Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상
Summary
여기에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생체 외 칼슘 이미징을 통해 성인 초파리의 ictal 사건을 조사하는 데 유용한 도구를 제공하여 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐구할 수 있도록 합니다.
Abstract
간질은 재발성 발작을 특징으로 하는 신경 장애로, 유전적 기원과 부분적으로 관련이 있으며 전 세계적으로 7천만 명 이상의 개인에게 영향을 미칩니다. 간질의 임상적 중요성에도 불구하고 중추 신경계의 신경 활동에 대한 기능적 분석은 여전히 개발되어야 합니다. GCaMP6와 같은 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표의 안정적인 발현과 함께 이미징 기술의 최근 발전은 뇌 전체 및 단일 세포 해상도 수준 모두에서 간질 연구에 혁명을 일으켰습니다. Drosophila melanogaster는 정교한 분자 유전학 및 행동 분석으로 인해 간질의 기저에 있는 분자 및 세포 메커니즘을 조사하기 위한 도구로 등장했습니다. 이 연구에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징을 위한 새롭고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 뇌 전체는 잘 알려진 간질 유전자인 cac로 준비되며, 강타 민감성 발작 유사 행동 분석의 후속 조치로 신경 활동을 식별하기 위해 컨포칼 현미경으로 칼슘 이미징을 위해 녹다운 파리를 만듭니다. cac 넉다운 파리는 야생형 파리보다 더 큰 스파이크와 더 적은 작은 스파이크를 포함하여 발작과 유사한 행동과 비정상적인 칼슘 활동의 비율이 더 높았습니다. 칼슘 활동은 발작과 유사한 행동과 상관관계가 있었다. 이 방법론은 간질에 대한 병원성 유전자를 스크리닝하고 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐색하는 데 효율적인 방법론 역할을 합니다.
Introduction
간질은 자발적이고 이유 없는 발작과 비정상적인 신경 네트워크 활동의 재발을 특징으로 하는 복잡한 만성 신경 장애로, 전 세계적으로 7천만 명 이상의 개인에게 영향을 미치며 가장 흔한 신경 질환중 하나이며1 가족과 사회에 큰 부담을 줍니다. 뇌전증의 영향을 고려하여 발작의 원인을 규명하기 위한 많은 연구가 수행되었으며, 그 중 유전학은 많은 유형의 간질 또는 간질 증후군의 주요 원인으로 승인되었다2. 지난 수십 년 동안 게놈 기술의 발전으로 인해 이온 채널 및 비이온 채널 유전자를 포함하여 발작 발생에 중요한 역할을 하는 새로운 간질 관련 유전자의 발견이 급격히 증가했습니다 3,4. 그러나 유전자와 간질 표현형 사이의 근본적인 메커니즘과 기능 분석은 완전히 이해되지 않았습니다. 뇌전증 관련 유전자 및 기전을 규명하는 것은 환자를 효율적으로 관리할 수 있는 가능성을 제공한다 5,6.
세포질 칼슘 신호는 신경 활동과 시냅스 전달의 중추적인 요소입니다. 뇌 절편(brain slices)7, 생체 내(in vivo)8,9 및 생체내 e-x vivo(10)를 포함하는 칼슘 이미징(calcium imaging)은 1970년대 이래로 신경 세포 흥분성의 표지자로서 신경 활동(neuronal activity)11을 모니터링하기 위해 이용되어 왔다12,13. GCaMP6와 같은 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(GECI)와 결합된 이미징 기술의 최근 발전은 높은 수준의 시공간 정밀도를 가진 뇌 전체 및 단일 세포 해상도 수준 14,15,16 모두에서 간질 연구에 혁명을 일으켰습니다. 칼슘 농도와 과도현상의 변화는 활동 전위와 시냅스 전달에서 각각 관찰되었으며,14 이는 세포 내 칼슘 수준의 변화가 뉴런의 전기적 흥분성과 엄격한 상관 관계를 나타낸다는 것을 나타낸다17,18. 칼슘 영상은 또한 발달 발작 모델(developmental seizure model)9로 적용되었으며, 항경련 화합물(anticonvulsive compounds)을 스크리닝하기 위해 초파리(Drosophila)에서 수행되었다19.
Drosophila melanogaster는 정교한 분자 유전학 및 행동 분석20,21,22로 간질과 같은 과학 연구에서 강력한 모델 유기체로 부상하고 있습니다. 또한, 초파리의 고급 유전 도구는 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표 GCaMP6의 발현에 기여했습니다. 예를 들어, Gal4 및 UAS 기반 바이너리 전사 시스템은 공간적, 시간적으로 제어되는 방식으로 GCaMP6의 특정 발현을 가능하게 합니다. 초파리는 아주 작은 유기체이기 때문에, 생체 내 칼슘 이미징은 외과적 개입을 수행하기 위해 능숙한 수술 기술을 필요로 하는데, 이 수술에서는 뇌의 등쪽의 작은 부분만이 작은 창을 통해 노출되었다14,23. 동시에 초파리의 온전한 뇌에서 생체 외 칼슘 이미징을 사용하여 전체 뇌의 관심 영역(ROI)을 모니터링할 수 있습니다.
이 연구에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징을 제시합니다. CACNA1A 잘 알려진 간질 유전자이며, cac는 CACNA1A에 대한 상동체인 Cav2 채널에 속합니다. 우리는 cac 넉다운 파리 tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi의 뇌를 해부하고 xyt 스캐닝 모드의 컨포칼 현미경을 사용하여 이미징하는 것으로 시작했습니다. 그런 다음 %ΔF/F 값 및 GCaMP6 형광의 칼슘 이벤트와 같은 자발적 발작 유사 이벤트를 정량화하는 지표를 계산하여 ROI의 칼슘 신호 변화를 분석했습니다. 또한 칼슘 이미징 결과를 검증하기 위해 cac-knockdown 파리에 대한 발작 행동 테스트를 유도하기 위해 vortex machine에 의한 기계적 자극을 수행했습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 체외 칼슘 이미징을 통해 성인 초파리의 ictal 사건을 조사하는 데 유용한 도구를 제공하여 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐색할 수 있도록 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
칼슘 이온은 화학적 및 전기적 섭동에 대한 다양한 생리학적 및 병태생리학적 반응에서 중추적인 역할을 하는 중요한 두 번째 메신저 역할을 합니다. 또한, 인간 CACNA1A 유전자에 의해 암호화되는 시냅스전 P/Q 채널의 위상 요소는 글루타메이트30,31,32를 포함한 다양한 신경 전달 물질의 배출을 매개하는 것으로 확인되었?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 광둥 기초 및 응용 기초 연구 재단(Jing-Da Qiao에 보조금 번호 2022A151111123)의 지원을 받았으며 GMU(Jing-Da Qiao)의 과학 연구를 강화할 계획입니다. 이 작업은 광저우 의과대학 학생 혁신 능력 향상 계획(자금 지원 번호 02-408-2304-02038XM)의 지원도 받았습니다.
Materials
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O’brien, T. J., Sander, J. W. Epilepsy in adults. Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al. Epilepsy-associated genes. Seizure. 44, 11-20 (2017).
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O’dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O’dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -. Q., Lin, Y. -. M., Zhang, X. -. X., Peng, R. -. C., Qiao, J. -. D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i., Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. Plos Genetics. 15 (11), e1008421 (2019).
