Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per l’imaging del calcio ex vivo in Drosophila adulta che esprime GCaMP6 per monitorare le attività epilettiformi. Il protocollo fornisce uno strumento prezioso per studiare gli eventi ictali nella Drosophila adulta attraverso l’imaging del calcio ex vivo , consentendo l’esplorazione dei potenziali meccanismi dell’epilessia a livello cellulare.
Abstract
L’epilessia è un disturbo neurologico caratterizzato da convulsioni ricorrenti, parzialmente correlate all’origine genetica, che colpisce oltre 70 milioni di individui in tutto il mondo. Nonostante l’importanza clinica dell’epilessia, l’analisi funzionale dell’attività neurale nel sistema nervoso centrale deve ancora essere sviluppata. I recenti progressi nella tecnologia di imaging, in combinazione con l’espressione stabile di indicatori di calcio geneticamente codificati, come GCaMP6, hanno rivoluzionato lo studio dell’epilessia sia a livello cerebrale che a livello di risoluzione di una singola cellula. La Drosophila melanogaster è emersa come strumento per studiare i meccanismi molecolari e cellulari alla base dell’epilessia grazie alla sua sofisticata genetica molecolare e ai suoi saggi comportamentali. In questo studio, presentiamo un nuovo ed efficiente protocollo per l’imaging del calcio ex vivo in Drosophila adulta che esprime GCaMP6 per monitorare le attività epilettiformi. L’intero cervello viene preparato da cac, un noto gene dell’epilessia, moscerini knockdown per l’imaging del calcio con un microscopio confocale per identificare l’attività neurale come follow-up del test comportamentale simile a un attacco sensibile al bang. Le mosche knockdown del CAC hanno mostrato un tasso più elevato di comportamento simile a convulsioni e attività anomale del calcio, tra cui picchi più grandi e meno picchi piccoli rispetto ai moscerini wild-type. Le attività del calcio sono state correlate a un comportamento simile a quello delle convulsioni. Questa metodologia funge da metodologia efficiente per lo screening dei geni patogeni per l’epilessia e per l’esplorazione del potenziale meccanismo dell’epilessia a livello cellulare.
Introduction
L’epilessia, una complessa malattia neurologica cronica caratterizzata dalla ricorrenza di convulsioni spontanee e non provocate e da un’attività aberrante della rete neuronale, ha colpito oltre 70 milioni di persone in tutto il mondo, rendendola unadelle malattie neurologiche più comuni e portando ai pesanti fardelli delle famiglie e della società. In considerazione dell’impatto dell’epilessia, sono stati condotti molti studi per identificare l’eziologia delle convulsioni, di cui la genetica è stata approvata come causa primaria di molti tipi di epilessie o sindromi epilettiche2. Negli ultimi decenni, i progressi nelle tecnologie genomiche hanno portato a un rapido aumento della scoperta di nuovi geni associati all’epilessia, che svolgono un ruolo cruciale nell’insorgenza delle crisi, compresi i canali ionici e i geni dei canali non ionici 3,4. Tuttavia, i meccanismi sottostanti e l’analisi funzionale tra i geni e i fenotipi epilettici non sono completamente compresi. L’identificazione dei geni e dei meccanismi associati all’epilessia offre la possibilità di gestire i pazienti in modo efficiente 5,6.
I segnali citosolici del calcio sono elementi fondamentali nell’attività neuronale e nella trasmissione sinaptica. L’imaging del calcio, comprese le fette cerebrali7, in vivo 8,9 e ex vivo10, è stato utilizzato per monitorare l’attività neuronale11 come marcatore per l’eccitabilità neuronale dal 197012,13. I recenti progressi nella tecnologia di imaging, in combinazione con gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), come GCaMP6, hanno rivoluzionato lo studio dell’epilessia sia a livello cerebrale che a livello di singola cellula 14,15,16, che ha un alto livello di precisione spazio-temporale. Cambiamenti nella concentrazione di calcio e nei transienti sono stati osservati rispettivamente nei potenziali d’azione e nella trasmissione sinaptica14, indicando che l’alterazione dei livelli intracellulari di calcio mostra una stretta correlazione con l’eccitabilità elettrica dei neuroni 17,18. L’imaging del calcio è stato anche applicato come modello di convulsionedello sviluppo 9 ed eseguito in Drosophila per lo screening di composti anticonvulsivanti19.
La Drosophila melanogaster sta emergendo come un potente organismo modello nella ricerca scientifica, come l’epilessia, per la sua sofisticata genetica molecolare e i saggi comportamentali 20,21,22. Inoltre, gli strumenti genetici avanzati di Drosophila hanno contribuito all’espressione dell’indicatore di calcio codificato geneticamente GCaMP6. Ad esempio, i sistemi trascrizionali binari basati su Gal4 e UAS consentono un’espressione specifica del GCaMP6 in modo spazialmente e temporalmente controllato. Poiché la Drosophila è un organismo minuscolo, l’imaging del calcio in vivo richiede competenze operative competenti per eseguire un intervento chirurgico, in cui solo una piccola parte della dorsale del cervello è stata esposta attraverso una piccola finestra14,23. Allo stesso tempo, l’imaging del calcio ex vivo nel cervello intatto di Drosophila può essere utilizzato per monitorare le regioni di interesse (ROI) dell’intero cervello.
In questo studio, presentiamo l’imaging del calcio ex vivo in Drosophila adulta esprimente GCaMP6 per monitorare le attività epilettiformi. CACNA1A è un noto gene dell’epilessia, il cac appartiene al canale Cav2, che è un omologo di CACNA1A. Abbiamo iniziato sezionando il cervello dei moscerini knockdown cac tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi e impersonandoli utilizzando un microscopio confocale con modalità di scansione xyt. Abbiamo quindi analizzato i cambiamenti nei segnali di calcio delle ROI calcolando indicatori che quantificano gli eventi spontanei simili alle convulsioni, come il valore %ΔF/F e gli eventi di calcio della fluorescenza GCaMP6. Inoltre, abbiamo eseguito uno stimolo meccanico con una macchina a vortice per indurre test di comportamento convulsivo su mosche cac-knockdown e per convalidare i risultati dell’imaging del calcio. Nel complesso, questo protocollo fornisce uno strumento prezioso per studiare gli eventi ictali nella Drosophila adulta attraverso l’imaging del calcio ex vivo , consentendo l’esplorazione dei potenziali meccanismi dell’epilessia a livello cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo ione calcio funge da secondo messaggero cruciale, svolgendo un ruolo fondamentale in una serie di risposte fisiologiche e fisiopatologiche a perturbazioni sia chimiche che elettriche. Inoltre, l’elemento topologico dei canali P/Q presinaptici, codificato dal gene CACNA1A umano, è stato identificato come responsabile della mediazione della scarica di vari neurotrasmettitori, tra cui il glutammato 30,31,32, ed è strettamente legato all’epilessia …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (sovvenzione n. 2022A1515111123 a Jing-Da Qiao) e prevede di migliorare la ricerca scientifica in GMU (Jing-Da Qiao). Questo lavoro è stato sostenuto anche dal Piano di Incentivazione per l’Innovazione degli Studenti dell’Università di Medicina di Guangzhou (Finanziamento n. 02-408-2304-02038XM).
Materials
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
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