Summary

Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

Published: October 13, 2023
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per l’imaging del calcio ex vivo in Drosophila adulta che esprime GCaMP6 per monitorare le attività epilettiformi. Il protocollo fornisce uno strumento prezioso per studiare gli eventi ictali nella Drosophila adulta attraverso l’imaging del calcio ex vivo , consentendo l’esplorazione dei potenziali meccanismi dell’epilessia a livello cellulare.

Abstract

L’epilessia è un disturbo neurologico caratterizzato da convulsioni ricorrenti, parzialmente correlate all’origine genetica, che colpisce oltre 70 milioni di individui in tutto il mondo. Nonostante l’importanza clinica dell’epilessia, l’analisi funzionale dell’attività neurale nel sistema nervoso centrale deve ancora essere sviluppata. I recenti progressi nella tecnologia di imaging, in combinazione con l’espressione stabile di indicatori di calcio geneticamente codificati, come GCaMP6, hanno rivoluzionato lo studio dell’epilessia sia a livello cerebrale che a livello di risoluzione di una singola cellula. La Drosophila melanogaster è emersa come strumento per studiare i meccanismi molecolari e cellulari alla base dell’epilessia grazie alla sua sofisticata genetica molecolare e ai suoi saggi comportamentali. In questo studio, presentiamo un nuovo ed efficiente protocollo per l’imaging del calcio ex vivo in Drosophila adulta che esprime GCaMP6 per monitorare le attività epilettiformi. L’intero cervello viene preparato da cac, un noto gene dell’epilessia, moscerini knockdown per l’imaging del calcio con un microscopio confocale per identificare l’attività neurale come follow-up del test comportamentale simile a un attacco sensibile al bang. Le mosche knockdown del CAC hanno mostrato un tasso più elevato di comportamento simile a convulsioni e attività anomale del calcio, tra cui picchi più grandi e meno picchi piccoli rispetto ai moscerini wild-type. Le attività del calcio sono state correlate a un comportamento simile a quello delle convulsioni. Questa metodologia funge da metodologia efficiente per lo screening dei geni patogeni per l’epilessia e per l’esplorazione del potenziale meccanismo dell’epilessia a livello cellulare.

Introduction

L’epilessia, una complessa malattia neurologica cronica caratterizzata dalla ricorrenza di convulsioni spontanee e non provocate e da un’attività aberrante della rete neuronale, ha colpito oltre 70 milioni di persone in tutto il mondo, rendendola unadelle malattie neurologiche più comuni e portando ai pesanti fardelli delle famiglie e della società. In considerazione dell’impatto dell’epilessia, sono stati condotti molti studi per identificare l’eziologia delle convulsioni, di cui la genetica è stata approvata come causa primaria di molti tipi di epilessie o sindromi epilettiche2. Negli ultimi decenni, i progressi nelle tecnologie genomiche hanno portato a un rapido aumento della scoperta di nuovi geni associati all’epilessia, che svolgono un ruolo cruciale nell’insorgenza delle crisi, compresi i canali ionici e i geni dei canali non ionici 3,4. Tuttavia, i meccanismi sottostanti e l’analisi funzionale tra i geni e i fenotipi epilettici non sono completamente compresi. L’identificazione dei geni e dei meccanismi associati all’epilessia offre la possibilità di gestire i pazienti in modo efficiente 5,6.

I segnali citosolici del calcio sono elementi fondamentali nell’attività neuronale e nella trasmissione sinaptica. L’imaging del calcio, comprese le fette cerebrali7, in vivo 8,9 e ex vivo10, è stato utilizzato per monitorare l’attività neuronale11 come marcatore per l’eccitabilità neuronale dal 197012,13. I recenti progressi nella tecnologia di imaging, in combinazione con gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), come GCaMP6, hanno rivoluzionato lo studio dell’epilessia sia a livello cerebrale che a livello di singola cellula 14,15,16, che ha un alto livello di precisione spazio-temporale. Cambiamenti nella concentrazione di calcio e nei transienti sono stati osservati rispettivamente nei potenziali d’azione e nella trasmissione sinaptica14, indicando che l’alterazione dei livelli intracellulari di calcio mostra una stretta correlazione con l’eccitabilità elettrica dei neuroni 17,18. L’imaging del calcio è stato anche applicato come modello di convulsionedello sviluppo 9 ed eseguito in Drosophila per lo screening di composti anticonvulsivanti19.

La Drosophila melanogaster sta emergendo come un potente organismo modello nella ricerca scientifica, come l’epilessia, per la sua sofisticata genetica molecolare e i saggi comportamentali 20,21,22. Inoltre, gli strumenti genetici avanzati di Drosophila hanno contribuito all’espressione dell’indicatore di calcio codificato geneticamente GCaMP6. Ad esempio, i sistemi trascrizionali binari basati su Gal4 e UAS consentono un’espressione specifica del GCaMP6 in modo spazialmente e temporalmente controllato. Poiché la Drosophila è un organismo minuscolo, l’imaging del calcio in vivo richiede competenze operative competenti per eseguire un intervento chirurgico, in cui solo una piccola parte della dorsale del cervello è stata esposta attraverso una piccola finestra14,23. Allo stesso tempo, l’imaging del calcio ex vivo nel cervello intatto di Drosophila può essere utilizzato per monitorare le regioni di interesse (ROI) dell’intero cervello.

In questo studio, presentiamo l’imaging del calcio ex vivo in Drosophila adulta esprimente GCaMP6 per monitorare le attività epilettiformi. CACNA1A è un noto gene dell’epilessia, il cac appartiene al canale Cav2, che è un omologo di CACNA1A. Abbiamo iniziato sezionando il cervello dei moscerini knockdown cac tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi e impersonandoli utilizzando un microscopio confocale con modalità di scansione xyt. Abbiamo quindi analizzato i cambiamenti nei segnali di calcio delle ROI calcolando indicatori che quantificano gli eventi spontanei simili alle convulsioni, come il valore %ΔF/F e gli eventi di calcio della fluorescenza GCaMP6. Inoltre, abbiamo eseguito uno stimolo meccanico con una macchina a vortice per indurre test di comportamento convulsivo su mosche cac-knockdown e per convalidare i risultati dell’imaging del calcio. Nel complesso, questo protocollo fornisce uno strumento prezioso per studiare gli eventi ictali nella Drosophila adulta attraverso l’imaging del calcio ex vivo , consentendo l’esplorazione dei potenziali meccanismi dell’epilessia a livello cellulare.

Protocol

1. Protocollo per il saggio sensibile al bang Stabilire le mosche sperimentali incrociando la linea driver tub-Gal4 con la linea UAS-cac-RNAi tramite il sistema Gal4/UAS21. Raccogli le mosche vergini della linea tub-Gal4 e le mosche maschi della linea UAS-cac-RNAi . Quindi, trasferisci le mosche vergini e maschili nella stessa fiala per raccogliere la prole.NOTA: La linea di driver tub-Gal4 consentirà di ottenere il knock…

Representative Results

Utilizzando questo protocollo, abbiamo scoperto che le mosche knockdown cac hanno mostrato tassi significativamente più elevati di comportamento simile a convulsioni rispetto alle mosche WT (17,00 ± 2,99 [n = 6] vs 4,50 ± 2,03 [n = 6]; P = 0,0061; Test t di Student, Figura 1A). La maggior parte dei moscerini tub-Gal4>UAS-cac-RNAi si è ripresa entro 1-5 s, mentre i moscerini UAS-cac-RNAi si sono ripresi entro 2 s. La percentuale di rec…

Discussion

Lo ione calcio funge da secondo messaggero cruciale, svolgendo un ruolo fondamentale in una serie di risposte fisiologiche e fisiopatologiche a perturbazioni sia chimiche che elettriche. Inoltre, l’elemento topologico dei canali P/Q presinaptici, codificato dal gene CACNA1A umano, è stato identificato come responsabile della mediazione della scarica di vari neurotrasmettitori, tra cui il glutammato 30,31,32, ed è strettamente legato all’epilessia

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (sovvenzione n. 2022A1515111123 a Jing-Da Qiao) e prevede di migliorare la ricerca scientifica in GMU (Jing-Da Qiao). Questo lavoro è stato sostenuto anche dal Piano di Incentivazione per l’Innovazione degli Studenti dell’Università di Medicina di Guangzhou (Finanziamento n. 02-408-2304-02038XM).

Materials

Brushes Panera AAhc022-2 for handling flies
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C4901
Confocal microscope SP8; Zeiss, Jena, Germany. N/A for calcium imaging
CO2 anesthesia machine N/A N/A for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder N/A N/A handmade, for mounting the brain
Culture vials Biologix 51-0500 2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA version: 2.14.0 for analysis
Fly morgue N/A N/A handmade, for handling flies
Fly stocks cac-RNAi 27244 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks GCaMP6m 42750 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks tub-Gal4 N/A from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose Sigma-Aldrich G8270
High-resolution camera N/A N/A for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine Sigma-Aldrich L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2) Sigma-Aldrich M1028
Papain suspension Worthington Biochemical LS003126
Petri dishes Sigma-Aldrich SLW1480/02D for dissection
Pipette Thermo Scientific 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Recording dish Thermo Scientific 150682- Glass Based Dish for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S8282
Stereo-binocular microscope SHANG GUANG XTZ-D for handling flies and dissection
Syringe needles pythonbio HCL0693 for dissection
Tripod WEIFENG 45634732523 for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich Z653438 for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard N/A N/A handmade, foam pad or paper for background

References

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He, M., Liu, C., Zhang, X., Lin, Y., Mao, Y., Qiao, J. Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy. J. Vis. Exp. (200), e65825, doi:10.3791/65825 (2023).

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