhou Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases,The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 4Key Laboratory for Reproductive Medicine of Guangdong Province,The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

Summary

ここでは、てんかん様活性をモニターするために、GCaMP6を発現する成虫ショウジョウバエのex vivoカルシウムイメージングのプロトコルを紹介します。プロトコルは細胞レベルでのてんかんの潜在的なメカニズムの調査を可能にする前の生体内カルシウムイメージ投射によって大人のショウジョウバエのictalでき事を調査するための貴重な用具を提供する。

Abstract

てんかんは、発作の再発を特徴とする神経疾患であり、遺伝的起源と部分的に相関しており、世界中で7,000万人以上が罹患しています。てんかんの臨床的重要性にもかかわらず、中枢神経系における神経活動の機能分析はまだ開発されていません。近年のイメージング技術の進歩は、GCaMP6などの遺伝的にコードされたカルシウム指標の安定発現と相まって、脳全体および単一細胞の分解能レベルでてんかんの研究に革命をもたらしました。ショウジョウバエは、その高度な分子遺伝学と行動アッセイにより、てんかんの根底にある分子および細胞メカニズムを調査するためのツールとして登場しました。この研究では、GCaMP6を発現する成虫ショウジョウバエのex vivoカルシウムイメージングのための新しい効率的なプロトコルを提示し、てんかん様活性を監視します。脳全体は、よく知られているてんかん遺伝子であるcacから調製され、共焦点顕微鏡でカルシウムイメージングを行い、前髪感受性発作様行動アッセイのフォローアップとして神経活動を特定します。CACノックダウンバエは、野生型ハエよりも発作様行動と異常なカルシウム活性の割合が高く、大きなトゲが多く、小さなトゲが少ないなどを示しました。カルシウム活性は発作様行動と相関していた。この方法論は、てんかんの病原性遺伝子をスクリーニングし、細胞レベルでてんかんの潜在的なメカニズムを探る上で効率的な方法論として機能します。

Introduction

てんかんは、自発的な発作や予期せぬ発作の再発や神経回路の異常な活動を特徴とする複雑な慢性神経疾患で、世界中で7,000万人以上が罹患しており、最も一般的な神経疾患1の1つであり、家族や社会の負担が大きい疾患となっています。てんかんの影響を考慮して、発作の病因を特定するために多くの研究が行われており、遺伝学は多くの種類のてんかんまたはてんかん症候群の主な原因として承認されています2。過去数十年にわたり、ゲノム技術の進歩により、イオンチャネル遺伝子や非イオンチャネル遺伝子など、発作の発生に重要な役割を果たす新しいてんかん関連遺伝子の発見が急速に増加しています3,4。しかし、遺伝子とてんかん表現型の間の根本的なメカニズムと機能解析は完全には理解されていません。てんかん関連の遺伝子とメカニズムを特定することは、患者の効率的な管理の可能性を提供します5,6。

細胞質カルシウムシグナルは、ニューロンの活動とシナプス伝達における極めて重要な要素です。1970年代以降、脳スライス7、in vivo8,9、およびex vivo10を含むカルシウムイメージングは、ニューロンの興奮性のマーカーとしてニューロン活動11をモニターするために利用されてきた12,13。近年のイメージング技術の進歩は、GCaMP6などの遺伝子コードカルシウム指標(GECI)と組み合わせることで、脳全体および単一細胞の解像度レベル14,15,16の両方で、時空間精度の高いてんかんの研究に革命をもたらしました。カルシウム濃度の変化と過渡現象は、それぞれ活動電位とシナプス伝達に観察され14、細胞内カルシウムレベルの変化がニューロンの電気的興奮性と厳密な相関関係を示すことを示している17,18。カルシウムイメージングは、発生発作モデル9としても適用されており、抗けいれん性化合物のスクリーニングのためにショウジョウバエで実施されている19。

ショウジョウバエは、その高度な分子遺伝学と行動アッセイのために、てんかんなどの科学研究における強力なモデル生物として浮上しています20,21,22。さらに、ショウジョウバエの高度な遺伝学的ツールは、遺伝的にコードされたカルシウム指標GCaMP6の発現に貢献しています。例えば、Gal4およびUASベースのバイナリ転写系は、空間的および時間的に制御された方法でGCaMP6の特異的な発現を可能にします。ショウジョウバエは小さな生物であるため、in vivoカルシウムイメージングは、脳の背側のごく一部のみが小さな窓を通して露出した外科的介入を行うために熟練した操作技術を必要とする14,23。同時に、ショウジョウバエの無傷の脳におけるex vivoカルシウムイメージングを使用して、脳全体の関心領域(ROI)をモニターできます。

本研究では、GCaMP6を発現する成体ショウジョウバエのex vivoカルシウムイメージングを行い、てんかん様活性をモニタリングする。CACNA1Aよく知られているてんかん遺伝子であるCACは、CACNA1Aの相同体であるCav2チャネルに属しています。まず、cacノックダウンハエtub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAiの脳を解剖し、xytスキャンモードの共焦点顕微鏡を使用してイメージングしました。次に、GCaMP6蛍光の%ΔF/F値やカルシウムイベントなど、自然発作様事象を定量化する指標を計算することにより、ROIのカルシウムシグナルの変化を解析しました。また、ボルテックスマシンによる機械的刺激を行い、カックノックダウンバエの発作行動試験を行い、カルシウムイメージングの結果を検証しました。全体として、このプロトコルは、ex vivoカルシウムイメージングを通じて成虫ショウジョウバエの発作イベントを調査するための貴重なツールを提供し、細胞レベルでのてんかんの潜在的なメカニズムの調査を可能にします。

Protocol

1. 前髪感受性アッセイのプロトコール Gal4/UASシステム21を介して、tub-Gal4ドライバーラインとUAS-cac-RNAiラインを交差させることにより、実験用ハエを確立します。tub-Gal4系統の処女バエとUAS-cac-RNAi系統のオスバエを採集します。次に、処女と雄のハエを同じバイアルに移して子孫を収穫します。注: tub-Gal4 ドライバーラ?…

Representative Results

このプロトコルを用いて、 cac ノックダウンハエはWTハエよりも有意に高い発作様行動を示すことがわかった(17.00 ± 2.99 [n = 6] vs 4.50 ± 2.03 [n = 6]; P = 0.0061;スチューデントのt検定、 図1A)。ほとんどのtub-Gal4>UAS-cac-RNAi ハエは1〜5秒以内に回復し、 UAS-cac-RNAi ハエは2秒以内に回復します。1秒以内の cac ノックダウンフライの回収?…

Discussion

カルシウムイオンは重要なセカンドメッセンジャーとして機能し、化学的および電気的摂動の両方に対するさまざまな生理学的および病態生理学的応答において極めて重要な役割を果たします。さらに、ヒトCACNA1A遺伝子によってコードされるシナプス前P/Qチャネルのトポロジカル要素は、グルタミン酸30,31,32を含む…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、広東省基礎応用基礎研究基金会(助成金番号2022A1515111123 to Jing-Da Qiao)の支援を受けており、GMU(Jing-Da Qiao)の科学研究を強化する計画です。この研究は、広州医科大学学生イノベーション能力強化計画(資金番号02-408-2304-02038XM)の支援も受けました。

Materials

Brushes Panera AAhc022-2 for handling flies
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C4901
Confocal microscope SP8; Zeiss, Jena, Germany. N/A for calcium imaging
CO2 anesthesia machine N/A N/A for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder N/A N/A handmade, for mounting the brain
Culture vials Biologix 51-0500 2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA version: 2.14.0 for analysis
Fly morgue N/A N/A handmade, for handling flies
Fly stocks cac-RNAi 27244 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks GCaMP6m 42750 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks tub-Gal4 N/A from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose Sigma-Aldrich G8270
High-resolution camera N/A N/A for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine Sigma-Aldrich L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2) Sigma-Aldrich M1028
Papain suspension Worthington Biochemical LS003126
Petri dishes Sigma-Aldrich SLW1480/02D for dissection
Pipette Thermo Scientific 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Recording dish Thermo Scientific 150682- Glass Based Dish for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S8282
Stereo-binocular microscope SHANG GUANG XTZ-D for handling flies and dissection
Syringe needles pythonbio HCL0693 for dissection
Tripod WEIFENG 45634732523 for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich Z653438 for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard N/A N/A handmade, foam pad or paper for background
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References

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He, M., Liu, C., Zhang, X., Lin, Y., Mao, Y., Qiao, J. Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy. J. Vis. Exp. (200), e65825, doi:10.3791/65825 (2023).
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