Imagerie multiplexe de cellules vivantes pour les réponses médicamenteuses dans des modèles organoïdes de cancer dérivés de patients

Summary

Les organoïdes tumoraux dérivés de patients sont un système modèle sophistiqué pour la recherche fondamentale et translationnelle. Cet article sur les méthodes détaille l’utilisation de l’imagerie fluorescente multiplexée de cellules vivantes pour l’évaluation cinétique simultanée de différents phénotypes d’organoïdes.

Abstract

Les modèles organoïdes dérivés de patients (PDO) du cancer sont un système de recherche multifonctionnel qui récapitule mieux les maladies humaines par rapport aux lignées cellulaires cancéreuses. Des modèles PDO peuvent être générés en cultivant des cellules tumorales de patients dans des extraits de membrane basale extracellulaire (BME) et en les plaquant sous forme de dômes tridimensionnels. Cependant, les réactifs disponibles dans le commerce qui ont été optimisés pour les tests phénotypiques dans les cultures monocouches ne sont souvent pas compatibles avec l’EMO. Dans cet article, nous décrivons une méthode pour mettre en plaque des modèles PDO et évaluer les effets des médicaments à l’aide d’un système automatisé d’imagerie de cellules vivantes. De plus, nous appliquons des colorants fluorescents compatibles avec les mesures cinétiques pour quantifier simultanément la santé cellulaire et l’apoptose. La capture d’image peut être personnalisée pour se produire à intervalles réguliers sur plusieurs jours. Les utilisateurs peuvent analyser les effets des médicaments dans des images individuelles du plan Z ou une projection Z d’images en série à partir de plusieurs plans focaux. Le masquage permet de calculer des paramètres d’intérêt spécifiques, tels que le nombre de PDO, la surface et l’intensité de fluorescence. Nous fournissons des données de preuve de concept démontrant l’effet des agents cytotoxiques sur la santé, l’apoptose et la viabilité des cellules. Cette plateforme d’imagerie cinétique automatisée peut être étendue à d’autres lectures phénotypiques pour comprendre divers effets thérapeutiques dans les modèles PDO du cancer.

Introduction

Les organoïdes tumoraux dérivés de patients (DO) apparaissent rapidement comme un système modèle robuste pour étudier le développement du cancer et les réponses thérapeutiques. Les PDO sont des systèmes de culture cellulaire tridimensionnels (3D) qui récapitulent le profil génomique complexe et l’architecture de la tumeur primaire ^1,2. Contrairement aux cultures bidimensionnelles (2D) traditionnelles de lignées cellulaires cancéreuses immortalisées, les AOP capturent et maintiennent l’hétérogénéité intratumorale ^3,4, ce qui en fait un outil précieux pour la recherche mécaniste et translationnelle. Bien que les AOP deviennent un système modèle de plus en plus populaire, les réactifs disponibles dans le commerce et les méthodes d’analyse des effets cellulaires compatibles avec les cultures d’ODP sont limités.

Le manque de méthodes robustes pour analyser les changements subtils dans la réponse au traitement entrave la traduction clinique. Le réactif de référence pour la santé cellulaire dans les cultures 3D, CellTiter-Glo 3D, utilise les niveaux d’ATP comme déterminant de la viabilité cellulaire ^5,6. Bien que ce réactif soit utile pour les tests de paramètre, il existe plusieurs mises en garde, notamment l’impossibilité d’utiliser les échantillons à d’autres fins après la fin de l’essai.

L’imagerie des cellules vivantes est une forme sophistiquée de microscopie cinétique qui, lorsqu’elle est combinée à des réactifs fluorescents, a la capacité de quantifier une variété de lectures de la santé cellulaire dans des modèles PDO, y compris l’apoptose ^7,8,9 et la cytotoxicité¹⁰. En effet, l’imagerie de cellules vivantes a fait partie intégrante du criblage à haut débit de composés dans les plateformes 2D^11,12. Des systèmes tels que l’Incucyte ont rendu la technologie abordable et donc accessible aux groupes de recherche dans divers contextes. Cependant, l’application de ces systèmes pour analyser les cultures 3D en est encore à ses balbutiements.

Nous décrivons ici une méthode d’évaluation de la réponse aux médicaments dans des modèles PDO de cancer à l’aide de l’imagerie multiplexée de cellules vivantes (Figure 1). Grâce à l’analyse d’images en fond clair, les changements dans la taille et la morphologie des PDO peuvent être suivis cinétiquement. De plus, les processus cellulaires peuvent être quantifiés simultanément au fil du temps à l’aide de réactifs fluorescents, tels que le colorant rouge Annexine V pour l’apoptose et le colorant vert Cytotox pour la cytotoxicité. Les méthodes présentées sont optimisées pour le système d’imagerie de cellules vivantes Cytation 5, mais ce protocole peut être adapté à différentes plateformes d’imagerie de cellules vivantes.

Protocol

Les études utilisant des échantillons de tumeurs humaines ont été examinées et approuvées par le comité d’examen institutionnel (IRB) de l’Université de l’Iowa, protocole #201809807, et réalisées conformément aux normes éthiques énoncées dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets participant à l’étude. Les critères d’inclusion comprennent un diagnostic de cancer et la disponibilité d’échantillons tumoraux.

1. Placage d’AOP intactes dans une plaque à 96 puits

1. Préparez les réactifs.
   1. Préchauffer les plaques de 96 puits à 37 °C pendant la nuit et décongeler le BME pendant la nuit à 4 °C.
   2. Préparez un milieu de culture organoïde complet optimisé pour la culture du type de cancer d’intérêt. Les milieux de culture spécifiques utilisés pour les expériences présentées dans le présent document sont présentés dans le tableau supplémentaire 1.
      REMARQUE : Les composants du milieu peuvent avoir besoin d’être modifiés pour différents types de tumeurs. Par exemple, le milieu de culture organoïde est complété par de l’œstradiol 100 nM pour les tumeurs gynécologiques¹³. Le milieu préparé est stable à 4 °C pendant 1 mois. Pour un stockage à long terme, aliquoter le milieu dans des tubes de 50 mL et stocker à -20 °C.
2. Préparer deux aliquotes distinctes de milieux de culture organoïdes à 4 °C et 37 °C. Par exemple, si 60 puits sont plaqués dans une plaque de 96 puits, utilisez 6 mL de milieu de culture organoïde chaud et 150 μL de milieu de culture organoïde glacé.
3. Préparer le tampon de lavage des organoïdes : Compléter 1 PBS avec 10 mM HEPES, 1 x Glutamax, 5 mM EDTA et 10 μM Y-27632. Conserver à 4 °C
4. Récoltez les AOP cultivées dans une plaque de 24 puits. Effectuez toutes les étapes sur glace ou à 4 °C, sauf indication contraire.
   1. Aspirer le milieu de chaque puits à l’aide d’un système de conduite sous vide.
   2. Ajouter 500 μL de tampon de lavage organoïde glacé et pipeter doucement 2 à 3 fois à l’aide d’une pipette de 1000 μL. Incuber l’assiette sur de la glace pendant 10 min.
   3. Transférer le contenu de chaque puits dans un tube conique de 50 ml. Pour s’assurer que toutes les AOP sont en suspension, rincez chaque puits avec 300 μL supplémentaires de tampon de lavage organoïde et transférez-les dans le tube conique de 50 mL. Centrifuger pendant 5 min à 350 x g à 4 °C
   4. Aspirer le surnageant de la pastille BME/organoïde à l’aide d’un système de conduite sous vide, en laissant ~ 5 mL restant dans le tube. Ajouter 20 mL de tampon de lavage organoïde et remettre doucement la pastille en suspension à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Incuber sur glace pendant 10 min.
   5. Centrifuger pendant 5 min à 350 x g à 4 °C. Aspirer le surnageant avec un système de conduite à vide, en prenant soin de ne pas perturber la pastille de PDO.
5. Placage des AOP dans une plaque à 96 puits : Effectuer toutes les étapes sur la glace, sauf indication contraire.
   1. Remettre en suspension la pastille PDO dans une quantité appropriée de milieu de culture organoïde glacé pour créer une suspension PDO. Transférer la suspension PDO dans un tube de microcentrifugation glacé de 1,5 ml.
      REMARQUE : Pour calculer la quantité de milieux de culture organoïdes, déterminer le nombre de puits à plaquer dans une plaque de 96 puits, en tenant compte du fait que les PDO sont plaquées dans un dôme de 5 μL dans un rapport de 1:1 entre le milieu de culture organoïde et le BME. Par exemple, lors du placage d’une plaque de 96 puits et de l’utilisation uniquement des 60 puits intérieurs, la quantité totale de suspension PDO nécessaire sera de 300 μL : 150 μL de milieu de culture organoïde et 150 μL de BME. Pour les modèles qui présentent une croissance optimale à différents pourcentages d’EMO, le rapport entre l’EMI et le milieu peut être modifié à cette étape, bien qu’il soit important de normaliser le rapport pour tous les tests pour chaque modèle spécifique. Pour tenir compte de l’erreur de pipetage, ajoutez 10 % de volume à chaque composant.
   2. Comptez le nombre d’AOP.
      1. Transvaser 2,5 μL de suspension PDO dans un tube de microcentrifugation glacé de 1,5 mL et mélanger avec 2,5 μL de BME. Transférez le mélange de 5 μL sur une lame de microscope en verre propre. Ne pas couvrir la glissière. Le mélange se solidifiera en un dôme.
      2. Visualisez à l’aide d’un microscope à fond clair à 4x. Compter le nombre d’AOP dans le mélange de 5 μL ; l’objectif est d’avoir environ 25 à 50 PDO par dôme de 5 μL.
         REMARQUE : Si la densité désirée n’est pas atteinte dans le mélange d’essai, ajuster le volume final de la suspension d’AOP soit en ajoutant plus de milieu de culture organoïde, soit en centrifugeant la suspension d’AOP et en remettant en suspension la pastille d’AOP dans un volume plus faible de milieu de culture organoïde glacé. Quelle que soit la façon dont la suspension de la PDO est modifiée à cette étape, le rapport final BME :suspension PDO à l’étape 1.5.3. devrait être de 1:1.
   3. À l’aide d’une pipette de 200 μL avec des pointes à large diamètre, mélanger soigneusement la suspension PDO avec une quantité égale de BME pour obtenir un rapport de 1:1 entre le milieu de culture organoïde et le BME. Évitez les bulles, qui perturberont l’intégrité des dômes.
   4. À l’aide d’une pipette de 20 μL, ensemencez des dômes de 5 μL au centre de chaque puits d’une plaque préchauffée de 96 puits, en n’ensemenceant que les 60 puits intérieurs. Pour assurer une répartition égale des PDO, pipeter périodiquement le contenu du tube de 1,5 mL avec une pipette de 200 μL avec des pointes à large alésage.
   5. Une fois tous les puits ensemencés, placez le couvercle sur la plaque et retournez doucement. Incuber la plaque inversée à 37 °C pendant 20 min dans l’incubateur de culture tissulaire pour permettre aux dômes de se solidifier.
      REMARQUE : L’inversion de la plaque garantit que le dôme du milieu de culture BME/organoïde conserve la structure 3D pour fournir suffisamment d’espace pour la formation d’AOP.
   6. Retournez l’assiette pour qu’elle repose avec le couvercle vers le haut et incubez pendant 5 min à 37 °C.

2. Traitements et ajout de colorants fluorescents pour le multiplexage

1. Pendant que les dômes BME se solidifient dans les plaques à 96 puits, préparez des dilutions de réactifs d’imagerie fluorescents pour cellules vivantes. Les paramètres spécifiques pour le multiplexage du colorant rouge Annexine V et du colorant vert Cytotox sont donnés ici.
2. Préparation du réactif fluorescent (jour -1) : Calculer le volume approprié de milieu de culture organoïde en fonction du nombre de puits à traiter, en supposant que chaque puits sera traité avec 100 μL de milieu dosé avec un colorant. Diluer le colorant dans un milieu de culture organoïde préchauffé à la concentration désirée.
   REMARQUE : La quantité totale de milieux nécessaires varie en fonction de l’expérience. Ajoutez 10 % au volume final pour tenir compte de l’erreur de pipetage. Par exemple, pour traiter les 60 puits intérieurs d’une plaque de 96 puits, préparer 6,6 mL de milieu dosé au colorant (tableau 1).
3. Traiter chaque puits avec 100 μL de milieux de culture organoïdes dosés 2x colorants. Ajouter 200 μL de PBS stérile 1x dans les puits vides extérieurs de la plaque. Incuber à 37 °C pendant la nuit.
   REMARQUE : Le PBS dans les puits périphériques diminue l’évaporation du média des puits internes.
4. Ajout de médicaments/agents de traitement (jour 0) : Préparer les médicaments dans un milieu de culture organoïde préchauffé à une concentration de 2x dans un volume de 100 μL par puits.
   REMARQUE : Le DMSO peut être toxique pour les cellules à des concentrations élevées. Une concentration de 0,1 % de DMSO n’est pas dépassée dans les expériences réalisées dans cette étude. En plus des médicaments, certains réactifs fluorescents sont distribués sous forme de solution DMSO. Il est important de tenir compte de la concentration totale de DMSO lorsque vous travaillez avec de tels réactifs.
5. Ajouter 100 μL de 2 milieux dosés dans chaque puits ; Évitez de créer des bulles.

3. Configuration des paramètres d’imagerie

1. Placer l’assiette dans Cytation 5. Ouvrir Gen5. Cliquez sur Nouvelle tâche > mode manuel de l’imageur. Sélectionnez Capturer maintenant et entrez les paramètres suivants : Objectif (sélectionnez le grossissement souhaité) ; Filtre (sélectionnez la microplaque) ; Format de microplaque (sélectionnez le nombre de puits) ; et Type de navire (sélectionnez le type de plaque). Cliquez sur Utiliser le couvercle et Utiliser une vitesse de support plus lente. Cliquez sur OK.
   REMARQUE : Type de récipient : Soyez aussi précis que possible lors de la sélection des informations sur la plaque car le logiciel est calibré à la distance spécifique entre l’objectif et le bas de la plaque pour chaque type de plaque et épaisseur du plastique.
   Vitesse de support plus lente : Cochez cette case pour éviter de perturber les dômes lors du chargement/déchargement des plaques.
2. Créez une pile Z qui imagera l’ensemble du dôme BME.
   1. Sélectionnez un puits d’intérêt à afficher (panneau de gauche, sous l’histogramme).
   2. Sélectionnez le canal Fond clair (panneau de gauche, en haut). Cliquez sur Exposition automatique et ajustez les paramètres selon vos besoins.
   3. Définissez le bas et le haut de l’onglet Z-Stack : Expand Imaging Mode (panneau de gauche, au milieu). Cochez la case Z-Stack . À l’aide des flèches de réglage de trajectoire (panneau de gauche, au milieu), cliquez sur le réglage vers le bas jusqu’à ce que tous les PDO soient entrés puis flous et flous. Définissez-le comme le bas de la pile Z. Répétez dans la direction opposée en utilisant les flèches de réglage de cap pour définir le haut de la pile Z.
   4. Pour vous assurer que les paramètres de la pile Z sont appropriés pour d’autres puits d’intérêt, sélectionnez un autre puits (panneau de gauche, sous l’histogramme) et visualisez le haut et le bas de la pile en Z.
   5. Pour saisir manuellement les positions focales, cliquez sur les trois points à côté du réglage fin (panneau de gauche, en haut). Une fenêtre s’ouvrira ; saisissez la valeur de la pile Z supérieure (qui se trouve dans le panneau de gauche, au centre, sous Mode d’imagerie). Répétez l’opération pour la valeur inférieure de la pile Z. Ajustez si nécessaire pour capturer la plage Z souhaitée en répétant l’étape 3.2.3. Si des ajustements étaient nécessaires, sélectionnez un autre puits pour vérifier les paramètres.
3. Définissez les paramètres d’exposition pour le(s) canal(s) fluorescent(s). Les réglages sont décrits pour deux canaux fluorescents (GFP et TRITC). Le nombre spécifique de canaux fluorescents dépendra de l’expérience et des cubes fluorescents installés dans le système d’imagerie de cellules vivantes.
   REMARQUE : Si l’intensité du signal est prévue être significativement plus élevée à la fin de l’expérience, les utilisateurs doivent envisager d’effectuer des expériences d’essai pour déterminer les paramètres d’exposition optimaux à la fin de l’expérience qui peuvent ensuite être appliqués lors de la configuration des paramètres initiaux.
   1. Développez l’onglet Mode d’imagerie (panneau de gauche, au milieu) et ouvrez Modifier l’étape d’imagerie. Une fenêtre contextuelle apparaîtra.
   2. Sous Canaux, cliquez sur la bulle pour le nombre de canaux souhaité. Désignez un canal pour le fond clair et des canaux supplémentaires pour chaque canal fluorescent. Dans cet exemple, canal 1 = champ clair ; Canal 2 = GFP ; Canal 3 = TRITC. À l’aide des menus déroulants Couleur, sélectionnez le paramètre approprié pour chaque canal. Fermez la fenêtre d’édition en cliquant sur OK.
   3. Configurez chaque canal fluorescent.
      1. Basculez le canal sur GFP (panneau de gauche, en haut).
      2. Cliquez sur Exposition automatique (panneau de gauche, en haut). Développez l’onglet Exposition (panneau de gauche, au milieu) et ajustez les paramètres d’exposition pour minimiser le signal d’arrière-plan.
      3. Copiez les paramètres d’exposition dans l’onglet Mode d’image en suivant les étapes 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. Cliquez sur l’icône Copier à côté de la case Modifier l’étape d’imagerie . Cliquez sur Modifier l’étape d’imagerie, ce qui ouvrira une autre fenêtre.
      5. Sous le canal GFP, cliquez sur l’icône Presse-papiers dans la ligne Exposition pour ajouter les paramètres Éclairage, Temps d’intégration et Gain de la caméra au canal.
      6. Répétez les étapes 3.3.3.4 à 3.3.3.5 pour le canal TRITC. Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre.
4. Configurez les étapes de prétraitement d’image et de projection Z pour automatiser le prétraitement d’image.
   1. Cliquez sur l’icône Appareil photo (panneau de gauche, coin inférieur). Une nouvelle fenêtre s’ouvrira.
   2. Sous Ajouter une étape de traitement (panneau de gauche, en bas), cliquez sur Prétraitement de l’image. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira.
   3. Dans l’onglet Fond clair , désélectionnez Appliquer le prétraitement d’image.
   4. Pour chaque onglet Couche fluorescente , assurez-vous que l’option Appliquer le prétraitement de l’image est sélectionnée. Désélectionnez Utiliser les mêmes options que le canal 1 et cliquez sur OK. La fenêtre se fermera.
   5. Sous Ajouter une étape de traitement, cliquez sur Projection Z. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Si vous le souhaitez, ajustez la plage de tranches (par exemple, pour réduire la plage Z). Fermez la fenêtre en sélectionnant OK.
5. Créer un protocole.
   1. Cliquez sur Visionneuse d’images dans la barre d’outils. Dans le menu déroulant, cliquez sur Créer une expérience à partir de cet ensemble d’images. La fenêtre d’imagerie se ferme et la fenêtre de procédure s’ouvre.
      REMARQUE : Les paramètres sélectionnés en mode manuel de l’imageur seront automatiquement chargés dans la nouvelle fenêtre, ce qui permettra de créer un protocole expérimental.
   2. Pour régler la température et le dégradé : Cliquez sur Régler la température sous l’en-tête Actions (à gauche). Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Sélectionnez Incubateur activé et entrez manuellement la température souhaitée sous Température. Ensuite, sous Dégradé, entrez manuellement 1. Fermez la fenêtre en sélectionnant OK.
      REMARQUE : La création d’un gradient de 1 °C empêchera la formation de condensation sur le couvercle de la plaque.
   3. Désignez des puits à l’image.
      1. Double-cliquez sur l’étape Image sous Description. Cliquez sur Plaque complète (coin droit, haut). Cela ouvrira la fenêtre Disposition de la plaque .
      2. Mettez en surbrillance les puits d’intérêt à l’aide du curseur. Cliquez sur OK. Si vous le souhaitez, cochez les cases Binning de la mise au point automatique et Binning de capture . Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre.
         REMARQUE : Le binning nécessitera un réglage de l’exposition, comme décrit à l’étape 3.3.3.2 ci-dessus. Veuillez vous référer à la section Discussion pour connaître les scénarios spécifiques dans lesquels cette fonctionnalité peut être utilisée.
   4. Définissez des intervalles pour l’imagerie cinétique.
      1. Cliquez sur Options sous l’en-tête Autre (à gauche). Cochez la case Procédure cinétique discontinue .
      2. Sous Durée totale estimée, saisissez la durée d’exécution de l’expérience (par exemple, 5 jours). Sous Intervalle estimé, entrez l’intervalle pour imager la plaque (par exemple, toutes les 6 h).
      3. Cliquez sur Pause après chaque exécution pour laisser le temps à la plaque d’être transférée dans l’incubateur. Fermez la fenêtre en sélectionnant OK.
   5. Mettre à jour les étapes de réduction des données.
      1. Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre Procédure. Un onglet s’ouvre pour mettre à jour les étapes de réduction des données. Sélectionnez Oui. Double-cliquez sur Prétraitement d’image. Cliquez sur les différents canaux pour vérifier les paramètres et cliquez sur OK.
      2. Double-cliquez sur Projection Z. Cliquez sur les différents canaux pour vérifier les paramètres. Cliquez sur OK. Cliquez ensuite à nouveau sur OK pour fermer la fenêtre Réduction des données.
   6. Formatez la disposition de la plaque.
      1. Ouvrez l’assistant de disposition de plaque et désignez les types de puits en suivant les étapes 3.6.2 à 3.6.3.
      2. Cliquez sur l’icône Disposition de plaque dans la barre d’outils (coin gauche, en haut) pour ouvrir l’assistant de disposition de plaque.
      3. Cochez les cases à côté des types de puits utilisés dans l’expérience. Sous Contrôles de dosage, entrez le nombre de types de contrôle différents à l’aide des flèches. Cliquez sur Suivant pour ouvrir la fenêtre Contrôle du test #1 .
      4. Définir les conditions du puits témoin d’essai en suivant les étapes 3.6.5 à 3.6.8.
      5. Dans la fenêtre Contrôle d’essai #1, entrez l’étiquette de contrôle dans la case ID de disposition de plaque . Si vous le souhaitez, entrez le nom complet dans la case adjacente. Sélectionnez le nombre de répétitions pour la condition de contrôle respective à l’aide des flèches.
      6. Si vous utilisez plusieurs concentrations ou une série de dilutions dans le contrôle, cliquez sur Définir les dilutions/concentrations et utilisez le menu déroulant pour sélectionner le type. Inscrivez les valeurs de chaque concentration/dilution dans le tableau.
         REMARQUE : La fonction automatique peut être utilisée si les concentrations changent par incréments constants.
      7. Sélectionnez l’onglet Couleur dans la barre d’outils. Choisissez la couleur de texte et la couleur d’arrière-plan souhaitées pour le contrôle dans le menu déroulant. Cliquez sur Suivant.
      8. Répétez si nécessaire avec des commandes supplémentaires.
      9. Définir les conditions du puits d’échantillonnage conformément aux 3.6.10 à 3.6.12.
      10. Sur la page Configuration de l’exemple , entrez le préfixe de l’ID de l’exemple (par exemple, SPL). Sélectionnez le nombre de répétitions à l’aide des flèches. Si vous utilisez des échantillons avec des concentrations de traitement variables, sélectionnez Concentrations ou Dilutions dans le menu déroulant Type . Entrez les dilutions/concentrations dans le tableau et entrez les unités dans la case Unité .
      11. Sélectionnez Champs d’identification dans la barre d’outils. Entrez le nom de la catégorie souhaitée (p. ex., ID de l’échantillon, médicament) dans le tableau.
      12. Sélectionnez l’onglet Couleur dans la barre d’outils. Sélectionnez une couleur différente pour chaque groupe de traitement/échantillon. Cliquez sur Terminer. Cela ouvrira la page Disposition de la plaque.
          REMARQUE : Les chiffres sur le côté gauche correspondent aux différents numéros d’échantillon.
      13. Attribuez des exemples d’ID en suivant les étapes 3.6.14 à 3.6.16.
      14. Choisir SPL1 dans le panneau de gauche. Utilisez le curseur pour sélectionner les puits.
          REMARQUE : Les outils de sélection automatique peuvent être ajustés dans la zone d’affectation en série. Le nombre de répétitions et l’orientation de la mise en page peuvent être prédéterminés.
      15. Répétez avec d’autres échantillons pour terminer la disposition de la plaque. Une fois satisfait, cliquez sur OK.
      16. Dans la barre d’outils Fichier , sélectionnez Exemples d’ID. Remplissez les colonnes ID de l’échantillon avec les informations appropriées pour chaque échantillon (par exemple, le type de médicament). Appuyez sur OK.
   7. Enregistrez le protocole.
      1. Dans la barre d’outils, cliquez sur Fichier > Enregistrer le protocole sous. Sélectionnez l’emplacement d’enregistrement du fichier. Entrez un nom de fichier. Cliquez sur Enregistrer pour fermer la fenêtre.
      2. Cliquez sur Fichier > Quitter dans la barre d’outils. Un onglet s’ouvrira pour enregistrer les modifications apportées au mode manuel de l’imageur. Sélectionnez Non.
      3. Un onglet s’ouvrira pour enregistrer les modifications apportées à l’expérience 1. Sélectionnez Non. Un onglet s’ouvre pour mettre à jour la définition du protocole. Sélectionnez Mettre à jour. Fermez le logiciel.
6. Importez le protocole dans BioSpa OnDemand et terminez la configuration de l’expérience.
   1. Ouvrez le logiciel BioSpa OnDemand (logiciel de planification).
   2. Sélectionnez un emplacement disponible dans le logiciel.
   3. Retirez la plaque du système d’imagerie de cellules vivantes. Cliquez sur Ouvrir le tiroir pour accéder à l’emplacement approprié dans le logiciel de planification et insérez la plaque. Cliquez sur Fermer le tiroir.
      REMARQUE : Cette étape peut être effectuée à tout moment une fois que le protocole a été créé à l’étape 3.5.7 ci-dessus. Cependant, la plaque doit être dans la Cytation 5 pour effectuer un essai de synchronisation à l’étape 3.6.4.3 ci-dessous.
   4. Importez le protocole.
      1. Sous l’onglet Informations sur la procédure , sélectionnez Utilisateur dans le menu déroulant. En regard de l’emplacement Protocole , cliquez sur Sélectionner > Ajouter une nouvelle entrée.
      2. À côté de l’emplacement Protocole, cliquez sur Sélectionner. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre pour naviguer vers le protocole souhaité dans l’architecture de fichiers. Cliquez sur Ouvrir pour importer le protocole dans le logiciel de planification.
      3. Entrez le temps nécessaire pour imager la plaque. Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre Liste des protocoles Gen5 .
         REMARQUE : Cette étape est particulièrement importante lorsque vous exécutez plusieurs tests à la fois. Pour déterminer le temps nécessaire à la création d’images, cliquez sur Effectuer une exécution de minutage maintenant. Cliquez sur OK.
   5. Définissez des intervalles d’imagerie et planifiez l’expérience.
      1. Sous Intervalle, entrez l’intervalle d’imagerie désigné à l’étape 3.5.4.
      2. Sous Options d’heure de début, sélectionnez Lorsque disponible. Sous Durée, sélectionnez Fixe ou Continu.
         REMARQUE : Une heure de début spécifique peut être désignée au lieu d’exécuter le protocole à la prochaine heure disponible. La sélection de Durée fixe définit un point de terminaison spécifique pour l’expérience et oblige l’utilisateur à désigner une période d’expérimentation. La durée continue permet à l’expérience de s’exécuter sans point de terminaison et ne peut être terminée que par un utilisateur qui arrête l’expérience.
      3. Cliquez sur Programmer la plaque/le récipient. Cela ouvrira la séquence de validation de la plaque. Un onglet s’ouvrira avec l’heure de première lecture proposée. Cliquez sur Oui pour accepter cette planification.

4. Analyse d’images dans le logiciel Gen5 (Figure 2)

1. Ouvrez le module Analyse d’images.
   1. Ouvrez Gen5. Dans le Gestionnaire des tâches, sélectionnez Expériences > Ouvrir. Sélectionnez le test pour ouvrir le fichier. Cliquez sur Vue > plaque dans la barre d’outils.
   2. Remplacez le menu déroulant Données par Projection Z. Double-cliquez sur un puits qui vous intéresse. Sélectionnez Analyser > je souhaite configurer une nouvelle étape de réduction des données d’analyse d’image. Cliquez sur OK.
2. Analyse cellulaire
   1. Masque primaire
      1. Sous Paramètres d’analyse, sélectionnez Type : Canal d’analyse et de détection cellulaire : ZProj[Tsf[Bright Field]] (panneau de gauche, au centre).
      2. Cliquez sur Options. Cela ouvrira la page Masque principal et nombre. Dans la zone Seuil , cochez Auto et cliquez sur Appliquer. Cliquez sur la zone Mettre en surbrillance les objets (panneau de droite, en bas) pour afficher les objets dans le seuil désigné. Ajustez si nécessaire pour inclure des objets d’intérêt.
         REMARQUE : les paramètres de seuil sont basés sur l’intensité des pixels. Par exemple, si le seuil est défini sur 5000, les pixels d’une intensité supérieure à 5000 seront inclus dans l’analyse.
      3. Sous Sélection d’objet, désignez la taille minimale et maximale de l’objet (μm). Ajustez si nécessaire pour exclure les débris cellulaires/cellules individuelles.
         REMARQUE : La taille de l’AOP peut varier considérablement entre les différents modèles et types. Utilisez l’outil de mesure du logiciel Gen5 pour déterminer les seuils de taille de PDO minimum et maximum pour chaque modèle. Les utilisateurs peuvent choisir un seuil de taille minimale de PDO plus petit par rapport à la valeur fournie par l’outil de mesure afin d’éviter l’exclusion de fragments de PDO à des moments ultérieurs après le traitement médicamenteux.
      4. Pour limiter l’analyse à une certaine région du puits, désélectionnez Analyser l’image entière et cliquez sur Bouchage. Dans la fenêtre Image Plug , utilisez le menu déroulant pour sélectionner Forme de plug . Ajustez les paramètres de taille et de position selon les besoins pour s’adapter à la région d’intérêt.
         REMARQUE : Il est important de maximiser le nombre de PDO dans la prise tout en excluant les zones sans PDO pour minimiser le bruit de fond. Désignez une taille de fiche qui capturera de manière cohérente la majorité des objets d’intérêt dans les répétitions. Il est important de générer un bouchon qui exclut également les bords du dôme car il exclut tous les objets qui peuvent sembler déformés en raison de la réfraction de la lumière de la courbure extrême du dôme autour des bords. Inclure les objets de bord principaux peut également être désélectionné pour capturer uniquement des PDO entiers dans la prise.
   2. Analyse des sous-populations. Un exemple de désignation de sous-population est fourni à la figure 3.
      1. Cliquez sur Mesures calculées dans la barre d’outils Analyse cellulaire. Cliquez sur Sélectionner ou créer des mesures d’intérêt au niveau de l’objet (coin droit, en bas). Sous Métriques d’objet disponible, sélectionnez les métriques d’intérêt (par exemple, circularité) et cliquez sur le bouton Insérer. Cliquez sur OK.
         REMARQUE : La morphologie et la densité de chaque modèle d’ODP détermineront les meilleurs paramètres d’intérêt pour distinguer la sous-population.
      2. Cliquez sur Analyse de sous-population dans la barre d’outils Analyse cellulaire . Cliquez sur Ajouter pour créer une nouvelle sous-population. Une fenêtre contextuelle s’ouvrira.
      3. Si vous le souhaitez, entrez un nom pour la sous-population. Sous Mesures d’objet, sélectionnez une mesure qui vous intéresse et appuyez sur Ajouter une condition. Dans la fenêtre Modifier la condition , entrez les paramètres de la mesure d’objet choisie. Répétez l’opération avec des mesures supplémentaires si nécessaire.
         REMARQUE : Les paramètres peuvent être ajustés manuellement ou réglés à l’aide de l’outil de recherche. Par exemple, pour exclure les débris, les utilisateurs peuvent ajouter Surface comme mesure d’objet et sélectionner des objets inférieurs à 800. La circularité en tant que métrique d’objet est couramment utilisée, et tous les objets dont la circularité est supérieure à 0,2-0,5 sont inclus, selon le modèle.
      4. Dans le tableau en bas de la fenêtre, cochez les résultats souhaités à afficher. Cliquez sur OK > Appliquer.
      5. Pour afficher les objets de la sous-population, utilisez le menu déroulant Détails de l’objet (panneau de droite, centre) pour sélectionner la sous-population. Les objets qui entrent dans les paramètres seront mis en évidence dans l’image.
         REMARQUE : pour modifier les couleurs de surbrillance du masque principal et de la sous-population, cliquez sur Paramètres (panneau de droite, en bas).
      6. Pour ajuster les paramètres de sous-population, rouvrez la fenêtre Analyse de sous-population à partir de la barre d’outils Analyse cellulaire . Sélectionnez la sous-population et cliquez sur Modifier. Cliquez sur Ajouter une étape.
         REMARQUE : Cela appliquera la même analyse à tous les puits de l’expérience à tous les points temporels. Dans le menu déroulant de la page Matrice, différentes mesures peuvent être sélectionnées pour une visualisation individuelle.

5. Exporter des données de Gen5 vers Excel

1. Pour personnaliser un fichier de données à exporter, sélectionnez l’icône Générateurs de rapports/exportations dans la barre d’outils. Dans la fenêtre contextuelle, cliquez sur Nouvelle exportation vers Excel.
2. Sur la page Propriétés de la fenêtre contextuelle, sélectionnez Portée > plaque et contenu > personnalisé. Cliquez sur l’option Contenu dans la barre d’outils. Cliquez sur Modifier le modèle, ce qui ouvrira le programme Excel.
3. Dans la feuille de calcul, sélectionnez Compléments > Tableau > Données de puits. Passez la souris sur les différentes sélections pour voir les options d’exportation. Sélectionnez la métrique d’intérêt (par exemple, Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
   REMARQUE : La disposition des plaques peut être ajoutée au modèle d’analyse de feuille de calcul en sélectionnant Compléments > Résumé > disposition du protocole.
4. Une fenêtre d’édition s’ouvre. Dans la zone Wells , désignez les puits à exporter par Well-ID ou Well #. Sélectionnez OK. Un modèle sera chargé dans le fichier de feuille de calcul. Fermez la feuille de calcul. Le modèle est automatiquement enregistré.
5. Cliquez sur OK dans la fenêtre Nouvelle exportation vers Excel et fermez la fenêtre Générateurs de rapports/exportations .
6. Cliquez sur l’icône Exporter dans la barre d’outils Gen5. Cochez la case à côté du fichier d’exportation souhaité. Cliquez sur OK. Gen5 remplira automatiquement le modèle de feuille de calcul et ouvrira le fichier dans Excel.

6. Analyse des données externes

1. Ouvrez le fichier d’exportation (.xlsx) dans Excel.
2. Pour chaque puits, divisez chaque valeur individuelle par la valeur de 0:00 pour ce puits. Cela définira le point de temps 0 égal à 1, et chaque valeur au-delà sera relative à la lecture initiale.
3. Ouvrez un nouveau fichier dans le logiciel d’analyse de données. Sélectionnez l’option de mise en page XY .
   REMARQUE : Dans ce protocole, GraphPad Prism (version 9.5.1) a été utilisé.
4. Étiquettes d’entrée pour chaque groupe de données. Copiez et collez les points temporels et les valeurs normalisées correspondantes pour chaque groupe de traitement dans la table Prism. Un graphique pour les données sera automatiquement généré et se trouve sous Graphiques.

Representative Results

Notre objectif était de démontrer la faisabilité de l’utilisation de l’imagerie multiplexée de cellules vivantes pour évaluer la réponse thérapeutique de la PDO. Des expériences de preuve de concept ont été réalisées dans deux modèles PDO distincts de cancer de l’endomètre : ONC-10817 et ONC-10811 (voir la figure supplémentaire 1 et la figure supplémentaire 2 pour les données ONC-10811). L’apoptose (coloration à l’annexine V) et la cytotoxicité (absorption de Cytotox Green) ont été surveillées cinétiquement en réponse à l’agent inducteur de l’apoptose, la staurosporine. Plus précisément, les AOP ont été placées dans des plaques à 96 puits, traitées avec des colorants Annexine V Rouge et Cytotox Green, et placées dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit, comme le montre la figure 1. Nous avons confirmé dans deux modèles PDO indépendants que le traitement avec les colorants Annexine V et Cytotox Green n’est pas toxique (Figure supplémentaire 2). Le lendemain, les PDO ont été traités avec des concentrations croissantes de staurosporine (0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 500 nM). Par la suite, des protocoles ont été établis dans le logiciel Gen5 et les expériences ont été programmées pour se dérouler sur une période de 5 jours, à raison d’une imagerie toutes les 6 heures. Les données ont été analysées à l’aide de la fonction d’analyse cellulaire du logiciel Gen5, comme décrit à la section 4 du protocole. Le masque principal a été réglé à l’aide de la fonction de seuil automatique avec « Diviser les objets en contact » décochée et avec des paramètres de taille de minimum : 30 μm et maximum : 1000 μm. La sous-population PDO a été définie par une circularité > 0,25. Les intensités moyennes de l’objet dans les canaux TRITC (annexine V, apoptose) et GFP (Cytotox Green, cytotoxicité) au sein de la sous-population désignée de PDO ont été exportées sous forme de fichier .xlsx pour une analyse plus approfondie. L’intensité moyenne de l’objet pour chaque puits à chaque point temporel dans les canaux GFP et TRITC a été normalisée au temps 0. Les données de fluorescence normalisées ont ensuite été transférées dans un fichier Prism et visualisées sous forme de tracé linéaire.

Le traitement par staurosporine a entraîné une augmentation significative et dose-dépendante de l’apoptose et une diminution de la santé cellulaire au fil du temps par rapport au contrôle des véhicules, comme en témoigne l’augmentation de l’intensité moyenne de l’objet dans les canaux TRITC (annexine V) et GFP (Cytotox) (Figure 4, Figure 5, Vidéo supplémentaire 1, Vidéo supplémentaire 2, Vidéo supplémentaire 3, Vidéo supplémentaire 4, Vidéo supplémentaire 5, Vidéo supplémentaire 6 et Vidéo supplémentaire 7). Les doses de 500 nM, 100 nM et 10 nM de staurosporine ont chacune entraîné une augmentation statistiquement significative de l’apoptose et de la cytotoxicité au fil du temps (figure 5A-C) ainsi qu’à la fin de l’expérience (figure 5E, F). De plus, la staurosporine a inhibé efficacement la croissance et la formation de PDO à ces concentrations, comme le démontre une diminution globale de la surface totale de PDO, tandis que les puits témoins ont montré une augmentation de la surface totale de PDO (figure 4 et figure 5D).

Étant donné que l’un des principaux avantages de l’imagerie des cellules vivantes est la capacité de corriger la variabilité du placage, nous avons réalisé une expérience dans laquelle la viabilité cellulaire a été évaluée comme mesure finale. Les données de test de validation de concept ont été recueillies à l’aide d’un modèle PDO généré à partir d’une xénogreffe de cancer de la prostate dérivée d’un patient. Des images en fond clair ont été recueillies au début de la période de traitement (jour 0), suivies de l’ajout d’un réactif à double colorant qui mesure à la fois la viabilité (orange acridine, AO) et la mort cellulaire (iodure de propidium, PI). Le composant AO émet un signal fluorescent vert lors de la liaison à l’ADN double brin, un indicateur de la viabilité cellulaire. Le composant PI colore les cellules nucléées mortes et peut être utilisé pour quantifier la mort cellulaire en réponse au traitement. Afin de tenir compte de la variabilité de l’ensemencement des PDO, nous avons conçu une méthode pour déterminer le nombre de PDO par puits au temps 0 en convertissant les images en fond clair en images numériques à contraste de phase (figure supplémentaire 3 et fichier supplémentaire 1).

Les PDO du cancer de la prostate ont été traités avec de la daunorubicine, un agent de chimiothérapie qui provoque la mort cellulaire, pendant 7 jours. À la fin de l’expérience, les échantillons ont été colorés avec l’AOPI comme décrit dans le fichier supplémentaire 1, suivi d’une analyse des images fluorescentes en Gen5. La figure 6A montre un panel d’images du test du paramètre AOPI au jour 7. En comparant les AOP traitées avec véhicule (première rangée) aux AOP traitées avec de la daunorubicine 10 μM (deuxième rangée), on a observé une nette diminution de la fluorescence verte (mesure de la viabilité, colonne deux) et une augmentation de la fluorescence rouge (mesure de la mort cellulaire, colonne trois). Ces résultats ont ensuite été quantifiés dans la figure 6B, où nous montrons l’ensemble des lectures qui peuvent être obtenues en utilisant la technique de coloration des paramètres AOPI. Le graphique en haut à gauche représente la mesure de viabilité générée à partir de la coloration AO, normalisée au nombre de PDO déterminé par l’analyse d’image numérique à contraste de phase de chaque puits au jour 0. Ces données sont en corrélation avec le résultat visuel de la figure 6A, selon lequel à mesure que la concentration de daunorubicine augmente, la viabilité diminue considérablement. Ceci est récapitulé dans le graphique en haut à droite, qui démontre une augmentation de la mort cellulaire dénotée par une augmentation de la fluorescence rouge acquise avec la coloration PI.

Les données de l’IP ont ensuite été combinées avec la lecture de viabilité (AO) pour calculer un rapport viable/mort (figure 6B, graphique en bas à gauche). Ce rapport est une approche utile pour déterminer si un médicament est cytostatique ou cytotoxique. Plus précisément, un médicament cytotoxique atteindra beaucoup plus près de 0 qu’un médicament cytostatique en raison du fait qu’un médicament cytostatique inhibera la croissance mais ne peut pas induire la mort cellulaire. Enfin, la surface des PDO peut être calculée avec précision en utilisant la fluorescence verte de la coloration AO, même lorsque les PDO peuvent subir une mort cellulaire et des bulles. Le graphique en bas à droite représente la superficie moyenne de l’AOP, qui a été calculée comme la somme de la superficie indiquée dans l’analyse de la sous-population divisée par le nombre d’AOP. L’analyse de la zone peut donner une indication supplémentaire quant à savoir si un traitement inhibe simplement la croissance de la PDO ou provoque réellement une régression de la PDO. Il convient de noter que l’analyse de la surface moyenne de l’ODP a été effectuée à l’aide du canal GFP et de la fonction d’analyse cellulaire, contrairement à la figure 5D, qui a utilisé les images en fond clair pour calculer la surface totale de l’ODP. Ces données mettent en évidence la flexibilité du pipeline d’analyse en fonction de la disponibilité des données et de l’intérêt des utilisateurs.

Enfin, nous avons comparé l’étalon-or pour les lectures de viabilité, CellTiter-Glo 3D, à la lecture de fluorescence de viabilité à l’aide de l’AOPI (Figure 6C). Notez que les données de ce panel n’ont pas été normalisées au temps 0 PDO car cette normalisation n’est généralement pas effectuée par les laboratoires utilisant le kit CellTiter-Glo 3D. Nous avons observé la même tendance pour l’effet du médicament dans les deux essais, où la viabilité de l’ODP diminuait à mesure que la concentration de daunorubicine augmentait. La seule différence visuelle entre ces lectures était que l’analyse 3D CellTiter-Glo atteignait une IC50 avant l’analyse AOPI et atteignait presque complètement 0. Ce résultat peut s’expliquer par le mécanisme d’action de la daunorubicine. La daunorubicine est un inhibiteur de la topoisomérase-II qui introduit des cassures d’ADN double brin, conduisant à l’arrêt du cycle cellulaire et finalement à l’apoptose¹⁴. Lors de l’arrêt du cycle cellulaire, une déplétion de l’ATP peut se produire¹⁵. Étant donné que le test CellTiter-Glo 3D est basé sur une réaction ATP-luciférase pour générer un signal de luminescence, nous émettons l’hypothèse que la plus forte réduction de la viabilité cellulaire à des concentrations plus élevées de daunorubicine était due à la déplétion en ATP plutôt qu’à la mort cellulaire complète. À l’appui de cette idée, les images de la figure 6A représentent une population vivant avec des AOP dans la culture, comme l’indique la fluorescence verte.

Figure 1 : Présentation du protocole de placage, d’imagerie et d’analyse. Les AOP sont plaquées dans une plaque de 96 puits et traitées avec des colorants fluorescents et des médicaments. Les paramètres d’imagerie de l’expérience (par exemple, exposition, Z-stack) sont créés dans le logiciel Gen5. Les images sont acquises par le Cytation 5 et traitées dans Gen5, et les données sont exportées pour une analyse plus approfondie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Vue d’ensemble de la fonction d’analyse cellulaire. 1 : Désigner la fiche : Une fiche est désignée pour inclure les zones d’intérêt. 2 : Définir le masque principal : Le masque principal définit les objets d’intérêt en fonction de leur taille et de leur intensité en pixels dans un canal de choix. Dans cette image représentative, les objets inclus dans le masque principal sont entourés de violet. 3 : Définir la sous-population : Une sous-population supplémentaire peut être définie pour affiner davantage la population souhaitée pour l’analyse. La sous-population de l’exemple d’image (encadrée en jaune) est définie en fonction de la circularité (>0,25) et de la superficie (>800). Les images ont été acquises avec un objectif 4x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Exemples de masquage de sous-populations à l’aide de la fonction Analyse cellulaire. Les sous-populations sont définies dans le canal en fond clair. La sous-population dans les images d’exemple (encadrée en jaune) est définie en fonction de la circularité (>0,25) et de la superficie (>800). Les images ont été acquises avec un objectif 4X. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Le traitement à la staurosporine entraîne une augmentation dose-dépendante de l’apoptose et de la cytotoxicité. Des images en fond clair (objectif 4x) avec superposition de fluorescence GFP et TRITC sont présentées pour les doses de 500 nM, 10 nM et 0,1 nM de staurosporine à 3 moments : 0 h, 54 h, 114 h. Le signal fluorescent rouge indique l’apoptose (annexine V) et le signal fluorescent vert indique la cytotoxicité (Cytotox). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Imagerie fluorescente multiplexée de cellules vivantes pour évaluer la réponse PDO. Le modèle PDO ONC-10817 a été plaqué dans des plaques de 96 puits et incubé avec des colorants Annexin V Red (1:400) et Cytotox Green (200 nM) pendant la nuit à 37 °C. Le lendemain, les PDO ont été traités avec des concentrations croissantes de staurosporine et ont été imagés toutes les 6 heures pendant ~5 jours. (A,B) Augmentation dépendante du temps et de la dose de (A) cytotoxicité ou (B) d’apoptose en réponse à la staurosporine. Les données ont été tracées sous forme d’intensité moyenne de l’objet dans le canal GFP ou TRITC. (C) Comparaison de l’évolution temporelle de l’apoptose et de la cytotoxicité en réponse à la staurosporine 100 nM ou 500 nM. Les données ont été tracées sous forme de valeurs d’intensité moyenne de l’objet dans les canaux GFP et TRITC. (D) La staurosporine inhibe la croissance des APO. Les données ont été représentées comme la superficie totale moyenne de l’AOP. Les données de A-D ont été normalisées en fonction du nombre d’ODP au temps 0 h dans chaque puits et tracées comme la moyenne et l’erreur-type de la moyenne (SEM). N = 5 répétitions techniques par traitement. p < 0,0001 par rapport au contrôle du véhicule par ANOVA à 2 voies. (E) Images représentatives en fond clair, GFP et TRITC de PDO traitées à la staurosporine de 500 nM par rapport au véhicule à la fin de l’expérience (114 h). Les images ont été acquises avec un objectif 4x. (F) Quantification de la cytotoxicité, de l’apoptose et de la viabilité à 114 h. L’intensité moyenne de l’objet GFP (à gauche) et l’intensité moyenne de l’objet TRITC (au milieu) ont été calculées au point temporel de 114 h à l’aide des résultats des panneaux A à C. La viabilité (à droite) a été évaluée à l’aide du réactif CellTiter-Glo 3D selon le protocole du fabricant. Les valeurs de luminescence brute (RLU) ont été normalisées à la surface totale de PDO au temps 0 h et tracées comme la viabilité du pli par rapport à la commande du véhicule, qui a été fixée à 1,0. ** p<0,01, ***p<0,001, **** p<0,0001 par rapport au contrôle du véhicule par ANOVA unidirectionnelle avec le test post-hoc de Dunnett. N = 5 répétitions techniques par traitement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Utilisation de l’imagerie de cellules vivantes pour aider à la normalisation des données d’essai des critères d’évaluation. Les PDO ont été traitées avec des concentrations croissantes de l’inhibiteur de la topoisomérase-II, la daunorubicine, pendant 7 jours. Les AOP ont été exposés à la solution de coloration AOPI et imagés comme décrit dans le fichier supplémentaire 1. AO = orange acridine, une mesure de viabilité (canal GFP) ; PI = iodure de propidium, une mesure de la mort cellulaire (canal Texas Red). (A) Images représentatives acquises par coloration AOPI après 7 jours de traitement avec 10 μM de daunorubicine ou contrôle du véhicule (0,1 % DMSO). (B) Différentes lectures utilisant la fluorescence AOPI comme méthode de viabilité finale/mort cellulaire. Voir le fichier supplémentaire 1 pour une description détaillée des méthodes d’analyse. En haut à gauche, analyse de la viabilité des PDO après 7 jours, déterminée par coloration AO. En haut à droite, analyse de la mort cellulaire par coloration PI. Les données pour la coloration AO et PI ont été normalisées en fonction du nombre de PDO au temps 0 h, puis en fonction du contrôle du véhicule, qui a été fixé à 1,0, et tracé comme la moyenne et l’écart-type. En bas à gauche, calcul du rapport viable/mort en utilisant les intégrales d’objet moyennes pour les colorations AO et PI. En bas à droite, la surface des AOP déterminée par coloration AO. L’analyse cellulaire a été effectuée dans le canal GFP. (C) Comparaison de deux méthodes pour tester la viabilité de l’AOP. Après l’imagerie, la viabilité a été évaluée à l’aide du réactif 3D CellTiter-Glo selon le protocole du fabricant. La survie au pli par rapport au témoin du véhicule a été tracée à des concentrations croissantes de daunorubicine. Les données représentent la moyenne et l’écart-type pour N = 6 répétitions techniques par traitement ; les données n’ont pas été normalisées à l’heure 0 h dans le panneau C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Traitement	# de puits	Volume multimédia	Annexe		Cytotox 100 μM
			Dilution	Volume	Dilution	Volume
Multiplex	60	6,6 ml	1:400	16,5 μL	200 nM	13,2 μL

Tableau 1 : Exemple d’expérience de multiplexage. L’annexine V rouge se lie à la phosphatidylsérine exposée sur le feuillet externe des membranes cellulaires apoptotiques. Cytotox Green s’intègre dans les cellules dont l’intégrité membranaire est compromise et lie l’ADN.

Figure supplémentaire 1 : Imagerie multiplexe de cellules vivantes d’ONC-10811. Les PDO ont été conditionnés dans des plaques à 96 puits et incubés dans des colorants Annexin V Red (1:400) et Cytotox Green (200 nM) pendant la nuit à 37 °C. Le lendemain, les PDO ont été traités avec des concentrations croissantes de staurosporine et ont été imagés toutes les 6 heures pendant 5 jours. (A) Augmentation de la cytotoxicité en fonction du temps et de la dose en réponse à la staurosporine. Les données ont été tracées en tant qu’intensité moyenne de l’objet dans le canal GFP. (B) Relation dose-réponse de la staurosporine à 114 h. Les données ont été tracées sous forme de valeurs d’intensité moyenne de l’objet dans le canal GFP au point temporel de 114 h. (C) Augmentation de l’apoptose en fonction du temps et de la dose en réponse à la staurosporine. Les données ont été tracées sous forme d’intensité moyenne de l’objet dans le canal TRITC. (D) Relation dose-réponse de la staurosporine à 114 h. Les données ont été tracées sous forme de valeurs d’intensité moyenne de l’objet dans le canal TRITC au point de temps de 114 h. Les données en A et C ont été normalisées en fonction du nombre de PDO au temps 0 h au niveau du puits. N = 5 répétitions techniques par traitement dans chaque modèle. p < 0,0001 par rapport au contrôle du véhicule par ANOVA à 2 voies. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Le traitement par l’annexine V et le cytotox ne perturbe pas la viabilité des ODP. Les PDO ont été plaquées dans des plaques de 96 puits et incubées avec des colorants Annexine V Rouge (1:400) et Cytotox Green (200 nM) pendant la nuit à 37 °C. Après l’incubation de 24 heures, la viabilité a été évaluée à l’aide du test CellTiter-Glo 3D selon le protocole du fabricant. (A) Viabilité des AOP traitées et non traitées à 24 heures. Les valeurs relatives de l’unité de lumière (RLU) et les valeurs normalisées en fonction de la surface totale PDO sont présentées. Plus précisément, la RLU CellTiter-Glo3D pour chaque puits a été normalisée à la somme de la zone PDO de ce puits au moment du placage (c’est-à-dire immédiatement après l’ajout de colorant). La surface totale de l’ODP a été déterminée à l’aide du calcul de la « superficie de somme des objets » dans l’analyse cellulaire. N = 10. (B) Viabilité des AOP traitées et non traitées à 114 h. Les valeurs de luminescence brutes et les valeurs normalisées à la surface totale de PDO sont présentées. Le RLU CellTiter-Glo3D pour chaque puits a été normalisé à la somme de la zone PDO à 24 h après le placage, ce qui correspond au temps 0 h dans les expériences d’imagerie cinétique. N = 5. La signification dans A et B a été évaluée à l’aide d’un test t non apparié ; Les valeurs p sont indiquées sur les graphiques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Analyse sans marquage des PDO à l’aide du contraste de phase numérique. Cette figure contient des images représentatives (objectif 2,5x) illustrant l’analyse sans marquage comme décrit dans le Fichier supplémentaire 1 : Configuration des paramètres d’imagerie pour une analyse à plan focal unique (images en fond clair/contraste de phase numérique) et l’analyse d’images numériques en contraste de phase dans le logiciel Gen5. (A) Exemple d’image en fond clair d’un modèle PDXO de cancer de la prostate à un seul plan focal. (B) L’image en fond clair de A a été convertie en image numérique à contraste de phase. Les objets sombres de l’image en fond clair apparaissent clairs dans l’image à contraste de phase numérique et vice versa. (C) Exemple de masquage PDO à l’aide de l’image de contraste de phase numérique. Notez que les bords des objets d’intérêt deviennent beaucoup plus définis que les images en fond clair. Dans cette image représentative, les objets du masque principal sont entourés de jaune. La sous-population en (C) (englobée en rose) est définie en fonction de la circularité (>0,3), de la superficie (>1000), de la moyenne [Dig.Ph.Con] > 2000, de la StdDev[Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500 et du pic [Dig.Ph.Con] > 12500. Les paramètres utilisés dans cette figure représentative ont été appliqués aux données de la figure 6 pour normaliser le nombre de cellules au jour 0. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Les modèles d’AOP peuvent varier dans leur morphologie et leur consistance de placage. Panneau supérieur : Exemples de dispersion différentielle des PDO dans les dômes BME. Panneau inférieur : Images représentatives des AOP discohésives et circulaires. Toutes les images ont été acquises avec un microscope EVOS. Les grossissements sont notés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 5 : Exemples d’images utilisant l’analyse cellulaire par rapport aux statistiques d’image pour quantifier la fluorescence. Grâce à l’analyse cellulaire, les utilisateurs peuvent définir des populations spécifiques dans une image et mesurer la fluorescence dans ces régions. Les statistiques d’image peuvent également être utilisées pour mesurer la fluorescence d’une image en définissant un seuil pour exclure les signaux de fond. Voir la discussion pour connaître les limites de l’utilisation des statistiques d’image. Les images sont à un grossissement de 4x. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Composants des milieux de culture organoïdes. Notez que les réactifs ont été optimisés pour la culture d’AOP pour le cancer gynécologique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 1 : Vidéo en accéléré d’un traitement à la staurosporine de 500 nM avec des images acquises toutes les 6 h. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 2 : Vidéo en accéléré d’un traitement à la staurosporine de 100 nM avec des images acquises toutes les 6 h. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 3 : Vidéo en accéléré d’un traitement à la staurosporine de 10 nM avec des images acquises toutes les 6 h. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 4 : Vidéo en accéléré d’un traitement à la staurosporine de 1 nM avec des images acquises toutes les 6 h. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 5 : Vidéo accélérée d’un traitement à la staurosporine de 0,1 nM avec des images acquises toutes les 6 h. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 6 : Vidéo en accéléré d’un traitement à la staurosporine de 0,01 nM avec des images acquises toutes les 6 h. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 7 : Vidéo en accéléré du véhicule (0,06 % DMSO) avec des images acquises toutes les 6 h. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Protocoles supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les cultures PDO deviennent un système modèle in vitro de plus en plus populaire en raison de leur capacité à refléter les réponses et les comportements cellulaires². Des progrès significatifs ont été réalisés dans les techniques de génération, de culture et d’expansion des AOP, mais les méthodes d’analyse des réponses thérapeutiques ont pris du retard. Les kits de viabilité 3D disponibles dans le commerce sont des tests lytiques de fin d’évaluation, qui ne disposent pas de données de réponse cinétique potentiellement précieuses et limitent les analyses ultérieures par d’autres méthodes⁸. Des études émergentes appliquent l’imagerie de cellules vivantes pour évaluer les réponses aux médicaments dans des modèles PDO. Ici, nous présentons une méthode pour évaluer les réponses thérapeutiques PDO au fil du temps en utilisant l’imagerie fluorescente multiplexée de cellules vivantes. Le multiplexage des colorants fluorescents permet de quantifier simultanément différentes réponses cellulaires. En plus de l’apoptose et de la cytotoxicité, nous envisageons que cette approche puisse être étendue dans de futures études pour examiner d’autres effets phénotypiques dans les DO.

Le protocole présenté ici est conçu pour acquérir des images cinétiques en fond clair et fluorescentes de PDO plaquées en dôme dans une plaque de 96 puits. Les étapes clés comprennent 1) le placage, 2) le traitement avec un colorant et un médicament, 3) la définition des paramètres d’imagerie, 4) le prétraitement et l’analyse de l’image à la fin de l’acquisition de l’image cinétique et 5) l’exportation des données pour analyse dans d’autres logiciels statistiques (Figure 1). Les PDO intacts sont placés dans une plaque de 96 puits sous forme de dômes BME de 5 μL composés d’un rapport prédéfini de BME et de milieux de culture organoïdes (généralement 1:1). Le protocole présenté ici utilise UltiMatrix comme BME en raison d’une variabilité minimale d’un lot à l’autre et de propriétés optiques supérieures pour l’imagerie. Des modifications peuvent être nécessaires pour récolter des AOP cultivées dans d’autres BME, comme Matrigel, ainsi que pour les modèles grumeleux et difficiles à dissocier (voir les exemples de la figure supplémentaire 4). Ensuite, des colorants fluorescents sont ajoutés au milieu de culture organoïde au moment du placage (jour -1) à une concentration de 2x dans un volume de 100 μL et incubés pendant la nuit pour déterminer la mort cellulaire de base. Le lendemain (jour 0), des médicaments ou d’autres traitements sont ajoutés au milieu de culture organoïde à une concentration de 2x dans un volume de 100 μL, puis ajoutés à chaque puits pour un volume final de 200 μL. Le volume final de 200 μL réduit l’effet ménisque avec l’imagerie. Les images cinétiques sont acquises à l’aide du lecteur de plaques Cytation 5 associé à l’incubateur de table BioSpa. L’incubateur BioSpa permet l’incubation de plaques expérimentales à une température fixe de 37 °C et à 5 % de CO₂ dans un environnement. Jusqu’à 8 plaques peuvent être stockées dans le BioSpa et ainsi 8 expériences peuvent être menées simultanément. Les paramètres d’imagerie de chaque plaque sont configurés dans le logiciel Gen5 à l’aide du « mode manuel de l’imageur » et enregistrés en tant que protocole. Le protocole est ensuite chargé dans le logiciel de planification (BioSpa OnDemand). Le logiciel BioSpa OnDemand automatise le flux de travail pour l’acquisition d’images cinétiques, y compris le transfert physique de la plaque de l’incubateur BioSpa vers Cytation 5 et la dictée du protocole à exécuter dans Gen5 pour la collecte de données. Les images sont analysées à l’aide de la fonction d’analyse cellulaire du logiciel Gen5 (Figure 2). Nous décrivons des méthodes spécifiques pour analyser les projections Z d’images fluorescentes et en fond clair. Des méthodes spécifiques pour analyser des plans Z uniques et/ou uniquement des images en fond clair sont fournies dans le fichier supplémentaire 1. Enfin, les utilisateurs peuvent définir des caractéristiques de données spécifiques, telles que la surface, le nombre et l’intensité moyenne de la fluorescence PDO, à exporter sous forme de feuille de calcul Excel pour une analyse statistique ultérieure des effets des médicaments.

Étant donné que les modèles PDO sont un système de modèle relativement nouveau pour interroger les effets des médicaments, des méthodes pour s’adapter aux conditions de culture, en particulier la croissance de l’EMB, sont encore émergentes¹⁶. La majeure partie des études évaluant la réponse de la PDO au traitement médicamenteux reposent sur des tests de paramètres basés sur l’ATP comme substitut de la santé cellulaire (CellTiter-Glo 3D). Cette méthode nécessite une lyse cellulaire, ce qui empêche les analyses ultérieures en aval. D’autres critères d’évaluation, tels que la coloration fluorescente, l’imagerie à point unique et le suivi morphologique, ont fourni d’autres paramètres pour caractériser la réponse aux médicaments tout en permettant l’utilisation de l’échantillon à des fins supplémentaires. Par exemple, des protocoles de fixation des paramètres dans la plaque ont été appliqués pour l’analyse à haut débit des effets des médicaments^17,18. L’un des avantages de cette méthode est qu’elle contourne le traitement intensif requis par l’immunohistochimie et l’imagerie immunofluorescente^{typiques 19} et est particulièrement utile lorsque l’échantillon est limité, comme c’est le cas pour les modèles PDO. Il se prête également à l’imagerie à haute résolution avec microscopie confocale. Un autre test de paramètre qui ne nécessite pas de lyse cellulaire est l’imagerie de cellules vivantes avec des réactifs tels que l’iodure de propidium ou l’orange d’acridine. Notre analyse comparative de CellTiter-Glo 3D et AOPI, ce dernier ne nécessitant pas de lyse cellulaire, pour l’évaluation de la viabilité et de la mort des cellules (Figure 6C) met en évidence les avantages de l’utilisation de colorants d’imagerie de cellules vivantes dans les modèles PDO. Cette méthode a été appliquée par plusieurs groupes, dont le nôtre, pour évaluer les effets phénotypiques à la fin d’une expérience 18,19,20. Cependant, l’acquisition de données cinétiques à l’aide de la méthode de fixation dans le puits ou de l’imagerie de cellules vivantes nécessite un échantillon important. L’évaluation morphologique sans marquage des PDO au fil du temps permet en partie de surmonter cette limitation et peut être évaluée à l’aide d’un large éventail de modalités d’imagerie 8,10,17,18, mais les changements morphologiques peuvent ne pas être représentatifs du spectre des effets potentiels des médicaments tels que l’apoptose et les changements dans la viabilité cellulaire. Nous avons observé une variabilité significative d’un modèle à l’autre dans les changements morphologiques en réponse aux médicaments. Par exemple, certains PDO augmenteront en surface au fur et à mesure qu’ils subiront l’apoptose, tandis que d’autres modèles peuvent rétrécir. Les évaluations morphologiques cinétiques ont été multiplexées avec des tests de paramètres fluorescents fixes ou sur cellules vivantes dans un nombre limité d’études^18,20. Les méthodes présentées ici sont parmi les premières à multiplexer différents colorants fluorescents pour évaluer simultanément plusieurs effets cellulaires dans un système à haut débit.

L’une des plus grandes améliorations apportées par l’imagerie cinétique des cellules vivantes est qu’elle surmonte les principales limites associées aux tests de point final. Par exemple, le placage d’un nombre égal d’ODP par puits est techniquement difficile car la plupart des compteurs de cellules automatisés sont fermés pour les objets de moins de 60 μm. L’imagerie des cellules vivantes permet de normaliser le nombre ou la surface de PDO à l’instant 0 h dans chaque puits, ce qui peut ensuite être utilisé pour ajuster la variation du placage entre les puits. Le test de référence pour les PDO est le kit CellTiter-Glo 3D, qui mesure l’ATP comme substitut de la viabilité cellulaire. Nous avons largement utilisé ce test dans nos études sur les PDOs^{gynécologiques} et du cancer de la prostate 13,21,22,23,24. En plus de nécessiter une lyse cellulaire pour les mesures d’ATP, les médicaments et autres modalités thérapeutiques peuvent modifier les niveaux d’ATP, ce qui peut fournir une évaluation inexacte de la réponse thérapeutique. L’utilisation de colorants d’imagerie de cellules vivantes permet de quantifier un plus large éventail de réponses cellulaires spécifiques, telles que l’apoptose et la cytotoxicité. Il est important de noter que ces réactifs ne perturbent pas la viabilité cellulaire et n’induisent pas de dommages à l’ADN, comme c’est le cas avec l’iodure de propidium ; cela permet une évaluation répétée de la réponse PDO au fil du temps. Bien que nous n’ayons pas exploré l’utilisation de l’orange d’acridine (AO) pour les mesures cinétiques, le mécanisme d’action de l’AO ne devrait pas empêcher une telle application à l’avenir.

Les tumeurs sont constituées de plusieurs populations cellulaires distinctes avec des profils génomiques et des morphologies variables. En raison de l’hétérogénéité complexe des modèles PDO, les réponses individuelles peuvent varier et le suivi de ces réponses est difficile. Notre protocole fournit une méthode pour évaluer plusieurs mesures de réponse PDO puits par puits. Cependant, certaines considérations techniques s’appliquent toujours à l’imagerie des cellules vivantes. Le nombre de puits d’une plaque de 24 puits nécessaires pour ensemencer une plaque de 96 puits dépendra de la densité et du taux de croissance de chaque modèle d’ODP. Étant donné que l’agglutination peut fausser l’analyse des images (Figure supplémentaire 4), les modèles PDO peuvent nécessiter des étapes de traitement supplémentaires avant le placage. Si nécessaire, les PDO peuvent être cisaillées mécaniquement pendant le traitement par un pipetage vigoureux avec une pointe p200 à alésage non large. La digestion enzymatique à l’aide de TrypLE Express peut également être utilisée avant le placage pour favoriser la dissociation des PDO et réduire l’agglutination. D’après notre expérience, nous avons constaté que la durée d’incubation de TrypLE est très variable selon le modèle. Par conséquent, l’incubation de TrypLE doit être optimisée pour chaque modèle, en particulier si les chercheurs souhaitent obtenir des suspensions unicellulaires. Un temps de récupération avant le début du traitement peut être nécessaire pour les modèles PDO qui sont particulièrement sensibles à la digestion enzymatique.

Nous présentons des méthodes pour des réactifs spécifiques d’imagerie de cellules vivantes. Une limitation de l’applicabilité large des méthodes présentées ici est le manque de réactifs compatibles avec l’EMB. Pour d’autres colorants/réactifs qui n’ont pas encore été optimisés pour une utilisation dans les PDO, un dépannage supplémentaire peut être nécessaire pour déterminer la concentration optimale et minimiser les effets des solvants. Selon la lecture d’intérêt (par exemple, apoptose ou cytotoxicité), un traitement avec un composé connu pour induire la mort cellulaire, comme la staurosporine ou la daunorubicine¹³ , doit être utilisé pour optimiser les conditions réactives. Une considération supplémentaire est le moment optimal pour l’intégration du colorant dans le dôme BME. Dans nos expériences, nous effectuons une incubation d’une nuit avant le traitement pour permettre l’absorption complète du colorant dans les dômes et déterminer la santé cellulaire de base. Étant donné que l’intensité du signal augmentera avec le temps, les chercheurs devraient effectuer des études pilotes avec les colorants pour déterminer le temps d’exposition idéal à la fin de l’expérience afin d’éviter les images surexposées. Enfin, les réactifs ne doivent pas interférer avec les processus cellulaires. Par exemple, les colorants qui s’intercalent dans l’ADN ne sont pas compatibles avec l’imagerie cinétique. Cependant, l’imagerie des cellules vivantes peut être utilisée pour la normalisation des données dans les tests de point final. En effet, nous présentons une méthode supplémentaire pour quantifier la viabilité cellulaire et le ratio viable/cellules mortes à l’aide de l’AOPI. Dans cette expérience, le signal fluorescent est normalisé en fonction du nombre de PDO pour chaque puits, tel que déterminé par l’imagerie des cellules vivantes au jour 0 (jour du traitement, figure 6).

Une autre limite de cet article méthodologique est le recours au pipetage manuel pour les expériences, ce qui peut entraîner une plus grande variance dans les répétitions techniques. D’autres améliorations de la reproductibilité des données peuvent être obtenues en ajoutant l’automatisation à d’autres étapes du processus expérimental, comme l’utilisation d’un manipulateur de liquide automatisé pour le placage et la distribution de médicaments, comme l’ont démontré d’autres ^8,10. Cependant, cet ajout nécessite un investissement supplémentaire dans l’infrastructure de recherche qui peut ne pas être disponible pour tous les chercheurs. Compte tenu de l’hétérogénéité de la zone PDO pour chaque modèle, la normalisation des résultats au nombre ou à la surface PDO initiale au temps 0 h est toujours une approche utile avec l’ensemencement automatisé.

L’un des principaux avantages de Cytation 5 par rapport aux autres plates-formes d’imagerie de cellules vivantes est la possibilité de personnaliser les fonctions d’image et d’analyse. Cependant, le logiciel Cytation 5/Gen5 a une courbe d’apprentissage abrupte et suppose que les utilisateurs ont une connaissance de base de l’imagerie. L’un des objectifs de cet article sur les méthodes est de fournir des instructions étape par étape pour réduire l’obstacle à l’intégration de techniques sophistiquées d’imagerie de cellules vivantes dans leurs programmes de recherche PDO. Bien que les étapes d’analyse spécifiques présentées ici concernent un seul système, les utilisateurs peuvent appliquer les principes de multiplexage à d’autres plates-formes, étant entendu que l’analyse en aval peut nécessiter l’utilisation de logiciels tiers, tels que NIH ImageJ.

Les mesures d’analyse doivent être choisies en fonction des objectifs expérimentaux et des conditions de placage. Par exemple, si l’expérience est menée à l’aide d’un colorant fluorescent pour quantifier la mort cellulaire, l’intensité de la fluorescence est une lecture efficace. La mesure de fluorescence la plus efficace (fluorescence totale par rapport à l’intensité moyenne de l’objet) dépendra des conditions de placage (figure supplémentaire 4). Si les AOP sont uniformément dispersées et ont une morphologie plus circulaire et cohésive, la fluorescence peut être déterminée dans une sous-population d’AOP définie. La fonction spécifique du logiciel Gen5 est l’analyse cellulaire, et la sortie est l’intensité moyenne de l’objet. Cependant, si le modèle PDO est grumeleux ou a une morphologie discohésive, nous recommandons de quantifier le signal de fluorescence au niveau de l’image ; cette fonction se trouve sous Statistiques d’image, et la sortie est Intensité de fluorescence totale. Bien que cette méthode soit utile pour observer les changements au niveau du puits individuel, cette mesure n’est pas spécifique aux objets d’intérêt et pourrait changer par erreur si les PDO se déplacent à l’extérieur du bouchon désigné pendant la durée de l’expérience. Dans les scénarios où il y a beaucoup de débris ou de cellules isolées mortes, l’utilisation de l’analyse cellulaire est suggérée pour éliminer tout signal fluorescent qui n’est pas spécifiquement associé à une PDO. Un exemple de résultats différentiels utilisant l’analyse cellulaire par rapport aux statistiques d’image est présenté dans la figure supplémentaire 5.

Pour déterminer le seuil optimal pour la fonction Statistiques d’image, l’outil Ligne peut être utilisé. À l’aide de l’outil de ligne, les utilisateurs peuvent déterminer la plage d’intensité de fluorescence dans une image. Nous définissons le seuil inférieur comme la valeur de 25 % de l’intensité maximale dans l’image. Pour afficher les zones fluorescentes incluses dans le seuil désigné, cochez la case « Seuils aberrants ». Il peut être nécessaire d’affiner davantage la valeur seuil inférieure.

Un défi important en imagerie de cellules vivantes est de stocker l’énorme quantité de données générées avec chaque expérience. Ceci est particulièrement pertinent dans le cas des cultures PDO, où les Z-Stacks sont utilisés pour imager sur plusieurs plans focaux et générer une projection Z. Il existe plusieurs méthodes pour surmonter ce problème. Tout d’abord, assurez-vous d’une capacité de stockage adéquate. Nous avons installé trois disques durs SSD d’une capacité totale de 17 To. D’autres options incluent le transfert de fichiers expérimentaux sur des disques durs externes ou un stockage en réseau. Il n’est pas recommandé d’écrire directement des fichiers sur un stockage en nuage. Pour analyser les données stockées sur un disque externe, il suffit de transférer l’expérience et les fichiers d’images sur un ordinateur équipé du logiciel Gen5 (REMARQUE : le transfert des fichiers volumineux peut prendre beaucoup de temps). Avant l’analyse, les images doivent être reliées à l’expérience. Ouvrez le fichier d’expérience, cliquez sur Protocole dans la barre d’outils, sélectionnez Options de protocole. Cliquez sur Options d’enregistrement d’image, puis sur Sélectionner un nouveau dossier d’image. Localisez le fichier image et cliquez sur Sélectionner un dossier pour le relier.

En fonction des objectifs de l’expérience, il peut également être approprié d’utiliser la fonction de regroupement dans Gen5. Le binning diminue la taille du fichier en diminuant le nombre de pixels, ce qui entraîne une résolution d’image plus faible (voir étape 3.5.3.2). Par conséquent, le regroupement n’est pas recommandé si des images haute résolution sont requises. Lors de l’utilisation de la fonction de compartimentage, les paramètres d’exposition devront être ajustés. Une fois le fichier expérimental créé, double-cliquez sur la section Image, puis cliquez sur l’icône du microscope pour rouvrir le mode manuel de l’imageur. Utilisez la fonction d’exposition automatique ou ajustez manuellement l’exposition si nécessaire.

En résumé, nous présentons des méthodes d’évaluation de l’apoptose et de la santé cellulaire des PDO en réponse à des agents cytotoxiques. Des études futures sont nécessaires pour optimiser les méthodes et développer des stratégies d’analyse supplémentaires pour l’imagerie cinétique des DO, telles que d’autres phénotypes et effets des médicaments cytostatiques plutôt que cytotoxiques. Un obstacle majeur est la disponibilité commerciale de colorants et de réactifs compatibles avec le BME. Il reste encore du travail à faire pour mieux comprendre comment l’imagerie cinétique des cellules vivantes peut être pleinement utilisée pour extraire le plus de données de ces modèles.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)