Summary

Ex vivo Кальциевая визуализация для модели эпилепсии дрозофилы

Published: October 13, 2023
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол визуализации ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. Протокол предоставляет ценный инструмент для исследования иктальных событий у взрослых дрозофил с помощью визуализации кальция ex vivo , что позволяет исследовать потенциальные механизмы эпилепсии на клеточном уровне.

Abstract

Эпилепсия – это неврологическое расстройство, характеризующееся рецидивирующими припадками, частично коррелированными с генетическим происхождением, которым страдают более 70 миллионов человек во всем мире. Несмотря на клиническое значение эпилепсии, функциональный анализ нервной активности в центральной нервной системе еще предстоит разработать. Недавние достижения в технологии визуализации в сочетании со стабильной экспрессией генетически кодируемых индикаторов кальция, таких как GCaMP6, произвели революцию в изучении эпилепсии как на уровне мозга, так и на уровне отдельных клеток. Drosophila melanogaster появилась как инструмент для исследования молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе эпилепсии, благодаря своей сложной молекулярной генетике и поведенческим анализам. В этом исследовании мы представляем новый и эффективный протокол визуализации ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. Весь мозг подготавливается из cac, хорошо известного гена эпилепсии, для визуализации кальция с помощью конфокального микроскопа, чтобы идентифицировать нейронную активность в качестве последующего анализа на судорожное поведение. Мухи-нокдауны CAC показали более высокую частоту судорожного поведения и аномальную активность кальция, включая более крупные шипы и меньшее количество мелких шипов, чем мухи дикого типа. Активность кальция коррелировала с судорожным поведением. Эта методология служит эффективной методологией скрининга патогенных генов эпилепсии и изучения потенциального механизма эпилепсии на клеточном уровне.

Introduction

Эпилепсия, сложное хроническое неврологическое расстройство, характеризующееся рецидивами спонтанных и неспровоцированных припадков и аберрантной активностью нейронной сети, затронула более 70 миллионов человек во всем мире, что делает ее одним из наиболее распространенных неврологическихзаболеваний1 и приводит к тяжелому бремени для семей и общества. Принимая во внимание влияние эпилепсии, было проведено множество исследований для определения этиологии припадков, из которых генетика была признана основной причиной многих типов эпилепсии или эпилептическихсиндромов. За последние десятилетия достижения в области геномных технологий привели к быстрому увеличению числа открытий новых генов, связанных с эпилепсией, которые играют решающую роль в возникновении судорог, включая гены ионных каналов и неионных каналов 3,4. Тем не менее, основные механизмы и функциональный анализ между генами и эпилептическими фенотипами до конца не изучены. Идентификация генов и механизмов, связанных с эпилепсией, дает возможность эффективно вести пациентов 5,6.

Цитозольные кальциевые сигналы являются ключевыми элементами нейрональной активности и синаптической передачи. Визуализация кальция, включая срезы мозга7, in vivo 8,9 и ex vivo10, используется для мониторинга активности нейронов11 в качестве маркера возбудимости нейроновс 1970-х годов 12,13. Недавние достижения в технологии визуализации в сочетании с генетически кодируемыми кальциевыми индикаторами (GECI), такими как GCaMP6, произвели революцию в изучении эпилепсии как на уровне мозга, так и на уровне разрешения одной клетки14, 15, 16, что имеет высокий уровень пространственно-временной точности. Изменения концентрации кальция и переходных процессов наблюдались в потенциалах действия и синаптической передаче соответственно14, что указывает на то, что изменение внутриклеточных уровней кальция проявляет строгую корреляцию с электрической возбудимостью нейронов17,18. Визуализация кальция также применялась в качестве модели судорогразвития 9 и выполнялась у дрозофилы для скрининга противосудорожных соединений19.

Drosophila melanogaster становится мощным модельным организмом в научных исследованиях, таких как эпилепсия, благодаря своей сложной молекулярной генетике и поведенческим тестам 20,21,22. Более того, усовершенствованные генетические инструменты дрозофилы способствовали экспрессии генетически кодируемого кальциевого индикатора GCaMP6. Например, бинарные транскрипционные системы на основе Gal4 и UAS обеспечивают специфическую экспрессию GCaMP6 пространственно и во времени. Поскольку дрозофила является крошечным организмом, визуализация кальция in vivo требует профессиональных операционных навыков для выполнения хирургического вмешательства, при котором только небольшая часть спинного мозга обнажалась через маленькое окно14,23. В то же время, визуализация кальция ex vivo в интактном мозге дрозофилы может быть использована для мониторинга областей интереса (ROI) всего мозга.

В этом исследовании мы представляем визуализацию ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. CACNA1A является хорошо известным геном эпилепсии, CAC относится к каналу Cav2, который является гомологом CACNA1A. Мы начали с препарирования мозга мух-нокдаунов САС tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi и визуализации их с помощью конфокального микроскопа с режимом рентгеновского сканирования. Затем мы проанализировали изменения кальциевых сигналов ROI, рассчитав показатели, которые количественно оценивают спонтанные судорожные события, такие как значение %ΔF/F и кальциевые события флуоресценции GCaMP6. Кроме того, мы проводили механический стимул с помощью вихревой машины, чтобы индуцировать тесты на судорожное поведение мух, нокдаунов CAC, а также валидировать результаты визуализации кальция. В целом, этот протокол предоставляет ценный инструмент для исследования иктальных событий у взрослых дрозофил с помощью визуализации кальция ex vivo, что позволяет исследовать потенциальные механизмы эпилепсии на клеточном уровне.

Protocol

1. Протокол для анализа, чувствительного к взрыву Установить экспериментальные мухи путем скрещивания линии драйвера tub-Gal4 с линией UAS-cac-RNAi через систему21 Gal4/UAS. Соберите девственных мух линии tub-Gal4 и самцов мух линии UAS-cac-RNAi . Затем переложит?…

Representative Results

Используя этот протокол, мы обнаружили, что мухи с нокдауном cac показали значительно более высокие показатели судорожного поведения, чем мухи WT (17,00 ± 2,99 [n = 6] против 4,50 ± 2,03 [n = 6]; Р = 0,0061; t-критерий Стьюдента, рисунок 1А). Большинство мух tub-Gal4>UAS-cac-RNAi вы…

Discussion

Ион кальция служит важным вторым мессенджером, играя ключевую роль в ряде физиологических и патофизиологических реакций как на химические, так и на электрические возмущения. Кроме того, топологический элемент пресинаптических P/Q-каналов, кодируемый геном CACNA1A человека, был иденти…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Гуандунским фондом фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований (грант No 2022A1515111123 Jing-Da Qiao) и планом по расширению научных исследований в GMU (Jing-Da Qiao). Эта работа также была поддержана Планом развития инновационных способностей студентов Медицинского университета Гуанчжоу (No финансирования 02-408-2304-02038XM).

Materials

Brushes Panera AAhc022-2 for handling flies
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C4901
Confocal microscope SP8; Zeiss, Jena, Germany. N/A for calcium imaging
CO2 anesthesia machine N/A N/A for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder N/A N/A handmade, for mounting the brain
Culture vials Biologix 51-0500 2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA version: 2.14.0 for analysis
Fly morgue N/A N/A handmade, for handling flies
Fly stocks cac-RNAi 27244 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks GCaMP6m 42750 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks tub-Gal4 N/A from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose Sigma-Aldrich G8270
High-resolution camera N/A N/A for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine Sigma-Aldrich L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2) Sigma-Aldrich M1028
Papain suspension Worthington Biochemical LS003126
Petri dishes Sigma-Aldrich SLW1480/02D for dissection
Pipette Thermo Scientific 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Recording dish Thermo Scientific 150682- Glass Based Dish for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S8282
Stereo-binocular microscope SHANG GUANG XTZ-D for handling flies and dissection
Syringe needles pythonbio HCL0693 for dissection
Tripod WEIFENG 45634732523 for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich Z653438 for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard N/A N/A handmade, foam pad or paper for background

References

  1. Thijs, R. D., Surges, R., O’brien, T. J., Sander, J. W. Epilepsy in adults. Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).
  2. Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
  3. Wang, J., et al. Epilepsy-associated genes. Seizure. 44, 11-20 (2017).
  4. Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
  5. Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
  6. Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
  7. Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
  8. Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
  9. Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
  10. Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
  11. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  12. Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
  13. Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
  14. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  15. Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
  16. Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
  17. Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
  18. Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
  19. Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
  20. Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
  21. Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
  22. Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
  23. Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
  24. Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
  25. Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
  26. Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O’dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
  27. Gu, H., O’dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
  28. Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
  29. Liu, C. -. Q., Lin, Y. -. M., Zhang, X. -. X., Peng, R. -. C., Qiao, J. -. D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
  30. Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i., Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
  31. Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
  32. Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
  33. Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
  34. Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
  35. Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
  36. Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
  37. Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
  38. Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. Plos Genetics. 15 (11), e1008421 (2019).

Play Video

Cite This Article
He, M., Liu, C., Zhang, X., Lin, Y., Mao, Y., Qiao, J. Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy. J. Vis. Exp. (200), e65825, doi:10.3791/65825 (2023).

View Video