Ex Vivo Imagerie calcique pour le modèle d’épilepsie de la drosophile
Summary
Nous présentons ici un protocole d’imagerie calcique ex vivo chez la drosophile adulte exprimant GCaMP6 pour surveiller les activités épileptiformes. Le protocole fournit un outil précieux pour étudier les événements ictaux chez la drosophile adulte par imagerie calcique ex vivo , permettant d’explorer les mécanismes potentiels de l’épilepsie au niveau cellulaire.
Abstract
L’épilepsie est un trouble neurologique caractérisé par des crises récurrentes, partiellement corrélées à l’origine génétique, affectant plus de 70 millions de personnes dans le monde. Malgré l’importance clinique de l’épilepsie, l’analyse fonctionnelle de l’activité neuronale dans le système nerveux central reste à développer. Les progrès récents de la technologie d’imagerie, combinés à l’expression stable d’indicateurs calciques génétiquement codés, tels que GCaMP6, ont révolutionné l’étude de l’épilepsie à l’échelle du cerveau et à l’échelle d’une cellule. Drosophila melanogaster est apparu comme un outil pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à l’épilepsie en raison de sa génétique moléculaire sophistiquée et de ses tests comportementaux. Dans cette étude, nous présentons un protocole novateur et efficace pour l’imagerie calcique ex vivo chez la drosophile adulte exprimant GCaMP6 afin de surveiller les activités épileptiformes. Le cerveau entier est préparé à partir de cac, un gène bien connu de l’épilepsie, pour l’imagerie calcique avec un microscope confocal afin d’identifier l’activité neuronale à la suite du test de comportement de type crise sensible à la bang. Les mouches knockdown cac ont montré un taux plus élevé de comportement convulsif et d’activités calciques anormales, y compris plus de gros pics et moins de petits pics que les mouches de type sauvage. Les activités calciques étaient corrélées à un comportement semblable à celui des crises. Cette méthodologie est une méthodologie efficace pour le criblage des gènes pathogènes de l’épilepsie et l’exploration du mécanisme potentiel de l’épilepsie au niveau cellulaire.
Introduction
L’épilepsie, un trouble neurologique chronique complexe caractérisé par la récurrence de crises spontanées et non provoquées et une activité aberrante des réseaux neuronaux, a touché plus de 70 millions de personnes dans le monde, ce qui en fait l’unedes maladies neurologiques les plus courantes 1 et entraîne le lourd fardeau des familles et de la société. Compte tenu de l’impact de l’épilepsie, de nombreuses études ont été menées pour identifier l’étiologie des crises, dont la génétique a été approuvée comme cause principale de nombreux types d’épilepsies ou de syndromes épileptiques2. Au cours des dernières décennies, les progrès des technologies génomiques ont conduit à une augmentation rapide de la découverte de nouveaux gènes associés à l’épilepsie, qui jouent un rôle crucial dans l’apparition des crises, y compris les canaux ioniques et les gènes des canaux non ioniques 3,4. Cependant, les mécanismes sous-jacents et l’analyse fonctionnelle entre les gènes et les phénotypes épileptiques ne sont pas complètement compris. L’identification des gènes et des mécanismes associés à l’épilepsie offre la possibilité d’une prise en charge efficace des patients 5,6.
Les signaux calciques cytosoliques sont des éléments essentiels de l’activité neuronale et de la transmission synaptique. L’imagerie calcique, y compris les tranches de cerveau7, in vivo 8,9 et ex vivo10, est utilisée pour surveiller l’activité neuronale11 en tant que marqueur de l’excitabilité neuronale depuis les années 197012,13. Les progrès récents de la technologie d’imagerie, en combinaison avec les indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI), tels que GCaMP6, ont révolutionné l’étude de l’épilepsie à la fois à l’échelle du cerveau et à des niveaux de résolution unicellulaire 14,15,16, qui a un haut niveau de précision spatio-temporelle. Des changements dans la concentration de calcium et les transitoires ont été observés dans les potentiels d’action et la transmission synaptique, respectivement14, indiquant que l’altération des niveaux de calcium intracellulaire présente une corrélation stricte avec l’excitabilité électrique des neurones17,18. L’imagerie calcique a également été appliquée comme modèle de crise développementale9 et réalisée chez la drosophile pour le criblage de composés anticonvulsifs19.
Drosophila melanogaster est en train de devenir un puissant organisme modèle dans la recherche scientifique, comme l’épilepsie, pour sa génétique moléculaire sophistiquée et ses tests comportementaux 20,21,22. De plus, les outils génétiques avancés chez la drosophile ont contribué à l’expression de l’indicateur calcique génétiquement codé GCaMP6. Par exemple, les systèmes transcriptionnels binaires basés sur Gal4 et UAS permettent une expression spécifique du GCaMP6 d’une manière contrôlée spatialement et temporellement. Étant donné que la drosophile est un organisme minuscule, l’imagerie calcique in vivo nécessite des compétences opérationnelles compétentes pour effectuer une intervention chirurgicale, dans laquelle seule une petite partie de la dorsale du cerveau a été exposée à travers une petite fenêtre14,23. Dans le même temps, l’imagerie calcique ex vivo dans le cerveau intact de la drosophile peut être utilisée pour surveiller les régions d’intérêt (ROI) de l’ensemble du cerveau.
Dans cette étude, nous présentons l’imagerie calcique ex vivo chez la drosophile adulte exprimant GCaMP6 pour surveiller les activités épileptiformes. CACNA1A est un gène bien connu de l’épilepsie, le cac appartient au canal Cav2, qui est un homologue de CACNA1A. Nous avons commencé par disséquer le cerveau de mouches knockdown cac tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi et les imager à l’aide d’un microscope confocal avec mode de balayage xyt. Nous avons ensuite analysé les changements dans les signaux calciques des ROI en calculant des indicateurs qui quantifient les événements spontanés de type convulsive, tels que la valeur %ΔF/F et les événements calciques de la fluorescence GCaMP6. De plus, nous avons effectué un stimulus mécanique à l’aide d’une machine vortex pour induire des tests de comportement de crise sur des mouches cac-knockdown afin de valider les résultats de l’imagerie calcique. Dans l’ensemble, ce protocole fournit un outil précieux pour l’étude des événements ictaux chez la drosophile adulte par imagerie calcique ex vivo , permettant d’explorer les mécanismes potentiels de l’épilepsie au niveau cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ion calcium sert de deuxième messager crucial, jouant un rôle central dans une gamme de réponses physiologiques et physiopathologiques aux perturbations chimiques et électriques. De plus, l’élément topologique des canaux P/Q présynaptiques, codé par le gène CACNA1A humain, a été identifié comme responsable de la médiation de la décharge de divers neurotransmetteurs, dont le glutamate 30,31,32, et est étroitement lié à l’épilepsie</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par la Fondation de recherche fondamentale et appliquée du Guangdong (subvention n° 2022A1515111123 à Jing-Da Qiao) et prévoient de renforcer la recherche scientifique en GMU (Jing-Da Qiao). Ce travail a également été soutenu par le plan d’amélioration de la capacité d’innovation des étudiants de l’Université de médecine de Guangzhou (financement n° 02-408-2304-02038XM).
Materials
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
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