Ex Vivo Imagem de cálcio para Drosophila Modelo de Epilepsia
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta que expressam GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para investigar eventos ictais em adultos com Drosophila através de imagens ex vivo de cálcio, permitindo a exploração dos potenciais mecanismos de epilepsia em nível celular.
Abstract
A epilepsia é um distúrbio neurológico caracterizado por crises recorrentes, parcialmente correlacionadas com a origem genética, afetando mais de 70 milhões de indivíduos em todo o mundo. Apesar da importância clínica da epilepsia, a análise funcional da atividade neural no sistema nervoso central ainda precisa ser desenvolvida. Avanços recentes na tecnologia de imagem, em combinação com a expressão estável de indicadores de cálcio codificados geneticamente, como o GCaMP6, revolucionaram o estudo da epilepsia em níveis de resolução de células únicas e cerebrais. Drosophila melanogaster tem emergido como uma ferramenta para investigar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à epilepsia devido à sua sofisticada genética molecular e ensaios comportamentais. Neste estudo, apresentamos um protocolo novo e eficiente para imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta com GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. Todo o cérebro é preparado a partir de cac, um gene bem conhecido da epilepsia, moscas knockdown para imagens de cálcio com um microscópio confocal para identificar a atividade neural como um acompanhamento do ensaio de comportamento semelhante a uma convulsão sensível ao bang. As moscas knockdown mostraram uma taxa mais alta de comportamento semelhante a convulsões e atividades anormais de cálcio, incluindo mais picos grandes e menos pequenos picos do que moscas selvagens. As atividades de cálcio foram correlacionadas com o comportamento semelhante a uma crise. Esta metodologia serve como uma metodologia eficiente na triagem de genes patogênicos para epilepsia e na exploração do mecanismo potencial da epilepsia em nível celular.
Introduction
A epilepsia, uma complexa desordem neurológica crônica caracterizada pela recorrência de crises espontâneas e não provocadas e atividade aberrante da rede neuronal, tem afetado mais de 70 milhões de indivíduos em todo o mundo, tornando-se uma das doenças neurológicas mais comuns1 e levando à sobrecarga das famílias e da sociedade. Em consideração ao impacto da epilepsia, muitos estudos têm sido realizados para identificar a etiologia das crises, cuja genética tem sido aprovada como causa primária de muitos tipos de epilepsias ou síndromes epilépticas2. Nas últimas décadas, os avanços nas tecnologias genômicas levaram a um rápido aumento na descoberta de novos genes associados à epilepsia, que desempenham um papel crucial na ocorrência de crises, incluindo canais iônicos e genes de canais não iônicos 3,4. No entanto, os mecanismos subjacentes e a análise funcional entre os genes e fenótipos epilépticos são incompletamente compreendidos. A identificação de genes e mecanismos associados à epilepsia oferece a possibilidade de um manejo eficiente dos pacientes 5,6.
Sinais citosólicos de cálcio são elementos fundamentais na atividade neuronal e transmissão sináptica. A imagem do cálcio, incluindo os cortes cerebrais7, in vivo8,9 ee x vivo10, tem sido utilizada para monitorar a atividade neuronal11 como marcador de excitabilidade neuronal desde a década de 197012,13. Avanços recentes na tecnologia de imagem, em combinação com os indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs), como o GCaMP6, revolucionaram o estudo da epilepsia em níveis de resolução de células únicas e cerebrais 14,15,16, que apresenta um alto nível de precisão espaço-temporal. Alterações na concentração de cálcio e transientes foram observados nos potenciais de ação e transmissão sináptica, respectivamente14, indicando que a alteração dos níveis intracelulares de cálcio apresenta estreita correlação com a excitabilidade elétrica dos neurônios17,18. A cintilografia com cálcio também tem sido aplicada como modelo de crise do desenvolvimento9 e realizada em Drosophila para triagem de compostos anticonvulsivantes19.
Drosophila melanogaster vem emergindo como um poderoso organismo modelo em pesquisas científicas, como a epilepsia, por sua sofisticada genética molecular e ensaios comportamentais20,21,22. Além disso, as ferramentas genéticas avançadas em Drosophila têm contribuído para a expressão do indicador de cálcio codificado geneticamente GCaMP6. Por exemplo, os sistemas transcricionais binários baseados em Gal4 e UAS permitem a expressão específica do GCaMP6 de forma controlada espacial e temporalmente. Como a Drosophila é um organismo minúsculo, a imagem do cálcio in vivo requer habilidades operacionais proficientes para realizar uma intervenção cirúrgica, na qual apenas uma pequena parte do dorso do cérebro foi exposta através de uma pequena janela14,23. Ao mesmo tempo, imagens de cálcio ex vivo no cérebro intacto de Drosophila podem ser usadas para monitorar as regiões de interesse (ROIs) de todo o cérebro.
Neste estudo, apresentamos imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta que expressam GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. CACNA1A é um gene bem conhecido da epilepsia, o cac pertence ao canal Cav2, que é um homólogo ao CACNA1A. Começamos dissecando os cérebros de moscas knockdown cac tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi e imageando-os usando um microscópio confocal com modo de varredura xyt. Em seguida, analisamos as mudanças nos sinais de cálcio das ROIs por meio do cálculo de indicadores que quantificam eventos espontâneos semelhantes a crises, como o valor de %ΔF/F e eventos de cálcio da fluorescência GCaMP6. Adicionalmente, realizamos estímulos mecânicos por máquina de vórtice para induzir testes de comportamento convulsivo em moscas cac-knockdown, bem como para validar os resultados da imagem de cálcio. Em geral, este protocolo fornece uma ferramenta valiosa para investigar eventos ictais em adultos Drosophila através de imagens de cálcio ex vivo, permitindo a exploração dos mecanismos potenciais da epilepsia em nível celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
O íon cálcio serve como um segundo mensageiro crucial, desempenhando um papel fundamental em uma série de respostas fisiológicas e fisiopatológicas a perturbações químicas e elétricas. Além disso, o elemento topológico dos canais P/Q pré-sinápticos, codificado pelo gene CACNA1A humano, tem sido identificado como responsável pela descarga de vários neurotransmissores, incluindo o glutamato 30,31,32, e está intimamente ligado à epilepsia<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Investigação Básica e Básica Aplicada de Guangdong (bolsa n.º 2022A1515111123 a Jing-Da Qiao) e pretende melhorar a investigação científica em GMU (Jing-Da Qiao). Este trabalho também foi apoiado pelo Plano de Capacitação de Inovação de Estudantes da Universidade de Medicina de Guangzhou (Financiamento No. 02-408-2304-02038XM).
Materials
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O’brien, T. J., Sander, J. W. Epilepsy in adults. Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al. Epilepsy-associated genes. Seizure. 44, 11-20 (2017).
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O’dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O’dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -. Q., Lin, Y. -. M., Zhang, X. -. X., Peng, R. -. C., Qiao, J. -. D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i., Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. Plos Genetics. 15 (11), e1008421 (2019).
