Summary
患者来源的肿瘤类器官是用于基础和转化研究的复杂模型系统。本文详细介绍了使用多重荧光活细胞成像对不同类器官表型进行同步动力学评估。
Abstract
患者来源的癌症类器官 （PDO） 模型是一种多功能研究系统，与癌细胞系相比，它更好地概括了人类疾病。PDO模型可以通过在细胞外基底膜提取物（BME）中培养患者肿瘤细胞并将其铺成三维圆顶来生成。然而，针对单层培养物中的表型测定进行了优化的市售试剂通常与 BME 不兼容。在此，我们描述了一种使用自动活细胞成像系统对PDO模型进行板化和评估药物效果的方法。此外，我们应用与动力学测量兼容的荧光染料来同时量化细胞健康和细胞凋亡。图像捕获可以自定义为在几天内以固定的时间间隔进行。用户可以在单个 Z 平面图像或来自多个焦平面的连续图像的 Z 投影中分析药物效应。 使用掩蔽，计算感兴趣的特定参数，例如PDO数，面积和荧光强度。我们提供概念验证数据，证明细胞毒性药物对细胞健康、细胞凋亡和活力的影响。这种自动化动力学成像平台可以扩展到其他表型读数，以了解癌症PDO模型中的各种治疗效果。
Introduction
患者来源的肿瘤类器官 （PDO） 正在迅速成为研究癌症发展和治疗反应的强大模型系统。PDO 是三维 （3D） 细胞培养系统，可概括原发肿瘤的复杂基因组图谱和结构 1,2。与永生化癌细胞系的传统二维 （2D） 培养不同，PDO 捕获并维持肿瘤内异质性 3,4，使其成为机制和转化研究的宝贵工具。尽管PDO正在成为一种越来越受欢迎的模型系统，但与PDO培养物相容的市售试剂和细胞效应分析方法仍然有限。
缺乏可靠的方法来分析治疗反应的细微变化阻碍了临床转化。3D 培养物中的金标准细胞健康试剂 CellTiter-Glo 3D 利用 ATP 水平作为细胞活力的决定因素 5,6。虽然该试剂可用于终点检测，但也有一些注意事项，最明显的是检测完成后无法将样品用于其他目的。
活细胞成像是一种复杂的动力学显微镜，当与荧光试剂结合使用时，能够量化 PDO 模型中的各种细胞健康读数，包括细胞凋亡7、8、9 和细胞毒性10。事实上，活细胞成像一直是2D平台中化合物高通量筛选不可或缺的一部分11,12。像Incucyte这样的系统使这项技术变得负担得起，因此可以在各种环境中为研究小组所使用。然而，这些系统在分析3D培养物中的应用仍处于起步阶段。
在此，我们描述了一种使用多重活细胞成像评估癌症PDO模型中药物反应的方法（图1）。通过对明场图像的分析，可以动力学地监测PDO大小和形态的变化。此外，随着时间的推移，可以使用荧光试剂同时定量细胞过程，例如用于细胞凋亡的膜联蛋白 V 红色染料和用于细胞毒性的 Cytotox Green 染料。所提出的方法针对 Cytation 5 活细胞成像系统进行了优化，但该协议可能适用于不同的活细胞成像平台。
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Protocol
使用人类肿瘤标本的研究由爱荷华大学机构审查委员会 （IRB） 审查和批准，协议 #201809807，并按照 1964 年赫尔辛基宣言及其后来的修正案中规定的伦理标准进行。获得所有参与研究的受试者的知情同意。纳入标准包括癌症诊断和肿瘤标本的可用性。
1. 将完整的 PDO 接种在 96 孔板中
- 准备试剂。
- 在37°C下预热96孔板过夜，并在4°C下解冻BME。
- 制备针对培养感兴趣的癌症类型进行优化的完整类器官培养基。用于此处所示实验的特定培养基在 补充表1中提供。
注意：可能需要针对不同的肿瘤类型修改培养基成分。例如，类器官培养基补充有100nM雌二醇用于妇科肿瘤13。制备的培养基在4°C下稳定1个月。为了长期储存，将培养基等分装到50 mL管中并储存在-20°C下。
- 在4°C和37°C下制备两个单独的类器官培养基等分试样。 例如，如果在 96 孔板中接种 60 孔，则使用 6 mL 温热的类器官培养基和 150 μL 冰冷的类器官培养基。
- 准备类器官洗涤缓冲液：用 10 mM HEPES、1x Glutamax、5 mM EDTA 和 10 μM Y-27632 补充 1x PBS。储存在4°C
- 收获在 24 孔板中培养的 PDO。除非另有说明，否则在冰上或4°C下执行所有步骤。
- 使用真空管路系统从每个孔中抽吸介质。
- 加入 500 μL 冰冷类器官洗涤缓冲液，并使用 1000 μL 移液器轻轻移液 2-3 次。将板在冰上孵育10分钟。
- 将每个孔的内容物转移到 50 mL 锥形管中。为确保所有 PDO 都处于悬浮状态，用额外的 300 μL 类器官洗涤缓冲液冲洗每个孔并转移到 50 mL 锥形管中。在4°C下以350× g 离心5分钟
- 使用真空管路系统从 BME/类器官沉淀中抽出上清液，在管中剩余 ~ 5 mL。加入 20 mL 类器官洗涤缓冲液，并使用 10 mL 血清移液管轻轻重悬沉淀。在冰上孵育10分钟。
- 在4°C下以350× g 离心5分钟。 用真空管路系统吸出上清液，注意不要破坏PDO沉淀。
- 在 96 孔板中铺板 PDO：除非另有说明，否则在冰上执行所有步骤。
- 将PDO沉淀重悬于适量的冰冷类器官培养基中，以产生PDO悬浮液。将PDO悬浮液转移到冰冷的1.5mL微量离心管中。
注意：要计算类器官培养基的量，请确定要在 96 孔板中接种的孔数，同时考虑到 PDO 以 1：1 的类器官培养基和 BME 比例接种在 5 μL 圆顶中。例如，当铺板一个 96 孔板并仅使用内部 60 孔时，所需的 PDO 悬浮液总量为 300 μL：150 μL 类器官培养基和 150 μL BME。对于在不同百分比的 BME 下表现出最佳生长的模型，在此步骤中可以修改 BME： 培养基的比率，但必须对每个特定模型的所有检测中的比率进行标准化。为了解决移液误差，向每个组分添加 10% 的体积。 - 计算 PDO 的数量。
- 将 2.5 μL PDO 悬浮液转移到冰冷的 1.5 mL 微量离心管中，并与 2.5 μL BME 混合。将 5 μL 混合物转移到干净的玻璃显微镜载玻片上。不要盖玻片。混合物将凝固成圆顶。
- 使用4倍的明场显微镜进行可视化。计数 5 μL 混合物中的 PDO 数量;目标是每 5 μL 圆顶大约有 25-50 个 PDO。
注意：如果在测试混合物中未达到所需的密度，则通过添加更多的类器官培养基或离心PDO悬浮液并将PDO沉淀重悬于较低体积的冰冷类器官培养基中来调整PDO悬浮液的最终体积。无论在此步骤中如何修改PDO悬浮液，BME的最终比率：步骤1.5.3中的PDO悬浮液。应为 1：1。
- 使用具有宽口径吸头的 200 μL 移液器，将 PDO 悬浮液与等量的 BME 小心混合，以达到类器官培养基与 BME 的 1：1 比例。避免气泡，这会破坏圆顶的完整性。
- 使用 20 μL 移液器，将 5 μL 圆顶接种到预热的 96 孔板的每个孔的中心，仅接种内部 60 孔。为确保 PDO 的均匀分布，定期使用带有宽口径吸头的 200 μL 移液器移取 1.5 mL 管的内容物。
- 播种完所有孔后，将盖子放在板上并轻轻倒置。将倒置的板在37°C下在组织培养箱中孵育20分钟，以使圆顶凝固。
注意：倒置板可确保 BME/类器官培养基圆顶保留 3D 结构，为 PDO 形成提供足够的空间。 - 翻转板，使其盖上盖子，并在37°C下孵育5分钟。
- 将PDO沉淀重悬于适量的冰冷类器官培养基中，以产生PDO悬浮液。将PDO悬浮液转移到冰冷的1.5mL微量离心管中。
2. 多重处理和荧光染料的添加
- 当 BME 圆顶在 96 孔板中凝固时，准备荧光活细胞成像试剂的稀释液。本文给出了膜联蛋白V红染料和细胞毒素绿染料的多重检测的具体参数。
- 荧光试剂制备（第 -1 天）：假设每个孔将用 100 μL 染料定量培养基处理，根据要处理的孔数计算类器官培养基的适当体积。在预热的类器官培养基中将染料稀释至所需浓度。
注意：所需的培养基总量会因实验而异。在最终体积中加入 10% 以解决移液误差。例如，要处理 96 孔板的内部 60 孔，制备 6.6 mL 染料定量培养基（表 1）。 - 用 100 μL 2x 染料剂量的类器官培养基处理每个孔。将 200 μL 无菌 1x PBS 加入板的外部空孔中。在37°C孵育过夜。
注意：外周孔中的PBS减少了内孔中介质的蒸发。 - 添加药物/治疗剂（第 0 天）：在预热的类器官培养基中以 2 倍浓度在每孔 100 μL 的体积中制备药物。
注意：DMSO在高浓度下可能对细胞有毒。在本研究中进行的实验中不超过0.1%DMSO的浓度。除药物外，一些荧光试剂以DMSO溶液的形式分发。在使用此类试剂时，必须考虑DMSO总浓度。 - 向每个孔中加入 100 μL 2x 染料定量培养基;避免产生气泡。
3. 设置成像参数
- 将板放入细胞化 5 中。 打开 Gen5 软件。单击“ 新建任务”>“成像器手动模式”。选择 立即捕获 并输入以下设置： 物镜（选择所需的放大倍率）; 过滤器（选择微孔板）; 微孔板规格（选择孔数）;和 容器类型（选择板类型）。单击 “使用盖 子”和 “使用较慢的载波速度”。单击 “确定”。
注意：容器类型：在选择有关板的信息时，请尽可能具体，因为软件已针对每种板类型和塑料厚度校准为从物镜到板底部的特定距离。
较慢的载体速度：选择此框可避免在装载/卸载板时损坏圆顶。 - 创建一个 Z-Stack，该 Z-Stack 将对整个 BME 圆顶进行映像。
- 选择要查看的感兴趣孔（直方图下方的左侧面板）。
- 选择 明场通道（左面板，顶部）。单击 自动曝光 并根据需要调整 设置 。
- 设置 Z-Stack： Expand Imaging Mode 选项卡（左侧面板，中间）的底部和顶部。选中 Z-Stack 框。使用航向调整箭头（左侧面板，中间），单击向下调整，直到所有 PDO 进入，然后失焦并模糊不清。将其设置为 Z-Stack 的底部。使用航向调整箭头向相反方向重复，以设置 Z-Stack 的顶部。
- 为确保 Z-Stack 设置适用于其他感兴趣的孔，请选择另一个孔（左侧面板，直方图下方）并可视化 Z-Stack 的顶部和底部。
- 要手动输入焦距位置，请单击微调旁边的三个点（左侧面板，顶部）。将打开一个窗口;键入顶部的 Z-Stack 值（位于左侧面板中间 的“成像模式”下）。对底部的 Z-Stack 值重复上述步骤。根据需要进行调整，通过重复步骤 3.2.3 捕获所需的 Z 范围。如果需要调整，请选择另一个孔以验证设置。
- 设置荧光通道的曝光设置。描述了两个荧光通道（GFP和TRITC）的设置。荧光通道的具体数量将取决于实验以及活细胞成像系统中安装的荧光立方体。
注意：如果预计在实验结束时信号强度会明显更高，用户应考虑执行测试实验，以确定实验结束时的最佳曝光设置，然后在设置初始参数时可以应用该设置。- 展开 “成像模式 ”选项卡（左侧面板，中间）并打开 “编辑成像步骤”。将出现一个弹出窗口。
- 在 “通道”下，单击所需通道数的气泡。为明场指定一个通道，为每个荧光通道指定其他通道。在此示例中， 通道 1 = 明场; 通道 2 = GFP; 通道 3 = TRITC。使用下拉 颜色 菜单，为每个通道选择适当的设置。单击 “确定”关闭编辑窗口。
- 设置每个荧光通道。
- 将通道切换到 GFP（左面板，顶部）。
- 单击 “自动曝光”（左面板，顶部）。展开 “曝光 ”选项卡（左侧面板，中间）并调整曝光设置以最大程度地减少背景信号。
- 按照步骤 3.3.3.3-3.3.3.6 将曝光设置复制到 “图像模式 ”选项卡。
- 单击“编辑成像步骤”框旁边的“复制”图标。单击“编辑映像步骤”（Edit Imaging Step），这将打开另一个窗口。
- 在GFP通道下，单击“曝光”行中的“剪贴板”图标，将“照明”、“积分时间”和“相机增益”设置添加到通道。
- 对 TRITC 通道重复步骤 3.3.3.4-3.3.3.5。单击 “确定 ”关闭窗口。
- 设置图像预处理和 Z 投影步骤以自动执行图像预处理。
- 单击 相机 图标（左面板，下角）。将打开一个新窗口。
- 在 “添加处理步骤”（左面板，底部）下，单击 “图像预处理”。将打开一个新窗口。
- 在 “明场 ”选项卡上，取消选择 “应用图像预处理”。
- 对于每个 荧光通道 选项卡，请确保选中 “应用图像预处理 ”。取消选择 “使用与通道 1 相同的选项 ”，然后单击 “确定”。窗口将关闭。
- 在 “添加处理步骤”下，单击 “Z 投影”。将打开一个新窗口。如果需要，调整切片范围（例如，缩小 Z 范围）。通过选择 “确定”关闭窗口。
- 创建协议。
- 单击工具栏中 的图像集 。在下拉菜单中，点击 从此映像集创建实验。 “成像窗口”（Imaging Window ） 将关闭，“ 过程窗口”（Procedure Window ） 将打开。
注意：在 成像器手动模式 下选择的参数将自动加载到新窗口中，从而可以创建实验方案。 - 设定温度和渐变：点按“操作”标题（左侧）下的“设定温度”。将打开一个新窗口。选择“培养箱开启”，然后在“温度”下手动输入所需温度。接下来，在“渐变”下，手动输入 1。通过选择“确定”关闭窗口。
注意： 创建 1 °C 梯度将防止在板盖上形成冷凝水。 - 为映像指定孔。
- 双击“描述”下的“图像步骤”。单击“全板”（右上角）。这将打开“板布局”（Plate Layout） 窗口。
- 使用光标突出显示感兴趣的井。单击 “确定”。如果需要，请选中“ 自动对焦合并 ”和 “捕获合并 ”框。单击 “确定 ”关闭窗口。
注意：像素合并需要调整曝光，如上述步骤 3.3.3.2 所述。有关可能使用此功能的具体场景，请参阅讨论部分。
- 设置动力学成像的间隔。
- 单击“其他”标题（左侧）下的“选项”。选中“不连续动力学程序”框。
- 在 “估计总时间”下，输入实验的运行时间（例如，5 天）。在 “估计间隔”下，输入对板进行成像的间隔（例如，每 6 小时一次）。
- 每次运行后单击“暂停”，以便有时间将板转移到培养箱中。通过选择“确定”关闭窗口。
- 更新数据缩减步骤。
- 单击“ 确定 ”关闭 “过程窗口”。将打开一个选项卡以更新数据缩减步骤。选择 “是”。双击 图像预处理。单击不同的通道以验证设置，然后单击 确定。
- 双击 Z 投影。单击不同的渠道以验证设置。单击 “确定”。然后，再次单击 “确定 ”以关闭 “数据缩减窗口”。
- 格式化印版布局。
- 打开 孔板布局向导 ，按照步骤 3.6.2-3.6.3 指定孔类型。
- 单击工具栏中的“ 孔板布局 ”图标（左上角）以打开 “孔板布局向导”。
- 选中实验中使用的孔类型旁边的框。在 “检测对照”下，使用箭头输入不同对照类型的数量。单击 “下一步 ”打开“ 检测对照 #1 ”窗口。
- 按照步骤 3.6.5-3.6.8 设置测定对照孔条件。
- 在“ 检测对照 #1”窗口中，在 “孔板布局 ID ”框中输入对照标签。如果需要，请在相邻的框中输入全名。使用箭头选择相应控制条件的重复数。
- 如果在对照中使用多个浓度或稀释系列，请单击 定义稀释度/浓度 ，然后使用下拉菜单选择 类型。在表中输入每种浓度/稀释度的值。
注意： 如果浓度以一致的增量变化，则可以使用自动功能。 - 选择工具栏中的 “颜色” 选项卡。在下拉菜单中选择所需的文本颜色和背景颜色进行控制。单击 “下一步”。
- 根据需要对其他控件重复上述步骤。
- 按照 3.6.10-3.6.12 设置样品井条件。
- 在“示例设置”页上，输入示例 ID 前缀（例如 SPL）。使用箭头选择重复次数。如果使用具有不同处理浓度的样品，请在类型下拉菜单中选择浓度或稀释度。在表格中输入稀释度/浓度，然后在单位框中输入单位。
- 在工具栏中选择 标识字段 。在表格中输入所需的 类别名称 （例如，样品 ID、药物）。
- 选择工具栏中的 “颜色 ”选项卡。为每个治疗组/样品选择不同的颜色。单击 “完成”。这将打开“板布局”页面。
注意：左侧的数字与不同的样本编号相关。 - 按照步骤 3.6.14-3.6.16 分配示例 ID。
- 选择 左面板中的 SPL1。使用光标选择孔。
注： 可以在串行分配框中调整自动选择工具。可以预先指定布局的重复次数和方向。 - 对其他样品重复以完成板布局。满意后， 单击“ 确定”。
- 在 “文件 ”工具栏中，选择 “示例 ID”。在 “样品 ID” 列中填写每个样品的相应信息（例如，药物类型）。按 OK。
- 保存协议。
- 在工具栏中，单击“文件”>“将协议另存为”。选择保存文件的位置。输入文件名。单击“保存”关闭窗口。
- 单击工具栏中的 “文件”>“退出 ”。将打开一个选项卡，用于保存对 成像器手动模式的更改。 选择 “否”。
- 将打开一个选项卡，用于保存对实验 1 的更改。选择 “否”。将打开一个选项卡以更新协议定义。选择 “更新”。关闭软件。
- 单击工具栏中 的图像集 。在下拉菜单中，点击 从此映像集创建实验。 “成像窗口”（Imaging Window ） 将关闭，“ 过程窗口”（Procedure Window ） 将打开。
- 将实验方案导入BioSpa OnDemand并完成实验设置。
- 打开BioSpa OnDemand（调度软件）软件。
- 在软件中选择一个可用的插槽。
- 从活细胞成像系统中取出板。单击 “打开抽屉 ”以访问调度软件中的相应插槽并插入板。单击 “关闭抽屉”。
注意：在上面的步骤 3.5.7 中创建协议后，可以在任何时候执行此步骤。但是，板必须在 Cytation 5 中才能执行以下步骤 3.6.4.3 中的定时运行。 - 导入协议。
- 在 “过程信息 ”选项卡下，在下拉菜单中选择 “用户 ”。在“协议 ”槽旁边，单击 “选择”>“添加新条目”。
- 在“协议”插槽旁边，单击 “选择”。这将打开一个新窗口，以导航到文件架构中所需的协议。单击 “打开 ”将协议导入调度软件。
- 输入对印版进行成像所需的时间。单击 “确定 ”关闭 Gen5 协议列表 窗口。
注意：当一次运行多个实验时，此步骤尤为重要。要确定映像所需的时间，请单击 “立即执行计时运行”。单击 “确定”。
- 设置成像间隔并安排实验。
- 在 间隔下，输入步骤 3.5.4 中指定的成像间隔。
- 在 “开始时间选项”下，选择 “可用时”。在 “持续时间”下， 选择“固定 ”或 “连续”。
注意：可以指定特定的开始时间，而不是在下一个可用时间运行协议。选择 “固定持续时间 ”将为实验设置特定的终结点，并要求用户指定实验时间范围。 “连续持续时间 ”将允许实验在没有终结点的情况下运行，并且只能通过用户停止实验来结束。 - 单击 “计划板/容器”（Schedule Plate/Vessel）。这将打开板验证序列。将打开一个选项卡，其中包含建议的首次读取时间。单击 “是 ”接受此计划。
4. Gen5 软件中的图像分析 （图 2）
- 打开图像分析模块。
- 打开 Gen5。在 任务管理器中，选择 “实验>打开”。选择实验以打开文件。单击工具栏中的 “板>视图 ”。
- 将 “数据 ”下拉菜单更改为 “Z 投影”。双击感兴趣的井。选择 分析> 我想设置新的影像分析数据缩减步骤。单击 “确定”。
- 细胞分析
- 主掩模
- 在 “分析设置”下，选择 “类型：蜂窝分析和检测通道：ZProj[Tsf[明场]] （左侧面板，中间）。
- 单击 “选项”。这将打开 “主要掩码和计数 ”页面。在 “阈值 ”框中，选中“ 自动 ”，然后单击 “应用”。单击 “突出显示对象 ”框（右侧面板，底部）以显示指定阈值内的对象。根据需要进行调整以包括感兴趣的对象。
注意：阈值设置基于像素强度。例如，如果阈值设置为 5000，则强度大于 5000 的像素将包含在分析中。 - 在 “对象选择”（Object Selection） 下，指定最小和最大对象大小 （μm）。根据需要进行调整以排除细胞碎片/单细胞。
注意： PDO 大小可能在不同型号和类型之间有很大差异。使用 Gen5 软件中的测量工具确定每个型号的最小和最大 PDO 大小阈值。用户可以选择相对于测量工具提供的值更小的最小 PDO 大小阈值，以防止在药物治疗后的后期时间点排除 PDO 片段。 - 要将分析限制在孔的某个区域，请取消选择 分析整个图像 ，然后单击 插入。在 “图像插件 ”窗口中，使用下拉菜单选择 “插件 形状”。根据需要调整尺寸和位置参数以适合感兴趣区域。
注意： 重要的是要最大限度地增加插头内的 PDO 数量，同时还要排除无 PDO 的区域以最大限度地减少背景。指定一个插头大小，以便在重复过程中始终如一地捕获大多数感兴趣的对象。生成一个排除圆顶边缘的塞子很重要，因为它排除了由于圆顶边缘周围极端曲率的光折射而可能出现扭曲的任何物体。也可以取消选择 包含主边缘对象 ，以仅捕获插头内的整个 PDO。
- 亚群分析。 图 3 提供了亚群指定的示例。
- 单击“蜂窝分析”工具栏中的“计算指标”。单击“选择”或创建感兴趣的对象级指标（右下角）。在“可用对象”指标下，选择感兴趣的指标（例如，循环度），然后单击“插入”按钮。单击“确定”。
注意：每个PDO模型的形态和密度将确定区分亚群的最佳目标指标。 - 单击“细胞分析”工具栏中的亚群分析。单击添加以创建新的子群体。将打开一个弹出窗口。
- 如果需要，请输入子群体的名称。在 “对象指标”下，选择感兴趣的指标，然后按 “添加条件”。在 “编辑条件 ”窗口中，输入所选 对象指标的参数。根据需要对其他指标重复上述步骤。
注意： 参数可以手动调整或使用查找工具进行设置。例如，要排除碎片，用户可以将 面积 添加为 对象度量 ，并选择小于 800 的对象。通常使用循环 度 作为 对象度量 ，并且包括任何循环度大于 0.2-0.5 的对象，具体取决于模型。 - 在窗口底部的表格中，选中要显示的所需结果。单击 “确定”>“应用”。
- 要查看子群体中的对象，请使用 对象详细信息 下拉菜单（右侧面板，中间）选择子群体。落在参数范围内的对象将在图像中突出显示。
注意：要更改主蒙版和子群体的高亮颜色，请单击 设置 （右侧面板底部）。 - 要调整子种群参数，请从“细胞分析”工具栏中重新打开“子种群分析”窗口。选择子群体，然后单击编辑。单击“添加步骤”。
注意：这将在所有时间点对实验中的所有孔应用相同的分析。在 Matrix 页面的下拉菜单中，可以选择不同的指标进行单独查看。
- 单击“蜂窝分析”工具栏中的“计算指标”。单击“选择”或创建感兴趣的对象级指标（右下角）。在“可用对象”指标下，选择感兴趣的指标（例如，循环度），然后单击“插入”按钮。单击“确定”。
- 主掩模
5. 将数据从 Gen5 导出到 Excel
- 要自定义要导出的数据文件，请选择工具栏中的 “报告/导出生成器” 图标。在弹出窗口中，单击 “新建导出到 Excel”。
- 在弹出窗口的 “属性 ”页上，选择 “范围>板和内容”>“自定义”。单击工具栏中的 “内容 ”选项。单击 “编辑模板”，这将打开 Excel 程序。
- 在电子表格中，选择“ 外接程序”>“表>井数据”。将鼠标悬停在各种选择上可查看导出选项。选择感兴趣的指标（例如，对象均值[ZProj[Tsf[TRITC]]]）。
注：通过选择 “附加模块”>“方案摘要”>“布局”，可以将孔板布局添加到电子表格分析模板中。 - 将打开“ 编辑 ”窗口。在 “孔 ”框中，按 Well-ID 或 Well # 指定要导出的孔。选择 “确定”。模板将加载到电子表格文件中。关闭电子表格。模板将自动保存。
- 单击“新建导出到 Excel”窗口中的“确定”，然后关闭“报表/导出生成器”窗口。
- 单击 Gen5 工具栏中的 “导出 ”图标。选中所需导出文件旁边的框。单击 “确定”。Gen5 将自动填充电子表格模板并在 Excel 中打开文件。
6. 外部数据分析
- 在Excel中打开导出文件（.xlsx）。
- 对于每个孔，将每个单独的值除以该孔的 0：00 时间点值。这会将时间点 0 设置为 1，超出该值的每个值都将与初始读数相关。
- 在数据分析软件中打开一个新文件。选择“ XY 布局 ”选项。
注意：在此协议中，使用了GraphPad Prism（版本9.5.1）。 - 每个数据组的输入标签。将每个处理组的时间点和相应的归一化值复制并粘贴到 Prism 表中。数据的图表将自动生成，可以在 “图表”下找到。
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Representative Results
我们的目的是证明使用多重活细胞成像来评估PDO治疗反应的可行性。在两个独立的子宫内膜癌PDO模型中进行了概念验证实验：ONC-10817和ONC-10811（ONC-10811数据见 补充图1 和 补充图2 ）。细胞凋亡（膜联蛋白 V 染色）和细胞毒性（Cytotox Green 摄取）对细胞凋亡诱导剂星形孢菌素进行动力学监测。具体而言，将PDO接种在96孔板中，用Annexin V Red和Cytotox Green染料处理，并置于37°C培养箱中过夜，如 图1所示。我们在两个独立的PDO模型中证实，用膜联蛋白V和Cytotox绿色染料处理是无毒的（补充图2）。第二天，用浓度递增的星形孢菌素（0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、500 nM）处理 PDO。随后，在 Gen5 软件中建立了协议，实验设置为运行 5 天，每 6 小时成像一次。如协议第 4 节所述，使用 Gen5 软件中的蜂窝分析功能分析数据。主掩模是使用自动阈值功能设置的，未选中“分割触摸对象”，尺寸参数最小：30 μm，最大：1000 μm。PDO亚群的定义为0.25>圆度。将指定 PDO 亚群内 TRITC（膜联蛋白 V，细胞凋亡）和 GFP 通道（细胞毒素绿色，细胞毒性）中的对象平均强度导出为.xlsx文件以供进一步分析。GFP 和 TRITC 通道中每个时间点每个孔的物体平均强度归一化为时间 0。然后将归一化的荧光数据传输到 Prism 文件并可视化为折线图。
与载体对照组相比，星形孢菌素治疗导致细胞凋亡的显着剂量依赖性增加和细胞健康状况随时间下降，TRITC（膜联蛋白 V）和 GFP（细胞毒素）通道的物体平均强度增加证明了这一点（图 4、图 5、补充视频 1、补充视频 2、补充视频 3、 补充视频4、补充视频5、补充视频6和补充视频7）。500 nM、100 nM 和 10 nM 剂量的星形孢菌素随时间推移（图 5A-C）以及实验结束时均导致细胞凋亡和细胞毒性在统计学上显着增加（图 5E、F）。此外，星形孢菌素在这些浓度下有效抑制了PDO的生长和形成，如PDO总面积的整体减少所证明的那样，而对照孔则表现出PDO总面积的增加（图4和图5D）。
由于活细胞成像的一个主要优点是能够校正铺板的变异性，因此我们进行了一项实验，将细胞活力评估为终点指标。使用PDO模型收集概念验证终点测定数据，该模型由患者来源的前列腺癌异种移植物生成。在治疗期开始时（第 0 天）收集明场图像，然后添加测量活力（吖啶橙，AO）和细胞死亡（碘化丙啶，PI）的双染料试剂。AO 组分在与双链 DNA 结合时发出绿色荧光信号，双链 DNA 是细胞活力的指标。PI 成分对死核细胞进行染色，可用于定量治疗后的细胞死亡。为了解释PDO镀层的可变性，我们设计了一种方法，通过将明场图像转换为数字相差图像来确定时间0时每孔的PDO数量（补充图3 和 补充文件1）。
前列腺癌 PDO 用柔红霉素（一种导致细胞死亡的化疗药物）治疗 7 天。实验完成后，按照 补充文件1中的描述用AOPI对样品进行染色，然后分析Gen5中的荧光图像。 图 6A 显示了第 7 天 AOPI 终点测定的一组图像。当将载体处理的PDO（第一行）与用10μM柔红霉素处理的PDO（第二行）进行比较时，绿色荧光（活力测量，第二列）和红色荧光增加（细胞死亡测量，第三列）。然后将这些结果定量到 图6B中，其中我们显示了使用AOPI终点染色技术可以实现的读数阵列。左上图描绘了从 AO 染色生成的活力测量值，归一化为第 0 天每个孔的数字相差图像分析确定的 PDO 计数。这些数据与 图6A的视觉结果相关，其中随着柔红霉素浓度的增加，活力急剧下降。这在右上图中得到了进一步的概括，该图显示了细胞死亡的增加，由PI染色获得的红色荧光的增加表示。
然后将PI数据与活力读数（AO）相结合，计算存活与死比（图6B，左下图）。该比率是确定药物是细胞抑制性还是细胞毒性的有用方法。具体来说，细胞毒性药物将比细胞抑制药物更接近 0，因为具有细胞抑制作用的药物会抑制生长但可能不会诱导细胞死亡。最后，即使 PDO 可能正在经历细胞死亡和起泡，也可以使用 AO 染色剂的绿色荧光准确计算 PDO 的面积。右下图描绘了平均 PDO 面积，其计算方法是子群体分析中表示的面积总和除以 PDO 编号。对该区域的分析可以进一步表明治疗是否只是抑制PDO生长或实际上导致PDO消退。请注意，平均PDO面积的分析是使用GFP通道和细胞分析功能进行的，与 图5D相反，图5D使用明场图像来计算总PDO面积。这些数据突出了分析管道的灵活性，具体取决于数据可用性和用户兴趣。
最后，我们将活力读数的金标准CellTiter-Glo 3D与使用AOPI的活力荧光读数进行了比较（图6C）。请注意，此面板中的数据未归一化为时间 0 PDO 数，因为这种归一化通常不是由使用 CellTiter-Glo 3D 试剂盒的实验室执行的。我们在两种测定中观察到相同的药物作用趋势，其中PDO活力随着柔红霉素浓度的增加而降低。这些读数之间的唯一视觉差异是，CellTiter-Glo 3D 分析在 AOPI 分析之前达到了 IC50，几乎完全达到了 0。这一结果可以用柔红霉素的作用机制来解释。柔红霉素是一种拓扑异构酶-II 抑制剂，可引入双链 DNA 断裂，导致细胞周期停滞并最终细胞凋亡14。在细胞周期停滞期间，可能会发生ATP 耗竭 15。鉴于 CellTiter-Glo 3D 测定基于 ATP-荧光素酶反应以产生发光信号，我们假设在较高浓度的柔红霉素下细胞活力的更强降低是由于 ATP 耗竭而不是细胞完全死亡。为了支持这一观点， 图6A 中的图像描绘了培养物中活着的PDO，如绿色荧光所示。
图 1：电镀、成像和分析方案概述。 将 PDO 接种在 96 孔板中，并用荧光染料和药物处理。实验的成像参数（例如，曝光、Z-stack）是在 Gen5 软件中创建的。图像由 Cytation 5 采集并在 Gen5 中处理，并导出数据以供进一步分析。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：细胞分析功能概述。 1：指定插头：指定插头以包含感兴趣的区域。2：设置主蒙版：主蒙版根据所选通道中的大小和像素强度定义感兴趣的对象。在这张具有代表性的图像中，主蒙版中包含的物体以紫色勾勒出轮廓。3：定义子种群：可以定义一个额外的子种群，以进一步细化所需的种群进行分析。示例图像中的子群体（以黄色勾勒）是根据圆度 （>0.25） 和面积 （>800） 定义的。图像是用 4 倍物镜采集的。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：使用细胞分析功能进行亚群掩蔽的示例。 亚群在明场通道中定义。示例图像中的子群体（以黄色勾勒）是根据圆度 （>0.25） 和面积 （>800） 定义的。图像是用4倍物镜采集的。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：星形孢菌素治疗导致细胞凋亡和细胞毒性的剂量依赖性增加。 在3个时间点（0小时，54小时，114小时）显示了500nM，10nM和0.1nM剂量的星形孢菌素的GFP和TRITC荧光叠加的明场图像（4x物镜）。红色荧光信号表示细胞凋亡（膜联蛋白 V），绿色荧光信号表示细胞毒性（细胞毒素）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：用于评估 PDO 反应的多重荧光活细胞成像。 将PDO型号ONC-10817接种在96孔板中，并与Annexin V Red（1：400）和Cytotox Green（200nM）染料在37°C下孵育过夜。 第二天，用浓度递增的星形孢菌素治疗 PDO，每 6 小时成像一次，持续 ~5 天。（甲、乙）（A）星形孢菌素反应的细胞毒性或（B）细胞凋亡的时间和剂量依赖性增加。数据绘制为GFP或TRITC通道中的物体平均强度。（C） 比较对 100 nM 或 500 nM 星形孢菌素的细胞凋亡和细胞毒性的时间过程。数据绘制为 GFP 和 TRITC 通道中的目标平均强度值。（D） 星形孢菌素抑制PDO的生长。数据绘制为平均总PDO面积。在每个孔中，将A-D中的数据归一化为时间0 h的PDO数，并绘制为平均值和标准误差（SEM）。每个处理 N=5 个技术重复。p < 0.0001 与 2 因素方差分析的车辆控制。（E） 实验结束时（114 小时）500 nM 星形孢菌素处理的 PDO 与载体的代表性明场、GFP 和 TRITC 图像。图像是用 4 倍物镜采集的。（F） 在 114 小时时间点定量细胞毒性、细胞凋亡和活力。GFP 天体平均强度（左）和 TRITC 天体平均强度（中）在 114 小时时间点使用面板 A-C 的结果计算。根据制造商的实验方案，使用 CellTiter-Glo 3D 试剂评估活力（右）。将原始发光 （RLU） 值归一化为时间 0 h 的总 PDO 面积，并绘制为相对于载体控制的倍数活力，设置为 1.0。** p<0.01， ***p<0.001， **** p<0.0001 与通过单因素方差分析与 Dunnett 事后检验的车辆控制。N = 5 次技术重复，每次处理。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：使用活细胞成像来帮助终点检测数据归一化。 用浓度递增的拓扑异构酶-II 抑制剂柔红霉素处理 PDO 7 天。将 PDO 暴露于 AOPI 染色溶液中，并按照 补充文件 1 中的描述进行成像。AO = 吖啶橙，活力的量度（GFP 通道）;PI = 碘化丙啶，细胞死亡的量度（德克萨斯红通道）。（A） 用 10 μM 柔红霉素或载体对照 （0.1% DMSO） 处理 7 天后使用 AOPI 染色获得的代表性图像。（B） 使用 AOPI 荧光作为终点活力/细胞死亡方法的不同读数。有关分析方法的详细说明，请参阅 补充文件 1 。左上角，通过 AO 染色确定的 7 天后 PDO 活力分析。右上，通过PI染色分析细胞死亡。AO 和 PI 染色数据在时间 0 h 归一化为 PDO 值，然后归一化为载体对照，设置为 1.0，并绘制为平均值和标准差。左下角，使用 AO 和 PI 染色的平均对象积分计算活死比。右下角，通过AO染色确定的PDO面积。在GFP通道中进行细胞分析。（C） 比较两种测试PDO生存能力的方法。成像后，根据制造商的方案使用 CellTiter-Glo 3D 试剂评估活力。在柔红霉素浓度增加时绘制了相对于载体对照的倍数生存率。数据表示每次处理 N = 6 次技术重复的平均值和标准差;在图 C 中，数据未归一化为时间 0 小时。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 治疗 | # 井数 | 媒体音量 | 膜联蛋白 | 100μM细胞毒素 | ||
| 稀释 | 卷 | 稀释 | 卷 | |||
| 多重 | 60 | 6.6毫升 | 1:400 | 16.5微升 | 200纳米 | 13.2微升 |
表 1：多路复用实验示例。 膜联蛋白 V Red 结合凋亡细胞膜外叶上暴露的磷脂酰丝氨酸。Cytotox Green 整合到膜完整性受损的细胞中并结合 DNA。
补充图1：ONC-10811的多重活细胞成像。 将 PDO 接种在 96 孔板中，并在 37 °C 下在 Annexin V Red （1：400） 和 Cytotox Green （200 nM） 染料中孵育过夜。 第二天，用浓度递增的星形孢菌素治疗 PDO，每 6 小时成像一次，持续 5 天。（A）对星形孢菌素反应的细胞毒性的时间和剂量依赖性增加。数据绘制为GFP通道中的物体平均强度。（B） 星形孢菌素在114小时时的剂量反应。数据绘制为114小时时间点GFP通道中的目标平均强度值。（C）星形孢菌素凋亡的时间和剂量依赖性增加。数据在TRITC通道中绘制为物体平均强度。（D）星形孢菌素在114小时时的剂量反应。数据绘制为114小时时间点TRITC通道中的目标平均强度值。A 和 C 中的数据在井位的时间 0 h 归一化为 PDO 值。N = 每个模型中每个处理 5 个技术重复。p < 0.0001 与 2 因素方差分析的车辆控制。 请点击此处下载此文件。
补充图 2：膜联蛋白 V 和细胞毒素治疗不会影响 PDO 活力。 将PDO接种在96孔板中，并在37°C下与Annexin V Red（1：400）和Cytotox Green（200nM）染料孵育过夜。 孵育 24 小时后，根据制造商的方案使用 CellTiter-Glo 3D 测定法评估活力。（A） 染料处理和未处理的 PDO 在 24 小时时间点的活力。给出了相对光单位 （RLU） 值和归一化为 PDO 总和面积的值。具体来说，将每个孔的CellTiter-Glo3D RLU归一化为该孔在铺板时（即立即添加染料后）的PDO面积之和。使用细胞分析中的“对象和面积”计算确定总PDO面积。N = 10。（B） 在 114 小时时间点处理和未处理的 PDO 中的活力。给出了原始发光值和归一化为总PDO面积的值。将每个孔的 CellTiter-Glo3D RLU 归一化为镀膜后 24 小时时 PDO 面积的总和，这对应于动力学成像实验中的时间 0 小时。N = 5。使用非配对 t 检验评估 A 和 B 的显着性;P 值列在图表上。 请点击此处下载此文件。
补充图 3：使用数字相差对 PDO 进行无标记分析。 该图包含代表性图像（2.5倍物镜），描绘了补充 文件1：在Gen5软件中设置单个焦平面分析（明场/数字相差图像）和数字相差图像分析中所述的无标记分析。（A） 前列腺癌 PDXO 模型在单个焦平面上的明场图像示例。（B）将A中的明场图像转换为数字相差图像。明场图像中的暗物体在数字相差图像中显示明亮，反之亦然。（C） 使用数字相差图像进行PDO掩蔽的示例。请注意，与明场图像相比，感兴趣对象的边缘变得更加清晰。在此代表性图像中，主掩模中的对象以黄色勾勒出轮廓。（C）（用粉红色勾勒）中的子种群是根据圆度 （>0.3）、面积 （>1000）、Mean[Dig.Ph.Con] > 2000、StdDev[Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500 和 Peak[Dig.Ph.Con] > 12500 定义的。将该代表性图中使用的参数应用于 图 6 中的数据，以归一化为第 0 天的细胞计数。 请点击此处下载此文件。
补充图 4：PDO 模型的形态和镀层一致性可能有所不同。 上图：BME穹顶中PDO的差异色散示例。下图：圆盘PDO与圆形PDO的代表性图像。所有图像均使用EVOS显微镜采集。注意到放大倍数。 请点击此处下载此文件。
补充图 5：使用细胞分析与图像统计量化荧光的示例图像。 使用细胞分析，用户可以在图像中定义特定群体并测量这些区域的荧光。图像统计还可用于通过定义排除背景信号的阈值来测量图像中的荧光。请参阅讨论，了解使用影像统计的局限性。图像以 4 倍放大倍率拍摄。 请点击此处下载此文件。
附表1：类器官培养基组分。请注意，试剂已针对妇科癌症 PDO 的培养进行了优化。请点击此处下载此文件。
补充视频 1：500 nM 星形孢菌素治疗的延时视频，每 6 小时采集一次图像。请点击此处下载此文件。
补充视频 2：100 nM 星形孢菌素治疗的延时视频，每 6 小时采集一次图像。请点击此处下载此文件。
补充视频 3：10 nM 星形孢菌素治疗的延时视频，每 6 小时采集一次图像。请点击此处下载此文件。
补充视频 4：1 nM 星形孢菌素治疗的延时视频，每 6 小时采集一次图像。请点击此处下载此文件。
补充视频 5：0.1 nM 星形孢菌素治疗的延时视频，每 6 小时采集一次图像。请点击此处下载此文件。
补充视频 6：0.01 nM 星形孢菌素治疗的延时视频，每 6 小时采集一次图像。请点击此处下载此文件。
补充视频7：车辆的延时视频（0.06% DMSO），每6小时采集一次图像。请点击此处下载此文件。
补充文件1：补充协议。请点击此处下载此文件。
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Discussion
PDO 培养物因其能够反映细胞反应和行为而成为越来越流行的体外模型系统2。PDO的产生、培养和扩增技术已经取得了重大进展，但分析治疗反应的方法却滞后了。市售的 3D 活力试剂盒是裂解终点测定，错过了潜在有价值的动力学响应数据，并限制了其他方法的后续分析8。新兴研究正在应用活细胞成像来评估PDO模型中的药物反应。在这里，我们提出了一种利用多重荧光活细胞成像评估PDO治疗反应随时间变化的方法。多重荧光染料可以同时定量不同的细胞反应。除了细胞凋亡和细胞毒性之外，我们设想这种方法可以在未来的研究中扩展，以检查PDO中的其他表型效应。
本文介绍的方案旨在获取在96孔板中作为圆顶镀层的PDO的动力学明场和荧光图像。关键步骤包括1）电镀，2）染料和药物处理，3）定义成像参数，4）动力学图像采集完成后的图像预处理和分析，以及5）数据导出以在其他统计软件中分析（图1）。将完整的 PDO 作为 5 μL BME 圆顶接种在 96 孔板中，该圆顶由 BME 和类器官培养基的预定义比例（通常为 1：1）组成。本文介绍的方案使用UltiMatrix作为BME，因为其批次间变异性最小，并且具有出色的成像光学特性。对于在其他BME中培养的PDO的收获，如Matrigel，以及对于团块和难以解离的模型，可能需要进行修改（参见 示例补充图4）。接下来，在接种时（第-1天）将荧光染料以2x浓度在100μL体积中加入类器官培养基中，并孵育过夜以确定基线细胞死亡。第二天（第0天），将药物或其他处理以2x浓度的100μL体积加入类器官培养基中，然后加入每个孔中，最终体积为200μL。200 μL 的最终体积可通过成像降低半月面效应。使用 Cytation 5 酶标仪与 BioSpa 桌面培养箱配合使用来获取动力学图像。BioSpa培养箱允许在37°C的固定温度和5%CO2 的环境中孵育实验板。BioSpa 中最多可以存储 8 个板，因此可以同时进行 8 个实验。每块板的成像参数在 Gen5 软件中使用“成像器手动模式”进行设置，并保存为协议。然后将协议加载到调度软件（BioSpa OnDemand）中。BioSpa OnDemand 软件可自动执行动力学图像采集的工作流程，包括将板从 BioSpa 培养箱物理转移到 Cytation 5 中，并指定在 Gen5 中运行哪种方案进行数据收集。使用 Gen5 软件中的蜂窝分析功能分析图像（图 2）。我们描述了分析荧光和明场图像的Z投影的具体方法。 补充文件 1 中提供了分析单个 Z 平面和/或仅明场图像的具体方法。最后，用户可以定义特定的数据特征，例如PDO面积、数量和平均荧光强度，以导出为Excel电子表格，以便后续对药物效应进行统计分析。
鉴于PDO模型是一个相对较新的模型系统，用于询问药物效应，适应培养条件的方法，特别是BME的生长，仍在出现16。评估PDO对药物治疗反应的大部分研究依赖于基于ATP的终点测定作为细胞健康的替代物（CellTiter-Glo 3D）。该方法需要细胞裂解，因此排除了后续的下游分析。荧光染色、单时间点成像和形态学跟踪等替代终点检测提供了其他指标来表征药物反应，同时允许将样品用于其他目的。例如，板内终点固定方案已被应用于药物效应的高通量分析17,18。这种方法的一个优点是它规避了典型免疫组化和免疫荧光成像19 中所需的大量处理，并且在样品有限时特别有用，例如 PDO 模型。它也适用于使用共聚焦显微镜进行高分辨率成像。另一种不需要细胞裂解的终点检测是使用碘化丙啶或吖啶橙等试剂进行活细胞成像。我们对 CellTiter-Glo 3D 和 AOPI（后者不需要细胞裂解）的比较分析，用于评估细胞活力和死亡（图 6C），突出了在 PDO 模型中使用活细胞成像染料的优势。包括我们在内的几个小组已经应用了这种方法，以评估实验结束时的表型效应18,19,20。然而，使用孔内固定或终点活细胞成像方法采集动力学数据需要大量样品。PDO随时间推移的无标记形态学评估在一定程度上克服了这一局限性，可以使用多种成像方式进行评估8,10,17,18，但形态的变化可能不能代表潜在药物效应的谱，例如细胞凋亡和细胞活力的变化。我们观察到对药物反应的形态变化存在显着的模型间变异性。例如，一些PDO在经历细胞凋亡时面积会增加，而其他模型可能会缩小。在有限数量的研究中，动力学形态学评估已与固定或活细胞荧光终点测定进行多重检测18,20。本文介绍的方法是第一个对不同荧光染料进行多重检测以同时评估高通量系统中的多种细胞效应的方法之一。
动态活细胞成像提供的最大改进之一是它克服了与终点检测相关的关键限制。例如，每孔接种相同数量的PDO在技术上很困难，因为大多数自动细胞计数仪都针对小于60 μm的物体进行门控。活细胞成像允许在每个孔中对时间 0 h 的 PDO 数或面积进行归一化，然后可用于调整孔之间镀层的变化。PDO 的金标准终点测定是 CellTiter-Glo 3D 试剂盒，它测量 ATP 作为细胞活力的替代物。我们在妇科和前列腺癌PDO的研究中广泛使用了这种测定法13,21,22,23,24。除了需要细胞裂解进行 ATP 测量外，药物和其他治疗方式还可以改变 ATP 水平，从而可能提供对治疗反应的不准确评估。利用活细胞成像染料可以量化更广泛的特定细胞反应，例如细胞凋亡和细胞毒性。重要的是，这些试剂不会像碘化丙啶那样扰乱细胞活力或诱导 DNA 损伤;这允许随着时间的推移重复评估 PDO 反应。虽然我们尚未探索使用吖啶橙 （AO） 进行动力学测量，但 AO 的作用机制不应排除将来此类应用。
肿瘤由几个不同的细胞群组成，具有不同的基因组特征和形态。由于PDO模型的复杂异质性，个体PDO反应可能会有所不同，并且跟踪这些反应具有挑战性。我们的协议提供了一种在逐孔的基础上评估多个PDO响应指标的方法。然而，某些技术考虑因素仍然适用于活细胞成像。接种 96 孔板所需的 24 孔板的孔数将取决于每个 PDO 模型的密度和生长速率。由于结块会混淆图像分析（补充图4），PDO模型在电镀前可能需要额外的处理步骤。如有必要，可以在加工过程中使用非宽口径 p200 吸头进行剧烈移液对 PDO 进行机械剪切。在接种前也可以使用TrypLE Express进行酶消化，以促进PDO解离和减少结块。根据我们的经验，我们注意到TrypLE孵育的长度因模型而异。因此，应针对每种模型优化TrypLE孵育，特别是如果研究人员希望获得单细胞悬浮液。对于对酶消化特别敏感的PDO模型，可能需要在开始治疗之前进行恢复。
我们介绍了特定活细胞成像试剂的方法。本文介绍的方法的广泛适用性的局限性是缺乏与BME兼容的试剂。对于尚未针对 PDO 进行优化的其他染料/试剂，可能需要进行额外的故障排除，以确定最佳浓度并最大限度地减少溶剂效应。根据目标读数（例如细胞凋亡或细胞毒性），应使用已知可诱导细胞死亡的化合物（如星形孢菌素或柔红霉素13 ）进行处理，以优化试剂条件。另一个考虑因素是染料集成到 BME 圆顶中的最佳时间。在我们的实验中，我们在治疗前进行过夜孵育，以允许染料完全吸收到圆顶中，并确定基线细胞健康状况。由于信号强度会随着时间的推移而增加，研究人员应该对染料进行初步研究，以确定实验结束时的理想曝光时间，以避免过度曝光的图像。最后，试剂不应干扰细胞过程。例如，插入DNA的染料与动力学成像不相容。然而，活细胞成像可用于终点测定中的数据归一化。事实上，我们提出了一种补充方法，使用AOPI来量化细胞活力和存活率：死细胞比率。在该实验中，通过第0天（治疗日， 图6）的活细胞成像确定，将荧光信号归一化为每个孔的PDO数。
该方法论文的另一个局限性是依赖于手动移液进行实验，这可能导致技术重复的更大差异。通过在实验过程的其他步骤中增加自动化功能，例如使用自动液体处理器进行电镀和药物分配，可以进一步提高数据可重复性，正如其他人所证明的那样8,10。然而，这一增加需要对研究基础设施进行额外投资，而并非所有研究人员都可以使用。鉴于每个模型的 PDO 面积存在异质性，将结果归一化为时间 0 h 的初始 PDO 数或面积仍然是自动播种的有用方法。
与其他活细胞成像平台相比，Cytation 5 的一个关键优势是能够自定义图像和分析功能。然而，Cytation 5/Gen5 软件具有陡峭的学习曲线，并假设用户具有成像基础知识。本方法论文的目标之一是提供分步说明，以减少其他研究人员将复杂的活细胞成像技术纳入其PDO研究计划的障碍。虽然本文介绍的具体分析步骤适用于一个系统，但用户可以将多路复用原理应用于其他平台，但要了解下游分析可能需要使用第三方软件，例如 NIH ImageJ。
应根据实验目标和电镀条件选择分析指标。例如，如果使用荧光染料进行实验来量化细胞死亡，则荧光强度是有效的读数。最有效的荧光指标（总荧光与物平均强度）将取决于电镀条件（补充图4）。如果PDO均匀分散并且具有更圆、更粘的形态，则可以在定义的PDO亚群中确定荧光。Gen5 软件中的具体功能是细胞分析，输出是物体平均强度。但是，如果PDO模型是团块状的或具有盘状形态，我们建议在图像水平上量化荧光信号;此函数可以在“图像统计”下找到，输出为“总荧光强度”。虽然这种方法对于观察单个井水平的变化很有用，但该指标并不特定于感兴趣的对象，如果PDO在实验期间移出指定的塞子，则可能会错误地改变。在存在大量碎片或死单细胞的情况下，建议使用细胞分析来屏蔽任何与PDO无关的荧光信号。使用细胞分析与图像统计的差异结果示例见 补充图 5。
要确定影像统计功能的最佳阈值，可以使用线条工具。使用线条工具，用户可以确定图像内的荧光强度范围。我们将下限阈值设置为图像中峰值强度的 25% 值。要查看指定阈值中包含的荧光区域，请选中“阈值异常值”框。可能需要对下限值进行额外的微调。
活细胞成像的一个重大挑战是存储每次实验产生的大量数据。这在PDO培养物中尤为重要，在PDO培养物中，Z-Stack用于在多个焦平面上成像并生成Z投影。有多种方法可以克服此问题。首先，确保足够的存储容量。我们已经安装了三个固态硬盘，总容量为 17 TB。其他选项包括将实验文件传输到外部硬盘驱动器或网络存储。不建议直接将文件写入基于云的存储。要分析存储在外部驱动器上的数据，只需将实验和图像文件传输到配备 Gen5 软件的计算机上（注意：大文件可能需要很长时间才能传输）。在分析之前，必须将图像重新链接到实验。打开实验文件，单击工具栏中的“协议”，选择“协议选项”。单击“图像保存选项”，然后单击“选择新图像文件夹”。找到图像文件，然后单击“选择文件夹”以重新链接。
根据实验的目标，在 Gen5 中使用分箱功能也可能合适。合并通过降低像素数来减小文件大小，从而导致图像分辨率降低（请参阅步骤 3.5.3.2）。因此，如果需要高分辨率图像，则不建议进行合并。使用像素合并功能时，需要调整曝光设置。创建实验文件后，双击“图像”部分，然后单击显微镜图标以重新打开成像仪手动模式。使用自动曝光功能或根据需要手动调整曝光。
总之，我们提出了评估 PDO 响应细胞毒性药物的细胞凋亡和细胞健康的方法。未来的研究对于优化方法和开发PDO动力学成像的其他分析策略是必要的，例如其他表型和具有细胞抑制性而非细胞毒性的药物的作用。一个主要障碍是与BME相容的染料和试剂的商业可用性。要更好地了解如何充分利用动态活细胞成像从这些模型中提取最多的数据，还需要做更多的工作。
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Disclosures
KWT 是 Immortagen Inc. 的共同所有人，CJD 是安捷伦的员工。JSdB曾在安进、阿斯利康、安斯泰来、拜耳、Bioxcel Therapeutics、勃林格殷格翰、Cellcentric、第一、卫材、基因泰克/罗氏、Genmab、葛兰素史克、鱼叉、ImCheck Therapeutics、Janssen、Merck Serono、Merck Sharp & Dohme、Menarini/Silicon Biosystems、Orion、Pfizer、Qiagen、Sanofi Aventis、Sierra Oncology、Taiho、Terumo和Vertex Pharmaceuticals等公司担任顾问委员会委员;是癌症研究所 （ICR） 的一名雇员，该研究所的研究工作已获得 AZ、安斯泰来、拜耳、Cellcentric、第一、基因泰克、Genmab、葛兰素史克、杨森、默沙东、美纳里尼/Silicon Biosystems、Orion、赛诺菲安万特、Sierra Oncology、Taiho、辉瑞和 Vertex 的资助或其他支持，并且在阿比特龙、PARP 抑制 DNA 修复缺陷癌症方面具有商业利益， 和PI3K/AKT通路抑制剂（无个人收入）;被指定为发明人，对Janssen提交的专利8 822 438没有经济利益，该专利涵盖了醋酸阿比特龙与皮质类固醇的使用;曾是许多行业赞助的临床试验的CI/PI;并且是美国国家卫生研究所 （NIHR） 高级研究员。没有其他作者有任何潜在的利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢爱荷华大学的组织采购核心和 Kristen Coleman 博士提供患者肿瘤标本，并感谢妇产科的 Sofia Gabrilovich 博士协助生成 PDO 模型。我们还要感谢 Valerie Salvatico 博士（美国安捷伦）对手稿的批判性分析。我们感谢以下资金来源：NIH/NCI CA263783 和 DOD CDMRP CA220729P1 KWT;英国癌症研究中心、英国前列腺癌协会、前列腺癌基金会和医学研究委员会对 JSdB。资助者在实验的设计或分析或发表决定中没有任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrfuge tube | Dot Scientific Inc | 1008113 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.100 | |
| 554 NM LED Cube | Agilent | 1225012 | |
| 96-well plate | Corning Costar | 3596 | Prewarmed to 37 °C |
| 96-well plate | Agilent | 204626-100 | Prewarmed to 37 °C |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media) |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634-010 | component of organoid culture media |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Final concentration is 1x (component of organoid culture media) |
| BioTek BioSpa 8 Automated Incubator | Agilent | BIOSPAG-SN | Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10) |
| BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader | Agilent | CYT5PW-SN | Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08) |
| Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Systems | BME001-10 | |
| Daunorubicin HCl | Sigma-Aldrich | S3035 | Reconstituted in DMSO |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Fisher | AM9260G | |
| Forskolin | Tocris | 1099 | Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media) |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Final concentration is 1x (component of organoid culture media) |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media) |
| Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein | Gibco | AF-100-15-1MG | Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Human FGF-10 Recombinant Protein | Gibco | 100-26-1MG | Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Human R-Spondin 1 Recombinant Protein | Gibco | 120-38-5UG | Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technologies | 7926 | Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Imaging Filter Cube- GFP | Agilent | 1225101 | |
| Imaging Filter Cube- TRITC | Agilent | 1225125 | |
| Imaging LED GFP/CFP | Agilent | 1225001 | |
| Incucyte Annexin V Red Dye | Sartorius | 4641 | Reconstituted in organoid culture media |
| Incucyte Cytotox Green Dye | Sartorius | 4633 | DMSO solution |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media) |
| Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution | Fisher-Scientific | 13366169 | Add 1:50 volume |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media) |
| Noggin | R&D Systems | 6057-NG | Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media) |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-05 | Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media) |
| Recombinant Human Heregulinβ-1 | Pepro Tech | 100-03 | Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Staurosporine solution from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | S6942 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604013 | |
| Y-27632, CAS 331752-47-7 | Sigma-Aldrich | 688000 | Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media) |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media) |
References
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