Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Multiplekset levende celleavbildning for legemiddelrespons i pasientavledede organoidmodeller av kreft

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/66072
Automatic Translation
*1,2, *1, *3, 1, 1, 1,4, 1, 1, 5, 6, 3, 1,7
1Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, 4Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 6Agilent Technologies, 7Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa
* These authors contributed equally

Summary

Pasientavledede tumororganoider er et sofistikert modellsystem for grunnleggende og translasjonsforskning. Denne metodeartikkelen beskriver bruken av multiplekset fluorescerende levende celleavbildning for samtidig kinetisk vurdering av forskjellige organoidfenotyper.

Abstract

Pasientavledede organoide (PUD) modeller av kreft er et multifunksjonelt forskningssystem som bedre rekapitulerer menneskelig sykdom sammenlignet med kreftcellelinjer. PUD-modeller kan genereres ved å dyrke pasienttumorceller i ekstracellulære kjellermembranekstrakter (BME) og plating dem som tredimensjonale kupler. Kommersielt tilgjengelige reagenser som er optimalisert for fenotypiske analyser i monolagskulturer, er imidlertid ofte ikke kompatible med BME. Her beskriver vi en metode for å plate PUD-modeller og vurdere legemiddeleffekter ved hjelp av et automatisert live-cell imaging system. I tillegg bruker vi fluorescerende fargestoffer som er kompatible med kinetiske målinger for å kvantifisere cellehelse og apoptose samtidig. Bildeopptak kan tilpasses til å skje med jevne mellomrom over flere dager. Brukere kan analysere medikamenteffekter i individuelle Z-planbilder eller en Z-projeksjon av serielle bilder fra flere fokalplan. Ved hjelp av maskering beregnes spesifikke parametere av interesse, for eksempel PUD-nummer, areal og fluorescensintensitet. Vi tilbyr proof-of-concept-data som demonstrerer effekten av cytotoksiske midler på cellehelse, apoptose og levedyktighet. Denne automatiserte kinetiske bildebehandlingsplattformen kan utvides til andre fenotypiske avlesninger for å forstå ulike terapeutiske effekter i PUD-modeller av kreft.

Introduction

Pasientavledede tumororganoider (PUD) fremstår raskt som et robust modellsystem for å studere kreftutvikling og terapeutiske responser. PUD er tredimensjonale (3D) cellekultursystemer som rekapitulerer den komplekse genomiske profilen og arkitekturen til primærtumor 1,2. I motsetning til tradisjonelle todimensjonale (2D) kulturer av immortaliserte kreftcellelinjer, fanger og opprettholder PUDer intratumoral heterogenitet 3,4, noe som gjør dem til et verdifullt verktøy for både mekanistisk og translasjonsforskning. Selv om PUD blir et stadig mer populært modellsystem, er kommersielt tilgjengelige reagenser og analysemetoder for cellulære effekter som er kompatible med PUD-kulturer begrenset.

Mangelen på robuste metoder for å analysere subtile endringer i behandlingsrespons hindrer klinisk oversettelse. Gullstandardens cellehelsereagens i 3D-kulturer, CellTiter-Glo 3D, benytter ATP-nivåer som en determinant for celle levedyktighet 5,6. Selv om dette reagenset er nyttig for endepunktanalyser, er det flere advarsler, spesielt manglende evne til å bruke prøver til andre formål etter at analysen er fullført.

Levende celleavbildning er en sofistikert form for kinetisk mikroskopi som, kombinert med fluorescerende reagenser, har kapasitet til å kvantifisere en rekke cellehelseavlesninger i PUD-modeller, inkludert apoptose 7,8,9 og cytotoksisitet10. Faktisk har levende celleavbildning vært integrert i høy gjennomstrømningsscreening av forbindelser i 2D-plattformer11,12. Systemer som Incucyte har gjort teknologien rimelig og dermed tilgjengelig for forskningsgrupper i en rekke innstillinger. Imidlertid er anvendelsen av disse systemene for å analysere 3D-kulturer fortsatt i sin barndom.

Her beskriver vi en metode for å vurdere legemiddelrespons i PUD-modeller av kreft med multiplekset levende celleavbildning (figur 1). Gjennom analyse av lysfeltbilder kan endringer i PUD-størrelse og morfologi overvåkes kinetisk. Videre kan cellulære prosesser kvantifiseres samtidig over tid ved bruk av fluorescerende reagenser, slik som Annexin V Red Dye for apoptose og Cytotox Green Dye for cytotoksisitet. Metodene som presenteres er optimalisert for Cytation 5 live-cell imaging system, men denne protokollen kan tilpasses på tvers av forskjellige live-celle bildebehandlingsplattformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studier ved bruk av humane tumorprøver ble gjennomgått og godkjent av University of Iowa Institutional Review Board (IRB), protokoll # 201809807, og utført i samsvar med de etiske standardene som fastsatt i Helsinki-erklæringen fra 1964 og senere endringer. Informert samtykke ble innhentet fra alle forsøkspersonene som deltok i studien. Inkluderingskriterier inkluderer en diagnose av kreft og tilgjengeligheten av tumorprøver.

1. Plettering av intakte PUD-er i en 96-brønns plate

  1. Forbered reagenser.
    1. Forvarm 96-brønnsplater ved 37 °C over natten og tine BME over natten ved 4 °C.
    2. Forbered full organoid kultur media optimalisert for dyrking av kreft type interesse. Spesifikke dyrkningsmedier brukt for eksperimenter vist her er gitt i tilleggstabell 1.
      MERK: Mediekomponenter må kanskje modifiseres for forskjellige tumortyper. For eksempel er organoidkulturmediet supplert med 100 nM østradiol for gynekologiske svulster13. Tilberedte medier er stabile ved 4 °C i 1 måned. For langtidsoppbevaring, allikoter mediet i 50 ml rør og oppbevar ved -20 °C.
  2. Tilbered to separate alikoter av organoidkulturmedier ved 4 °C og 37 °C. For eksempel, hvis 60 brønner blir belagt i en 96-brønnsplate, bruk 6 ml varmt organoidkulturmedium og 150 μL iskaldt organoidkulturmedium.
  3. Forbered organoid vaskebuffer: Suppler 1x PBS med 10 mM HEPES, 1x Glutamax, 5 mM EDTA og 10 μM Y-27632. Oppbevares ved 4 °C
  4. Harvest PUD dyrket i en 24-brønns plate. Utfør alle trinn på is eller ved 4 °C med mindre annet er angitt.
    1. Aspirer medier fra hver brønn ved hjelp av et vakuumledningssystem.
    2. Tilsett 500 μL iskald organoidvaskebuffer og pipetter forsiktig 2-3x med en 1000 μL pipettor. Inkuber platen på is i 10 min.
    3. Overfør innholdet i hver brønn til et 50 ml konisk rør. For å sikre at alle PUD-ene er i suspensjon, skyll hver brønn med ytterligere 300 μL organoid vaskebuffer og overfør til det koniske røret på 50 ml. Sentrifuge i 5 minutter ved 350 x g ved 4 °C
    4. Aspirer supernatanten fra BME / organoid pellet ved hjelp av et vakuumledningssystem, slik at ~ 5 ml forblir i røret. Tilsett 20 ml organoid vaskebuffer og resuspender pelleten forsiktig med en 10 ml serologisk pipette. Inkuber på is i 10 min.
    5. Sentrifuge i 5 min ved 350 x g ved 4 °C. Aspirer supernatanten med et vakuumledningssystem, og pass på at du ikke forstyrrer PUD-pelleten.
  5. Plettering av PUD i en 96-brønns plate: Utfør alle trinn på is med mindre annet er angitt.
    1. Resuspender PUD-pelleten i en passende mengde iskalde organoidkulturmedier for å skape en PUD-suspensjon. Overfør PUD-suspensjon til et iskaldt mikrosentrifugerør på 1,5 ml.
      MERK: For å beregne mengden organoidkulturmedier, bestem antall brønner som skal belegges i en 96-brønnsplate, med tanke på at PUD er belagt i en 5 μL-kuppel i forholdet 1: 1 av organoidkulturmedier og BME. For eksempel, ved plating av en 96-brønnplate og bruk av bare de indre 60 brønnene, vil den totale mengden PUD-suspensjon som trengs, være 300 μL: 150 μL organoid kulturmedium og 150 μL BME. For modeller som viser optimal vekst ved forskjellige prosentandeler av BME, kan forholdet mellom BME: media endres i dette trinnet, selv om det er viktig å standardisere forholdet på tvers av alle analyser for hver spesifikke modell. For å ta høyde for pipetteringsfeil legger du til 10 % volum i hver komponent.
    2. Tell antall PUD-er.
      1. Overfør 2,5 μL av PUD-suspensjonen til et iskaldt 1,5 ml mikrosentrifugerør og bland med 2,5 μL BME. Overfør 5 μL-blandingen til et lysbilde med rent glassmikroskop. Ikke dekk til lysbildet. Blandingen vil størkne til en kuppel.
      2. Visualiser ved hjelp av et lysfeltmikroskop ved 4x. Telle antall PUDer i 5 μL-blandingen; Målet er å ha omtrent 25-50 PUD per 5 μL kuppel.
        MERK: Hvis ønsket tetthet ikke oppnås i testblandingen, justeres det endelige volumet av PUD-suspensjonen enten ved å tilsette flere organoidkulturmedier eller sentrifugere PUD-suspensjonen og resuspendere PUD-pelleten i et lavere volum iskaldt organoidkulturmedium. Uansett hvordan PUD-suspensjonen endres i dette trinnet, er det endelige forholdet mellom BME: PUD-suspensjon i trinn 1.5.3. skal være 1:1.
    3. Bruk en 200 μL pipettor med brede borespisser, bland PUD-suspensjonen forsiktig med like mye BME for å oppnå et 1:1-forhold mellom organoidkulturmedier og BME. Unngå bobler, noe som vil forstyrre kuplenes integritet.
    4. Ved hjelp av en 20 μL pipettor, frø 5 μL kupler inn i midten av hver brønn av en forvarmet 96-brønnplate, sådd bare de indre 60 brønnene. For å sikre lik fordeling av PUDene, pipett innholdet i 1,5 ml røret regelmessig med en 200 μL pipettor med brede borespisser.
    5. Etter at alle brønner er frøet, legg lokket på platen og snu forsiktig. Inkuber den omvendte platen ved 37 °C i 20 minutter i vevskulturinkubatoren slik at kuplene kan størkne.
      MERK: Invertering av platen sikrer at BME / organoid kultur media dome beholder 3D-strukturen for å gi tilstrekkelig plass til PUD-dannelse.
    6. Snu platen slik at den sitter med lokket opp og rug i 5 min ved 37 °C.

2. Behandlinger og tilsetning av fluorescerende fargestoffer for multipleksing

  1. Mens BME-kupler størkner i 96-brønnplatene, må du forberede fortynninger av fluorescerende levende celleavbildningsreagenser. Spesifikke parametere for multipleksing av Annexin V Red Dye og Cytotox Green Dye er gitt her.
  2. Fluorescerende reagenspreparat (dag -1): Beregn passende volum av organoidkulturmedier basert på antall brønner som skal behandles, forutsatt at hver brønn vil bli behandlet med 100 μL fargedosert media. Fortynn fargestoff i forvarmede organoidkulturmedier til ønsket konsentrasjon.
    MERK: Den totale mengden medier som trengs, varierer avhengig av eksperimentet. Legg til 10 % til det endelige volumet for å ta høyde for pipetteringsfeil. For eksempel, for å behandle de indre 60 brønnene i en 96-brønnplate, lag 6,6 ml fargedoserte medier (tabell 1).
  3. Behandle hver brønn med 100 μL 2x fargedosert organoid kulturmedium. Tilsett 200 μL steril 1x PBS til de ytre tomme brønnene på platen. Inkuber ved 37 °C over natten.
    MERK: PBS i perifere brønner reduserer fordampningen av media fra de indre brønnene.
  4. Tillegg av medikamenter/behandlingsmidler (dag 0): Tilberede legemidler i forvarmede organoidkulturmedier med 2x konsentrasjon i et volum på 100 μL per brønn.
    MERK: DMSO kan være giftig for celler ved høye konsentrasjoner. En konsentrasjon på 0,1 % DMSO overskrides ikke i forsøkene som ble utført i denne studien. I tillegg til legemidler distribueres noen fluorescerende reagenser som en DMSO-løsning. Det er viktig å ta hensyn til total DMSO-konsentrasjon ved arbeid med slike reagenser.
  5. Tilsett 100 μL 2x fargedoserte medier til hver brønn; Unngå å skape bobler.

3. Sette opp bildeparametere

  1. Plasser platen i cytasjon 5. Åpen Gen5-programvare. Klikk Ny oppgave > manuell bildemodus. Velg Capture Now og skriv inn følgende innstillinger: Mål (velg ønsket forstørrelse); Filter (velg mikroplate); Mikroplateformat (velg antall brønner); og fartøytype (velg platetype). Klikk Bruk lokk og Bruk lavere bærehastighet. Klikk OK.
    MERK: Beholdertype: Vær så spesifikk som mulig når du velger informasjon om platen fordi programvaren er kalibrert til den spesifikke avstanden fra målet til bunnen av platen for hver platetype og tykkelse på plasten.
    Langsommere bærehastighet: Velg denne boksen for å unngå å forstyrre kupler når du laster / losser plater.
  2. Lag en Z-Stack som vil avbilde hele BME-kuppelen.
    1. Velg en interessant brønn å vise (venstre panel, under histogram).
    2. Velg Lyst felt-kanalen (venstre panel øverst). Klikk på Vis automatisk og juster innstillingene etter behov.
    3. Angi bunnen og toppen av Z-Stack: Utvid kategorien Imaging Mode (venstre panel, midten). Merk av for Z-Stack . Bruk pilene for kursjustering (venstre panel, midten) til du kan klikke på nedjusteringen til alle PUD-ene har kommet inn og deretter ut av fokus og er uklare. Sett dette som bunnen av Z-Stack. Gjenta i motsatt retning ved å bruke pilene for kursjustering for å angi toppen av Z-stakken.
    4. For å sikre at Z-Stack-innstillingene passer for andre brønner av interesse, velg en annen brønn (venstre panel, under histogram) og visualiser toppen og bunnen av Z-Stack.
    5. Hvis du vil angi fokusposisjonene manuelt, klikker du på de tre prikkene ved siden av finjusteringen (venstre panel, øverst). Et vindu åpnes; skriv inn den øverste Z-Stack-verdien (funnet i venstre panel, midten, under Bildemodus). Gjenta for den nederste Z-Stack-verdien. Juster etter behov for å fange ønsket Z-område ved å gjenta trinn 3.2.3. Hvis justeringer var nødvendige, velger du en annen brønn for å kontrollere innstillingene.
  3. Angi eksponeringsinnstillingene for fluorescerende kanal(er). Innstillinger er beskrevet for to fluorescerende kanaler (GFP &; TRITC). Det spesifikke antallet fluorescerende kanaler vil avhenge av eksperimentet og hvilke fluorescerende kuber som er installert i det levende cellebildesystemet.
    MERK: Hvis signalintensiteten forventes å være betydelig høyere på slutten av eksperimentet, bør brukerne vurdere å utføre testeksperimenter for å bestemme de optimale eksponeringsinnstillingene på slutten av eksperimentet som deretter kan brukes når du konfigurerer de opprinnelige parametrene.
    1. Utvid kategorien Bildemodus (venstre panel, midten) og åpne Rediger bildetrinn. Et popup-vindu vises.
    2. Under Kanaler klikker du på boblen for ønsket antall kanaler. Angi en kanal for lyse felt og ekstra kanaler for hver fluorescerende kanal. I dette eksemplet er Kanal 1 = Lyst felt; Kanal 2 = GFP; Kanal 3 = TRITC. Bruk rullegardinmenyen Farge til å velge riktig innstilling for hver kanal. Lukk redigeringsvinduet ved å klikke OK.
    3. Sett opp hver fluorescerende kanal.
      1. Bytt kanal til GFP (venstre panel, øverst).
      2. Klikk på Automatisk eksponering (venstre panel øverst). Utvid kategorien Eksponering (venstre panel, midten) og juster eksponeringsinnstillingene for å minimere bakgrunnssignalet.
      3. Kopier eksponeringsinnstillinger til kategorien Bildemodus etter trinn 3.3.3.3–3.3.3.6.
      4. Klikk på Kopier-ikonet ved siden av boksen Rediger bildetrinn . Klikk på Rediger bildetrinn, som åpner et nytt vindu.
      5. Under GFP-kanalen klikker du på Utklippstavle-ikonet i Eksponering-linjen for å legge til innstillingene Belysning, Integreringstid og Kameraforsterkning for kanalen.
      6. Gjenta trinn 3.3.3.4–3.3.3.5 for TRIOC-kanalen. Klikk OK for å lukke vinduet.
  4. Konfigurer trinnene for forhåndsbehandling av bilder og Z-projeksjon for å automatisere bildeforbehandling.
    1. Klikk på Kamera-ikonet (venstre panel, nederst i hjørnet). Et nytt vindu åpnes.
    2. Under Add Processing Step (venstre panel, nederst), klikk på Image Preprocessing. Et nytt vindu åpnes.
    3. I kategorien Lyst felt fjerner du merket for Bruk bildeforbehandling.
    4. For hver kategorien Fluorescerende kanal må du kontrollere at Bruk bildeforbehandling er valgt. Fjern merket for Bruk samme alternativer som kanal 1 , og klikk på OK. Vinduet lukkes.
    5. Under Legg til behandlingstrinn klikker du på Z-projeksjon. Et nytt vindu åpnes. Hvis du vil, kan du justere stykkeområdet (f.eks. for å begrense Z-området). Lukk vinduet ved å velge OK.
  5. Opprett protokoll.
    1. Klikk Bildesett på verktøylinjen. I rullegardinmenyen klikker du på Opprett eksperiment fra dette bildesettet. Bildevinduet lukkes, og prosedyrevinduet åpnes.
      MERK: Parametrene som er valgt i manuell bildemodus , lastes automatisk inn i det nye vinduet, der en eksperimentell protokoll kan opprettes.
    2. Still inn temperatur og gradient: Klikk på Still inn temperatur under overskriften Handlinger (venstre). Et nytt vindu åpnes. Velg Inkubator på og skriv inn ønsket temperatur manuelt under Temperatur. Deretter skriver du inn 1 manuelt under Gradering. Lukk vinduet ved å velge OK.
      MERK: Hvis du lager en gradient på 1 °C, forhindrer du at det dannes kondens på lokket på platen.
    3. Angi brønner til bildet.
      1. Dobbeltklikk på bildetrinnet under Beskrivelse. Klikk Full plate (høyre hjørne, øverst). Dette åpner vinduet Plateoppsett .
      2. Fremhev brønner av interesse ved hjelp av markøren. Klikk OK. Hvis du vil, kan du merke av for boksene Autofokus Binning og Capture Binning . Klikk OK for å lukke vinduet.
        MERK: Binning krever eksponeringsjustering, som beskrevet i trinn 3.3.3.2 ovenfor. Se diskusjonsdelen for spesifikke scenarier der denne funksjonen kan brukes.
    4. Angi intervaller for kinetisk avbildning.
      1. Klikk på Alternativer under overskriften Annet (venstre). Merk av for Discontinuous Kinetic Procedure .
      2. Under Beregnet totaltid angir du kjøretiden for eksperimentet (f.eks. 5 dager). Under Estimert intervall angir du intervallet for å avbilde platen (f.eks. hver 6. time).
      3. Klikk Pause etter hver kjøring for å gi tid til platen som skal overføres til inkubatoren. Lukk vinduet ved å velge OK.
    5. Oppdater trinn for datareduksjon.
      1. Klikk OK for å lukke prosedyrevinduet. En fane åpnes for å oppdatere datareduksjonstrinn. Velg Ja. Dobbeltklikk på Forhåndsbehandling av bilder. Klikk gjennom de forskjellige kanalene for å bekrefte innstillingene, og klikk OK.
      2. Dobbeltklikk på Z-projeksjon. Klikk gjennom de forskjellige kanalene for å bekrefte innstillingene. Klikk OK. Klikk deretter OK igjen for å lukke datareduksjonsvinduet.
    6. Formater plateoppsettet.
      1. Åpne veiviseren for plateoppsett og angi brønntyper etter trinn 3.6.2-3.6.3.
      2. Klikk på Plate Layout-ikonet i verktøylinjen (venstre hjørne, øverst) for å åpne Plate Layout Wizard.
      3. Merk av i boksene ved siden av brønntypene som ble brukt i eksperimentet. Under Analysekontroller angir du antall forskjellige kontrolltyper ved hjelp av pilene. Klikk Neste for å åpne vinduet Assay Control #1 .
      4. Angi brønnbetingelser for analysekontroll etter trinn 3.6.5-3.6.8.
      5. I vinduet Assay Control #1 skriver du inn kontrolletiketten i boksen ID for plateoppsett . Hvis ønskelig, skriv inn hele navnet i den tilstøtende boksen. Velg antall replikater for den respektive kontrollbetingelsen ved hjelp av pilene.
      6. Hvis du bruker flere konsentrasjoner eller en fortynningsserie i kontrollen, klikker du på Definer fortynninger/konsentrasjoner og bruker rullegardinmenyen til å velge Type. Angi verdier for hver konsentrasjon/fortynning i tabellen.
        MERK: Auto-funksjonen kan brukes hvis konsentrasjonene endres med en konsekvent økning.
      7. Velg kategorien Farge på verktøylinjen. Velg ønsket tekstfarge og bakgrunnsfarge for kontroll i rullegardinmenyen. Klikk på Neste.
      8. Gjenta etter behov med flere kontroller.
      9. Angi prøvebrønnbetingelser etter 3.6.10-3.6.12.
      10. På siden Eksempeloppsett angir du eksempel-ID-prefikset (f.eks. SPL). Velg antall replikater ved hjelp av pilene. Hvis du bruker prøver med varierende behandlingskonsentrasjoner, velger du Konsentrasjoner eller Fortynninger i rullegardinmenyen Type . Angi fortynninger/konsentrasjoner i tabellen, og angi enheter i Enhet-boksen .
      11. Velg Identifikasjonsfelt på verktøylinjen. Skriv inn ønsket kategorinavn (f.eks. prøve-ID, legemiddel) i tabellen.
      12. Velg kategorien Farge på verktøylinjen. Velg en annen farge for hver behandlingsgruppe/prøve. Klikk på Fullfør. Dette åpner siden Plateoppsett.
        MERK: Tallene på venstre side korrelerer med de forskjellige utvalgsnumrene.
      13. Tilordne eksempel-IDer ved å følge trinn 3.6.14–3.6.16.
      14. Velge SPL1 fra venstre panel. Bruk markøren til å velge brønner.
        MERK: Autovalgverktøy kan justeres i serietilordningsboksen. Antall replikater og retninger for oppsettet kan være forhåndsutpekt.
      15. Gjenta med andre prøver for å fullføre plateoppsettet. Når du er fornøyd, klikker du OK.
      16. På filverktøylinjen velger du Eksempel-IDer. Fyll ut kolonner for prøve-ID med riktig informasjon for hver prøve (f.eks. legemiddeltype). Trykk på OK.
    7. Lagre protokollen.
      1. På verktøylinjen klikker du Fil > Lagre protokoll som. Velg plasseringen der du vil lagre filen. Skriv inn et filnavn. Klikk Lagre for å lukke vinduet.
      2. Klikk Fil > Avslutt på verktøylinjen. En fane åpnes for å lagre endringer i Imager Manual Mode. Velg Nei.
      3. En fane åpnes for å lagre endringer i eksperiment 1. Velg Nei. En fane åpnes for å oppdatere protokolldefinisjonen. Velg Oppdater. Lukk programvaren.
  6. Importer protokollen til BioSpa OnDemand og fullfør konfigurasjonen av eksperimentet.
    1. Åpne BioSpa OnDemand-programvaren (planleggingsprogramvare).
    2. Velg et ledig spor i programvaren.
    3. Fjern platen fra bildesystemet for levende celler. Klikk Åpne skuff for å få tilgang til riktig spor i planleggingsprogramvaren og sett inn platen. Klikk på Lukk skuff.
      MERK: Dette trinnet kan utføres når som helst når protokollen er opprettet i trinn 3.5.7 ovenfor. Platen må imidlertid være i Cytation 5 for å utføre en tidskjøring i trinn 3.6.4.3 nedenfor.
    4. Importer protokollen.
      1. Under kategorien Prosedyreinformasjon velger du Bruker i rullegardinmenyen. Ved siden av protokollsporet klikker du Velg > Legg til en ny oppføring.
      2. Ved siden av protokollsporet klikker du Velg. Dette åpner et nytt vindu for å navigere til ønsket protokoll i filarkitekturen. Klikk Åpne for å importere protokollen til planleggingsprogramvaren.
      3. Angi hvor lang tid det tar å avbilde platen. Klikk OK for å lukke vinduet Gen5-protokollliste .
        MERK: Dette trinnet er spesielt viktig når du kjører flere eksperimenter om gangen. Hvis du vil finne tiden det tar å avbilde, klikker du Utfør en tidsberegningskjøring nå. Klikk OK.
    5. Angi bildeintervaller og planlegg eksperimentet.
      1. Under Intervall angir du bildeintervallet som er angitt i trinn 3.5.4.
      2. Under Alternativer for starttidspunkt velger du Når tilgjengelig. Under Varighet velger du Fast eller Kontinuerlig.
        MERK: En bestemt starttid kan angis i stedet for å kjøre protokollen på neste tilgjengelige tidspunkt. Hvis du velger Fast varighet , angis et bestemt endepunkt for eksperimentet og brukeren må angi en eksperimentell tidsramme. Kontinuerlig varighet gjør at eksperimentet kan kjøres uten noe endepunkt, og kan bare avsluttes av en bruker som stopper eksperimentet.
      3. Klikk på Planlegg plate/fartøy. Dette åpner platevalideringssekvensen. En fane åpnes med den foreslåtte første lesetiden. Klikk Ja for å godta denne tidsplanen.

4. Bildeanalyse i Gen5-programvare (figur 2)

  1. Åpne Image Analysis-modulen.
    1. Åpne Gen5. I Oppgavebehandling velger du Eksperimenter > Åpne. Velg eksperimentet for å åpne filen. Klikk Plate > View på verktøylinjen.
    2. Endre Data-rullegardinmenyen til Z-projeksjon. Dobbeltklikk på en brønn av interesse. Velg Analyser > jeg vil konfigurere et nytt trinn for reduksjon av bildeanalysedata. Klikk OK.
  2. Cellulær analyse
    1. Primær maske
      1. Under Analyseinnstillinger velger du Type: Cellular Analysis and Detection Channel: ZProj[Tsf[Bright Field]] (venstre panel, midten).
      2. Klikk Alternativer. Dette åpner siden Primærmaske og antall. Merk av for Auto i Terskel-boksen, og klikk Bruk. Klikk boksen Merk objekter (nederste panel) for å vise objekter innenfor den angitte terskelen. Juster etter behov for å inkludere objekter av interesse.
        MERK: Terskelinnstillingene er basert på pikselintensitet. Hvis for eksempel terskelen er satt til 5000, vil piksler med en intensitet større enn 5000 bli inkludert i analysen.
      3. Under Objektvalg angir du minimum og maksimum objektstørrelse (μm). Juster etter behov for å utelukke cellulært rusk / enkeltceller.
        MERK: PUD-størrelsen kan variere betydelig mellom ulike modeller og typer. Bruk måleverktøyet i Gen5-programvaren til å bestemme minimums- og maksimumsterskler for PUD-størrelse for hver modell. Brukerne kan velge en mindre terskel for minste PUD-størrelse i forhold til måleverktøyets verdi for å unngå at PUD-fragmenter utelukkes på senere tidspunkt etter legemiddelbehandlingen.
      4. Hvis du vil begrense analysen til et bestemt område av brønnen, fjerner du merket for Analyser hele bildet og klikker Plugg. I vinduet Image Plug bruker du rullegardinmenyen til å velge Pluggform . Juster størrelses- og posisjonsparameterne etter behov for å passe til interesseområdet.
        MERK: Det er viktig å maksimere antall PUD-er i pluggen og samtidig ekskludere PUD-frie områder for å minimere bakgrunnen. Angi en pluggstørrelse som konsekvent vil fange opp de fleste objektene av interesse på tvers av replikater. Det er viktig å generere en plugg som også utelukker kantene på kuppelen, da den utelukker gjenstander som kan virke forvrengt på grunn av lysbrytning fra den ekstreme krumningen av kuppelen rundt kantene. Inkluder primære kantobjekter kan også fjernes for å fange bare hele PUDer i pluggen.
    2. Subpopulation analyse. Et eksempel på subpopulasjonsbetegnelse er gitt i figur 3.
      1. Klikk på Beregnede beregninger på verktøylinjen for mobilanalyse. Klikk på Velg eller opprett interessemålinger på objektnivå (nederste høyre hjørne). Under Tilgjengelige objektberegninger velger du målinger av interesse (f.eks. sirkularitet) og klikker på Sett inn-knappen. Klikk OK.
        MERK: Morfologien og tettheten til hver PUD-modell vil bestemme de beste beregningene av interesse for å skille delpopulasjonen.
      2. Klikk på Subpopulation Analysis i verktøylinjen Cellular Analysis . Klikk Legg til for å opprette en ny underpopulasjon. Et popup-vindu åpnes.
      3. Hvis du vil, kan du angi et navn for delpopulasjonen. Velg en interesseberegning under Objektmålinger, og trykk på Legg til betingelse. I vinduet Rediger betingelse angir du parametere for den valgte objektberegningen. Gjenta med flere beregninger etter behov.
        MERK: Parametrene kan justeres manuelt eller stilles inn ved hjelp av finder-verktøyet. Hvis brukerne for eksempel vil ekskludere rusk, kan de legge til Område som objektberegning og velge objekter som er mindre enn 800. Sirkularitet som objektmetrikk brukes rutinemessig, og alle objekter med en sirkularitet større enn 0,2-0,5 inkluderes, avhengig av modellen.
      4. I tabellen nederst i vinduet, sjekk de ønskede resultatene som skal vises. Klikk OK > Bruk.
      5. Hvis du vil vise objektene i delpopulasjonen, bruker du rullegardinmenyen Objektdetaljer (midtstilt panel) til å velge delpopulasjonen. Objekter som faller innenfor parametrene vil bli uthevet i bildet.
        MERK: Hvis du vil endre uthevingsfargene for primærmasken og underpopulasjonen, klikker du Innstillinger (nederste panel).
      6. Hvis du vil justere parametere for delpopulasjoner, åpner du vinduet Subpopulasjonsanalyse på nytt fra verktøylinjen Cellulær analyse . Merk delpopulasjonen, og klikk Rediger. Klikk Legg til trinn.
        MERK: Dette vil bruke den samme analysen på alle brønner i forsøket til enhver tid. I rullegardinmenyen på Matrix-siden kan forskjellige beregninger velges for individuell visning.

5. Eksporter data fra Gen5 til Excel

  1. Hvis du vil tilpasse en datafil for eksport, velger du ikonet Rapport-/eksportverktøy på verktøylinjen. I popup-vinduet klikker du Ny eksport til Excel.
  2. På Egenskaper-siden i popup-vinduet velger du Omfang > plate og innhold > Egendefinert. Klikk på Innhold-alternativet i verktøylinjen. Klikk Rediger mal, som åpner Excel-programmet.
  3. I regnearket velger du Tillegg > tabell > brønndata. Hold pekeren over de ulike valgene for å se alternativer for eksport. Velg måling av interesse (f.eks. Objektmiddel[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
    MERK: Plateoppsett kan legges til regnearkanalysemalen ved å velge Tillegg > Protokollsammendrag > Layout.
  4. Et redigeringsvindu åpnes. I Wells-boksen angir du brønnene for eksport enten med Well-ID eller Well #. Velg OK. En mal lastes inn i regnearkfilen. Lukk regneark. Malen lagres automatisk.
  5. Klikk OK i vinduet Ny eksport til Excel, og lukk vinduet Rapport-/eksportbyggere .
  6. Klikk på Eksporter-ikonet på Gen5-verktøylinjen. Merk av i boksen ved siden av ønsket eksportfil. Klikk OK. Gen5 vil automatisk fylle regnearkmalen og åpne filen i Excel.

6. Ekstern dataanalyse

  1. Åpne Eksporter-filen (.xlsx) i Excel.
  2. For hver brønn deler du hver enkelt verdi med 0:00 tidspunktverdien for den brønnen. Dette vil sette tidspunkt 0 lik 1, og hver verdi utover det vil være i forhold til den første avlesningen.
  3. Åpne en ny fil i dataanalyseprogramvaren. Velg XY-layoutalternativet .
    MERK: I denne protokollen ble GraphPad Prism (versjon 9.5.1) brukt.
  4. Inndataetiketter for hver datagruppe. Kopier og lim inn tidspunktene og tilsvarende normaliserte verdier for hver behandlingsgruppe i Prism-tabellen. En graf for dataene genereres automatisk og finner du under Grafer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vårt mål var å demonstrere muligheten for å bruke multiplekset levende celleavbildning for å vurdere PUD-terapeutisk respons. Proof of concept-eksperimenter ble utført i to separate PUD-modeller av livmorkreft: ONC-10817 og ONC-10811 (se tilleggsfigur 1 og tilleggsfigur 2 for ONC-10811-data). Apoptose (farging av anneksin V) og cytotoksisitet (Cytotox Green uptake) ble kinetisk overvåket som respons på det apoptoseinduserende middelet, staurosporin. Spesielt ble PUD belagt i 96-brønnsplater, behandlet med Annexin V Red og Cytotox Green fargestoffer, og plassert i en 37 ° C inkubator over natten som diagrammet i figur 1. Vi bekreftet i to uavhengige PUD-modeller at behandling med Annexin V og Cytotox Green fargestoffer ikke er toksisk (tilleggsfigur 2). Dagen etter ble PUD behandlet med økende konsentrasjon av staurosporin (0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 500 nM). Deretter ble protokoller etablert i Gen5-programvaren og eksperimenter ble satt til å løpe over en periode på 5 dager, avbildning hver 6. Data ble analysert ved hjelp av Cellular Analysis-funksjonen i Gen5-programvaren som beskrevet i avsnitt 4 i protokollen. Primærmasken ble satt ved hjelp av Auto-terskelfunksjonen med "Split touching objects" ukontrollert og med størrelsesparametere på minimum: 30 μm og maksimum: 1000 μm. PUD-subpopulasjonen ble definert ved sirkularitet > 0,25. Objektets gjennomsnittlige intensiteter i TRITC (vedlegg V, apoptose) og GFP-kanalene (Cytotox Green, cytotoksisitet) innenfor den utpekte PUD-subpopulasjonen ble eksportert som en .xlsx-fil for videre analyse. Objektets gjennomsnittlige intensitet for hver brønn på hvert tidspunkt i både GFP- og TRITC-kanalene ble normalisert til tid 0. Normaliserte fluorescensdata ble deretter overført til en Prism-fil og visualisert som et linjeplott.

Behandling med staurosporin resulterte i en signifikant, doseavhengig økning i apoptose og en reduksjon i cellehelse over tid sammenlignet med vehikkelkontroll, noe som gjenspeiles ved økningen i objektets gjennomsnittlige intensitet i både TRITC (vedlegg V) og GFP (cytotox) kanalene (figur 4, figur 5, tilleggsvideo 1, supplerende video 2, tilleggsvideo 3, Supplerende video 4, supplerende video 5, tilleggsvideo 6 og tilleggsvideo 7). Dosene på 500 nM, 100 nM og 10 nM staurosporin resulterte i en statistisk signifikant økning i både apoptose og cytotoksisitet over tid (figur 5A-C) samt på slutten av forsøket (figur 5E,F). Videre hemmet staurosporin effektivt PUD-vekst og -dannelse ved disse konsentrasjonene, som vist ved en samlet nedgang i totalt PUD-areal, mens kontrollbrønnene viste en økning i totalt PUD-areal (figur 4 og figur 5D).

Siden en stor fordel med levende celleavbildning er evnen til å korrigere for variasjon i plettering, utførte vi et eksperiment der cellenes levedyktighet ble vurdert som et endepunktsmål. Proof-of-concept endepunktanalysedata ble samlet inn ved hjelp av en PUD-modell som ble generert fra en pasientderivert xenograft av prostatakreft. Lyse feltbilder ble tatt i begynnelsen av behandlingsperioden (dag 0), etterfulgt av tilsetning av et dobbeltfargestoffreagens som måler både levedyktighet (akridinappelsin, AO) og celledød (propidiumjodid, PI). AO-komponenten avgir et grønt fluorescerende signal ved binding til dobbeltstrenget DNA, en indikator på cellenes levedyktighet. PI-komponenten flekker døde kjerneceller og kan brukes til å kvantifisere celledød som respons på behandling. For å ta høyde for variasjon i PUD-plating utviklet vi en metode for å bestemme antall PUD per brønn ved tidspunkt 0 ved konvertering av lysfeltbilder til bilder av digital fasekontrast (tilleggsfigur 3 og tilleggsfil 1).

PUD for prostatakreft ble behandlet med daunorubicin, et cellegiftmiddel som forårsaker celledød, i 7 dager. Etter at forsøket var fullført, ble prøvene farget med AOPI som beskrevet i tilleggsfil 1, etterfulgt av analyse av fluorescerende bilder i Gen5. Figur 6A viser et panel med bilder fra AOPI-endepunktanalysen på dag 7. Ved sammenligning av kjøretøybehandlede PUD-er (rad én) med PUD behandlet med 10 μM daunorubicin (rad to), var det en klar nedgang i grønn fluorescens (mål på levedyktighet, kolonne to) og en økning i rød fluorescens (mål på celledød, kolonne tre). Disse resultatene ble deretter kvantifisert i figur 6B, hvor vi viser rekken av avlesninger som kan oppnås ved hjelp av AOPI-endepunktfargeteknikken. Plottet øverst til venstre viser levedyktighetsmålingen generert fra AO-flekken, normalisert til PUD-tellingen bestemt av Digital fasekontrast-bildeanalyse av hver brønn på dag 0. Disse dataene korrelerer med det visuelle resultatet fra figur 6A, hvorved levedyktigheten ble redusert drastisk etter hvert som konsentrasjonen av daunorubicin økte. Dette er ytterligere rekapitulert i øvre høyre graf, som viser en økning i celledød betegnet med en økning i rød fluorescens oppnådd med PI-flekken.

PI-dataene ble deretter kombinert med levedyktighetsavlesningen (AO) for å beregne et levedyktig til dødt forhold (figur 6B, nedre venstre graf). Dette forholdet er en nyttig tilnærming for å avgjøre om et legemiddel er cytostatisk eller cytotoksisk. Spesielt vil et cytotoksisk stoff nå mye nærmere 0 enn et cytostatisk legemiddel på grunn av det faktum at et stoff som er cytostatisk vil hemme vekst, men kan ikke indusere celledød. Til slutt kan arealet av PUDene beregnes nøyaktig ved hjelp av den grønne fluorescensen av AO-flekken, selv når PUDer kan gjennomgå celledød og blebbing. Grafen nederst til høyre viser gjennomsnittlig PUD-areal, som ble beregnet som summen av arealet angitt i delpopulasjonsanalysen dividert med PUD-nummer. Analyser av området kan gi ytterligere indikasjoner på om en behandling bare hemmer PUD-vekst eller faktisk forårsaker PUD-regresjon. Merk at analysen av gjennomsnittlig PUD-område ble utført ved hjelp av GFP-kanalen og cellulær analysefunksjon, i motsetning til figur 5D, som brukte de lyse feltbildene til å beregne totalt PUD-areal. Disse dataene fremhever fleksibiliteten til analysepipelinen avhengig av datatilgjengelighet og brukerinteresse.

Til slutt sammenlignet vi gullstandarden for levedyktighetsavlesninger, CellTiter-Glo 3D, med levedyktighetsfluorescensavlesningen ved bruk av AOPI (figur 6C). Vær oppmerksom på at dataene i dette panelet ikke ble normalisert til PUD-tidspunktet 0, siden denne normaliseringen vanligvis ikke utføres av laboratorier som bruker CellTiter-Glo 3D-settet. Vi observerte den samme trenden for medikamenteffekt i begge analysene, hvorved PUD-levedyktigheten ble redusert etter hvert som daunorubicinkonsentrasjonen økte. Den eneste visuelle forskjellen mellom disse avlesningene var at CellTiter-Glo 3D-analysen nådde en IC50 før AOPI-analysen og nesten helt nådde 0. Dette resultatet kan forklares av virkningsmekanismen til daunorubicin. Daunorubicin er en topoisomerase-II-hemmer som introduserer dobbeltstrengede DNA-brudd, noe som fører til cellesyklusstans og til slutt apoptose14. Under cellesyklusstans kan ATP-uttømming forekomme15. Gitt at CellTiter-Glo 3D-analysen er basert på en ATP-luciferase-reaksjon for å generere et luminescenssignal, antar vi at den sterkere reduksjonen i cellelevedyktighet ved høyere konsentrasjoner av daunorubicin skyldtes ATP-uttømming i stedet for fullstendig celledød. Til støtte for denne ideen viser bildene i figur 6A en befolkning som lever PUD i kulturen, som betegnet med grønn fluorescens.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over plettering, avbildning og analyseprotokoll. PUD er belagt i en 96-brønnsplate og behandlet med fluorescerende fargestoffer og legemidler. Imaging parametere for eksperimentet (f.eks Exposure, Z-stack) er opprettet i Gen5 programvare. Bilder er anskaffet av Cytation 5 og behandlet i Gen5, og data eksporteres for videre analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Oversikt over funksjonen for mobilanalyse. 1: Angi plugg: En plugg er utpekt til å inkludere interesseområder. 2: Angi primærmaske: Hovedmasken definerer objekter av interesse basert på størrelse og pikselintensitet i en valgt kanal. I dette representative bildet er objekter som er inkludert i primærmasken, skissert i lilla. 3: Definer underpopulasjon: En ekstra underpopulasjon kan defineres for å avgrense den ønskede populasjonen ytterligere for analyse. Delpopulasjonen i eksempelbildet (markert med gult) er definert basert på sirkularitet (>0,25) og areal (>800). Bilder ble anskaffet med et 4x mål. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Eksempler på maskering av subpopulasjoner ved hjelp av funksjonen Cellular Analysis. Delpopulasjoner er definert i den lyse feltkanalen. Delpopulasjonen i eksempelbildene (markert med gult) er definert basert på sirkularitet (>0,25) og areal (>800). Bilder ble anskaffet med et 4X mål. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4 Behandling med staurosporin gir doseavhengig økning i apoptose og cytotoksisitet. Lyse feltbilder (4x objektiv) med GFP- og TRITC-fluorescensoverlegg vises for 500 nM, 10 nM og 0,1 nM doser staurosporin ved 3 tidspunkter: 0 timer, 54 timer, 114 timer. Det røde fluorescerende signalet indikerer apoptose (vedlegg V), og det grønne fluorescerende signalet indikerer cytotoksisitet (Cytotox). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Multiplekset fluorescerende levende celleavbildning for å vurdere PUD-respons. PUD-modell ONC-10817 ble belagt i 96-brønnsplater og inkubert med Annexin V Red (1:400), og Cytotox Green (200 nM) fargestoffer over natten ved 37 °C. Dagen etter ble PUD behandlet med økende konsentrasjon av staurosporin og ble avbildet hver 6. time i ~5 dager. (A,B) Tids- og doseavhengig økning i (A) cytotoksisitet eller (B) apoptose som respons på staurosporin. Data ble plottet som objektets gjennomsnittlige intensitet i GFP- eller TRITC-kanalen. (C) Sammenligning av tidsforløpet for apoptose og cytotoksisitet som respons på 100 nM eller 500 nM staurosporin. Data ble plottet som objektets gjennomsnittlige intensitetsverdier i GFP- og TRITC-kanalene. (D) Staurosporin hemmer vekst av PUD. Data ble plottet som gjennomsnittlig totalt PUD-areal. Data i A-D ble normalisert til PUD-nummer på tidspunkt 0 t i hver brønn og plottet som gjennomsnitt og standardfeil av gjennomsnittet (SEM). N=5 tekniske replikater per behandling. p < 0,0001 vs. kjøretøykontroll med 2-veis ANOVA. (E) Representative lysfelt-, GFP- og TRITC-bilder av 500 nM staurosporinbehandlede PUD-er vs. kjøretøy ved slutten av forsøket (114 timer). Bilder ble anskaffet med et 4x mål. (F) Kvantifisering av cytotoksisitet, apoptose og levedyktighet ved 114 timers tidspunkt. GFP Object Mean Intensity (venstre) og TRITC Object Mean Intensity (midten) ble beregnet ved 114 timers tid ved hjelp av resultater fra panelene A-C. Levedyktigheten (til høyre) ble vurdert ved hjelp av CellTiter-Glo 3D-reagenset i henhold til produsentens protokoll. Råluminescensverdier (RLU) ble normalisert til totalt PUD-areal på tidspunkt 0 timer og plottet som foldelevedyktighet i forhold til kjøretøykontroll, som ble satt til 1,0. ** p<0.01, ***p<0.001, **** p<0.0001 vs. kjøretøykontroll via enveis ANOVA med Dunnetts post-hoc-test. N = 5 tekniske replikater per behandling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Bruk av levende celleavbildning for å hjelpe til med normalisering av endepunktanalysedata. PUD ble behandlet med økende konsentrasjoner av topoisomerase-II-hemmeren daunorubicin i 7 dager. PUD ble eksponert for AOPI fargeløsning og avbildet som beskrevet i tilleggsfil 1. AO = akridin oransje, et mål på levedyktighet (GFP-kanal); PI = propidiumjodid, et mål på celledød (Texas Red channel). (A) Representative bilder tatt ved bruk av AOPI-farging etter 7 dagers behandling med 10 μM daunorubicin eller vehikkelkontroll (0,1 % DMSO). (B) Ulike avlesninger ved bruk av AOPI-fluorescens som et endepunkt levedyktighet / celledødsmetode. Se tilleggsfil 1 for en detaljert beskrivelse av analysemetodene. Øverst til venstre, analyse av PUD-levedyktighet etter 7 dager som bestemt ved AO-farging. Øverst til høyre, analyse av celledød ved PI-farging. Data for AO- og PI-farging ble normalisert til PUD-nummer på tidspunkt 0 t og deretter til kjøretøykontroll, som ble satt til 1,0, og plottet som gjennomsnitt og standardavvik. Nederst til venstre, beregning av levedyktig til dødt forhold ved hjelp av gjennomsnittlige objektintegraler for AO- og PI-flekkene. Nederst til høyre, areal av PUD som bestemt av AO-farging. Cellulær analyse ble utført i GFP-kanalen. (C) Sammenligning av to metoder for å teste PUD-levedyktighet. Etter avbildning ble levedyktigheten evaluert ved hjelp av CellTiter-Glo 3D-reagenset i henhold til produsentens protokoll. Foldeoverlevelsen i forhold til vehikkelkontrollen ble plottet ved økende konsentrasjoner av daunorubicin. Data representerer gjennomsnitt og standardavvik for N = 6 tekniske replikater per behandling; data ble ikke normalisert til tid 0 t i panel C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Behandling # av brønner Medievolum Vedlegg 100 μM Cytotox
Fortynning Volum Fortynning Volum
Multipleks 60 6,6 ml 1:400 16,5 μL 200 nM 13,2 μL

Tabell 1: Eksempel på multipleksingseksperiment. Vedlegg V Rød binder eksponert fosfatidylserin på den ytre brosjyren av apoptotiske cellemembraner. Cytotox Green integreres i celler med kompromittert membranintegritet og binder DNA.

Tilleggsfigur 1: Multiplekset levende celleavbildning av ONC-10811. PUD ble belagt med 96-brønnsplater og inkubert i fargestoffer i vedlegg V Red (1:400) og Cytotox Green (200 nM) over natten ved 37 °C. Dagen etter ble PUD behandlet med økende konsentrasjon av staurosporin og ble avbildet hver 6. time i 5 dager. (A) Tids- og doseavhengig økning i cytotoksisitet som respons på staurosporin. Data ble plottet som objektets middelintensitet i GFP-kanalen. (B) Dose-respons av staurosporin ved 114 timer. Data ble plottet som objektets gjennomsnittlige intensitetsverdier i GFP-kanalen ved 114 timers tidspunkt. (C) Tids- og doseavhengig økning i apoptose som respons på staurosporin. Data ble plottet som objektets gjennomsnittlige intensitet i TRITC-kanalen. (D) Dose-respons av staurosporin ved 114 timer. Data ble plottet som objektets gjennomsnittlige intensitetsverdier i TRITC-kanalen ved 114 timers tidspunkt. Data i A og C ble normalisert til PUD-nummer på tidspunkt 0 t på brønnnivå. N = 5 tekniske replikater per behandling i hver modell. p < 0,0001 vs. kjøretøykontroll med 2-veis ANOVA. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Behandling med vedlegg V og cytotox forstyrrer ikke PUD-levedyktigheten. PUD ble belagt med 96-brønnsplater og inkubert med fargestoffer Annexin V Red (1:400) og Cytotox Green (200 nM) over natten ved 37 °C. Etter 24-timers inkubasjon ble levedyktigheten vurdert ved hjelp av CellTiter-Glo 3D-analysen i henhold til produsentens protokoll. (A) Levedyktighet i fargebehandlet og ubehandlet PUD ved 24 timers tidspunkt. Både relative light unit (RLU)-verdier og verdier normalisert til PUD-sumområde presenteres. Spesielt ble CellTiter-Glo3D RLU for hver brønn normalisert til summeringen av PUD-området for den brønnen på tidspunktet for plating (dvs. umiddelbart etter fargetilsetning). Det totale PUD-området ble bestemt ved hjelp av beregningen "Object Sum Area" i Cellular Analysis. N = 10. (B) levedyktighet i fargebehandlet og ubehandlet PUD ved 114 timers tidspunkt. Både rå luminescensverdier og verdier normalisert til totalt PUD-område presenteres. CellTiter-Glo3D RLU for hver brønn ble normalisert til summeringen av PUD-området ved 24 timer etter plating, noe som tilsvarer tid 0 t i kinetiske bildeeksperimenter. N = 5. Signifikans hos A og B ble vurdert med uparet t-test; P-verdier er oppført på grafene. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 3: Etikettfri analyse av PUD med digital fasekontrast. Denne figuren inneholder representative bilder (2,5x objektiv) som viser etikettfri analyse som beskrevet i tilleggsfil 1: Sette opp avbildningsparametere for en enkelt fokalplan for visningsanalyse (Bright Field / Digital Phase Contrast Images) og Digital Phase Contrast Image-analyse i Gen5-programvare. (A) Eksempel på lysfeltbilde av en prostatakreft PDXO-modell på et enkelt fokalplan. (B) Det lyse feltbildet i A ble konvertert til et digitalt fasekontrastbilde. Mørke objekter i det lyse feltbildet ser lyse ut i det digitale fasekontrastbildet og omvendt. (C) Eksempel på PUD-maskering ved bruk av kontrastbildet Digital fase. Legg merke til at kantene på objekter av interesse blir mye mer definert i forhold til de lyse feltbildene. I dette representative bildet er objekter i primærmasken markert med gult. Delpopulasjonen i (C) (skissert i rosa) er definert basert på sirkularitet (>0.3), areal (>1000), Mean[Dig.Ph.Con] > 2000, StdDev[Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500, og Peak[Dig.Ph.Con] > 12500. Parametrene som ble brukt i denne representative figuren ble brukt på data i figur 6 for å normalisere til celletall på dag 0. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 4: PUD-modellene kan variere i morfologi og pletteringskonsistens. Øvre panel: Eksempler på differensiell spredning av PUD i BME-kuplene. Nedre panel: Representative bilder av diskohesive vs. sirkulære PUD-er. Alle bildene ble tatt med EVOS-mikroskop. Forstørrelser er notert. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 5: Eksempelbilder ved hjelp av cellulær analyse vs. bildestatistikk for kvantifisering av fluorescens. Ved hjelp av cellulær analyse kan brukere definere bestemte populasjoner i et bilde og måle fluorescens i disse regionene. Bildestatistikk kan også brukes til å måle fluorescens i et bilde ved å definere en terskel for å ekskludere bakgrunnssignaler. Se diskusjonen for begrensningene ved bruk av bildestatistikk. Bildene har 4x forstørrelse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 1: Organoide kulturmediekomponenter. Merk at reagenser er optimalisert for dyrking av PUD for gynekologisk kreft. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo 1: Time-lapse-video av 500 nM staurosporinbehandling med bilder tatt hver 6. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo 2: Time-lapse-video av 100 nM staurosporinbehandling med bilder tatt hver 6. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo 3: Time-lapse-video av 10 nM staurosporinbehandling med bilder tatt hver 6. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo 4: Time-lapse-video av 1 nM staurosporinbehandling med bilder tatt hver 6. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo 5: Time-lapse-video av 0,1 nM staurosporinbehandling med bilder tatt hver 6. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo 6: Time-lapse-video av 0,01 nM staurosporinbehandling med bilder tatt hver 6. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo 7: Time-lapse-video av kjøretøy (0,06 % DMSO) med bilder tatt hver 6. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1: Tilleggsprotokoller. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PUD-kulturer blir stadig mer populære in vitro modellsystem på grunn av deres evne til å reflektere cellulære responser og atferd2. Betydelige fremskritt har blitt gjort i PUD-generering, kultur og ekspansjonsteknikker, men metoder for å analysere terapeutiske responser har ligget. Kommersielt tilgjengelige 3D-levedyktighetssett er lytiske endepunktanalyser, som går glipp av potensielt verdifulle kinetiske responsdata og begrenser påfølgende analyser med andre metoder8. Nye studier bruker levende celleavbildning for å vurdere legemiddelrespons i PUD-modeller. Her presenterer vi en metode for å vurdere PUD-terapeutiske responser over tid ved bruk av multiplekset fluorescerende levende celleavbildning. Multiplexing fluorescerende fargestoffer gjør det mulig å kvantifisere forskjellige cellulære responser samtidig. I tillegg til apoptose og cytotoksisitet ser vi for oss at denne tilnærmingen kan utvides i fremtidige studier for å undersøke andre fenotypiske effekter i PUD.

Protokollen som presenteres her er designet for å skaffe kinetiske lysfelt og fluorescerende bilder av PUDer belagt som kupler i en 96-brønnsplate. Viktige trinn inkluderer 1) plating, 2) behandling med fargestoff og medikament, 3) definering av bildeparametere, 4) forbehandling og analyse av bilder ved fullføring av kinetisk bildeinnsamling, og 5) dataeksport for analyse i annen statistisk programvare (figur 1). Intakte PUD-er er belagt i en 96-brønns plate som 5 μL BME-kupler sammensatt av et forhåndsdefinert forhold mellom BME og organoid kulturmedier (typisk 1: 1). Protokollen som presenteres her bruker UltiMatrix som BME på grunn av minimal batch-til-batch-variabilitet og overlegne optiske egenskaper for avbildning. Modifikasjoner for høsting av PUD dyrket i andre BMEer, som Matrigel, kan være nødvendig, samt for modeller som er klumpete og vanskelige å dissosiere (se eksempler Tilleggsfigur 4). Deretter tilsettes fluorescerende fargestoffer til organoidkulturmediet ved plating (dag -1) ved en 2x konsentrasjon i et 100 μL-volum og inkuberes over natten for å bestemme baseline celledød. Neste dag (dag 0) tilsettes medikamenter eller andre behandlinger til organoidkulturmedier ved en 2x konsentrasjon i et volum på 100 μL, og tilsettes deretter hver brønn for et endelig volum på 200 μL. Det endelige volumet på 200 μL reduserer meniskeffekten med avbildning. Kinetiske bilder er anskaffet ved hjelp av Cytation 5-plateleseren i samarbeid med BioSpa-bordplateinkubatoren. BioSpa-inkubatoren tillater inkubering av eksperimentelle plater ved en fast temperatur på 37 ° C og 5% CO2 miljø. Opptil 8 plater kan lagres i BioSpa og dermed kan 8 eksperimenter utføres samtidig. Bildeparametere for hver plate er satt opp i Gen5-programvaren ved hjelp av "Imager Manual Mode" og lagret som en protokoll. Protokollen lastes deretter inn i planleggingsprogramvaren (BioSpa OnDemand). BioSpa OnDemand-programvaren automatiserer arbeidsflyten for kinetisk bildeopptak, inkludert fysisk overføring av platen fra BioSpa-inkubatoren til Cytation 5 og dikterer hvilken protokoll som skal kjøres i Gen5 for datainnsamling. Bildene analyseres ved hjelp av Cellular Analysis-funksjonen i Gen5-programvaren (figur 2). Vi beskriver spesifikke metoder for å analysere Z-projeksjoner av fluorescerende og lyse feltbilder. Spesifikke metoder for å analysere enkle Z-plan og/eller bare bilder av lyse felt finnes i tilleggsfil 1. Til slutt kan brukerne definere spesifikke datafunksjoner, for eksempel PUD-område, antall og gjennomsnittlig fluorescensintensitet, for å eksportere som et Excel-regneark for påfølgende statistisk analyse av narkotikaeffekter.

Gitt at PUD-modeller er et relativt nytt modellsystem for å undersøke legemiddeleffekter, dukker det fortsatt opp metoder for å imøtekomme kulturforholdene, spesielt vekst i BME,16. Hovedtyngden av studier som vurderer PUD-respons på medikamentell behandling, er avhengige av ATP-baserte endepunktanalyser som surrogat for cellehelse (CellTiter-Glo 3D). Denne metoden krever cellelyse, og utelukker dermed senere nedstrømsanalyser. Alternative endepunktanalyser, som fluorescerende farging, enkeltpunktavbildning og morfologisk sporing, har gitt andre beregninger for å karakterisere legemiddelrespons samtidig som prøvebruk til ytterligere formål er mulig. For eksempel har fikseringsprotokoller for endepunkter i plater blitt brukt for analyse med høy gjennomstrømning av legemiddeleffekter 17,18. En fordel med denne metoden er at den omgår den omfattende prosesseringen som kreves ved typisk immunhistokjemi og immunfluorescerende avbildning19 og er spesielt nyttig når prøven er begrenset, slik tilfellet er for PUD-modeller. Det er også egnet til høyoppløselig avbildning med konfokalmikroskopi. En annen endepunktsanalyse som ikke krever cellelyse, er levende celleavbildning med reagenser som propidiumjodid eller akridin oransje. Vår komparative analyse av CellTiter-Glo 3D og AOPI, hvorav sistnevnte ikke krever cellelyse, for vurdering av cellelevedyktighet og død (figur 6C), fremhever fordelene ved å bruke fargestoffer med levende celler i PUD-modeller. Denne metoden har blitt brukt av flere grupper, inkludert vår, for å vurdere fenotypiske effekter ved avslutningen av et eksperiment 18,19,20. Imidlertid krever kinetisk datainnsamling ved bruk av enten in-well fixation eller endpoint live-cell imaging metoder betydelig prøve. Etikettfri morfologisk vurdering av PUD over tid overvinner delvis denne begrensningen og kan vurderes ved hjelp av et bredt spekter av avbildningsmodaliteter 8,10,17,18, men endringer i morfologi er kanskje ikke representative for spekteret av potensielle legemiddeleffekter som apoptose og endringer i cellelevedyktighet. Vi har observert signifikant modell-til-modell-variabilitet i morfologiske endringer som respons på legemidler. For eksempel vil noen PUD-er øke i areal etter hvert som de gjennomgår apoptose, mens andre modeller kan krympe. Kinetiske morfologiske vurderinger har blitt multiplekset med enten faste eller levende cellefluorescerende endepunktanalyser i et begrenset antall studier18,20. Metodene som presenteres her er blant de første til å multiplekse forskjellige fluorescerende fargestoffer for samtidig å vurdere flere cellulære effekter i et system med høy gjennomstrømning.

En av de største forbedringene som tilbys av kinetisk levende celleavbildning er at den overvinner viktige begrensninger forbundet med endepunktanalyser. For eksempel er plating av like mange PUDer per brønn teknisk vanskelig fordi de fleste automatiserte celletellere er inngjerdet for objekter mindre enn 60 μm. Levende celleavbildning muliggjør normalisering til PUD-nummer eller -område på tidspunktet 0 timer i hver brønn, som deretter kan brukes til å justere for variasjon i plettering mellom brønner. Gullstandardendepunktanalysen for PUD-er er CellTiter-Glo 3D-settet, som måler ATP som et surrogat for cellelevedyktighet. Vi har i stor utstrekning brukt denne analysen i våre studier av gynekologiske og prostatakreft PUD 13,21,22,23,24. I tillegg til å kreve cellelyse for ATP-tiltak, kan medisiner og andre terapeutiske modaliteter endre ATP-nivåer, noe som potensielt gir en unøyaktig vurdering av terapeutisk respons. Bruk av fargestoffer med levende celler muliggjør kvantifisering av et bredere omfang av spesifikke cellulære responser, slik som apoptose og cytotoksisitet. Det er viktig at disse reagensene ikke forstyrrer cellens levedyktighet eller induserer DNA-skade, slik tilfellet er med propidiumjodid; Dette muliggjør gjentatt vurdering av PUD-respons over tid. Selv om vi ikke har undersøkt bruken av akridin oransje (AO) for kinetiske målinger, bør virkningsmekanismen for AO ikke utelukke slik anvendelse i fremtiden.

Svulster består av flere forskjellige cellepopulasjoner med varierende genomiske profiler og morfologier. På grunn av den komplekse heterogeniteten i PUD-modeller kan individuelle PUD-responser variere, og sporing av disse responsene er utfordrende. Vår protokoll gir en metode for å vurdere flere PUD-responsmålinger på brønn-for-brønn-basis. Imidlertid gjelder visse tekniske hensyn fortsatt for levende celleavbildning. Antall brønner på en 24-brønns plate som trengs for å så en 96-brønns plate vil avhenge av tettheten og vekstraten til hver PUD-modell. Fordi klumping kan forvirre bildeanalyse (tilleggsfigur 4), kan PUD-modeller trenge ytterligere prosesseringstrinn før plating. Om nødvendig kan PUD-er skjæres mekanisk under prosessering gjennom kraftig pipettering med en p200-spiss med ikke-bred boring. Enzymatisk fordøyelse ved bruk av TrypLE Express kan også anvendes før plating for å fremme PUD-dissosiasjon og redusert klumping. Etter vår erfaring har vi bemerket at lengden på TrypLE-inkubasjonen er svært variabel avhengig av modellen. Derfor bør TrypLE-inkubasjon optimaliseres for hver modell, spesielt hvis forskere ønsker å oppnå enkeltcellesuspensjoner. Restitusjonstid før behandlingsstart kan være nødvendig for PUD-modeller som er spesielt følsomme for enzymatisk fordøyelse.

Vi presenterer metoder for spesifikke levende celleavbildningsreagenser. En begrensning i den brede anvendeligheten av metodene som presenteres her, er en mangel på reagenser som er kompatible med BME. For andre fargestoffer/reagenser som ennå ikke er optimalisert for bruk i PUD, kan det være nødvendig med ytterligere feilsøking for å bestemme optimal konsentrasjon og minimere løsemiddeleffekter. Avhengig av avlesningen av interesse (f.eks. apoptose eller cytotoksisitet), bør behandling med en forbindelse kjent for å indusere celledød, som staurosporin eller daunorubicin13 , brukes til å optimalisere reagensbetingelser. En ekstra vurdering er den optimale tiden for fargestoffintegrasjon i BME-kuppelen. I våre eksperimenter utfører vi en inkubasjon over natten før behandling for å muliggjøre fullstendig opptak av fargestoffet i kuplene, samt bestemme baseline cellehelse. Siden signalintensiteten vil øke over tid, bør forskere utføre pilotstudier med fargestoffene for å bestemme den ideelle eksponeringstiden på slutten av forsøket for å unngå overeksponerte bilder. Endelig bør reagenser ikke forstyrre cellulære prosesser. For eksempel er fargestoffer som interkalerer til DNA ikke kompatible med kinetisk avbildning. Levende celleavbildning kan imidlertid brukes til datanormalisering i endepunktanalyser. Faktisk presenterer vi en supplerende metode for å kvantifisere cellenes levedyktighet og det levedyktige: døde celleforholdet ved bruk av AOPI. I dette eksperimentet normaliseres det fluorescerende signalet til PUD-nummer for hver brønn som bestemmes ved levende celleavbildning på dag 0 (behandlingsdag, figur 6).

En annen begrensning ved denne metodeartikkelen er avhengigheten av manuell pipettering for eksperimenter, noe som kan føre til større variasjon i tekniske replikater. Ytterligere forbedringer i reproduserbarhet av data kan oppnås ved tillegg av automatisering til andre trinn i den eksperimentelle prosessen, for eksempel bruk av en automatisert væskebehandler for plating og legemiddeldispensering, som det har blitt demonstrert av andre 8,10. Dette tillegget krever imidlertid en ekstra investering i forskningsinfrastruktur som kanskje ikke er tilgjengelig for alle etterforskere. Gitt heterogeniteten i PUD-området for hver modell, er normalisering av resultatene til det opprinnelige PUD-nummeret eller -området på tidspunktet 0 t fortsatt en nyttig tilnærming med automatisert såing.

En viktig fordel med Cytation 5 i forhold til andre live-cellebildebehandlingsplattformer er muligheten til å tilpasse bilde- og analysefunksjoner. Cytation 5/Gen5-programvaren har imidlertid en bratt læringskurve og antar at brukerne har grunnleggende kunnskap om bildebehandling. Et av målene med denne metodepapiret er å gi trinnvise instruksjoner for å redusere barrieren for andre forskere å innlemme sofistikerte levende celleavbildningsteknikker i sine PUD-forskningsprogrammer. Mens de spesifikke analysetrinnene som presenteres her, er for ett system, kan brukerne bruke multipleksingsprinsippene på andre plattformer, med forståelse for at nedstrømsanalyse kan nødvendiggjøre bruk av tredjepartsprogramvare, for eksempel NIH ImageJ.

Analysemål bør velges basert på både eksperimentelle mål og platingforhold. For eksempel, hvis eksperimentet utføres ved hjelp av et fluorescerende fargestoff for å kvantifisere celledød, er fluorescensintensitet en effektiv avlesning. Den mest effektive fluorescensmetrikken (total fluorescens vs. objektmiddelintensitet) vil avhenge av pletteringsforholdene (tilleggsfigur 4). Hvis PUD er jevnt fordelt og har en mer sirkulær, sammenhengende morfologi, kan fluorescens bestemmes i en definert PUD-subpopulasjon. Den spesifikke funksjonen i Gen5-programvaren er Cellular Analysis, og utgangen er Object Mean Intensity. Men hvis PUD-modellen er klumpete eller har en diskohesiv morfologi, anbefaler vi å kvantifisere fluorescenssignalet på bildenivå; denne funksjonen finner du under Bildestatistikk, og utgangen er Total fluorescensintensitet. Selv om denne metoden er nyttig for å observere endringer på det enkelte brønnnivå, er denne beregningen ikke spesifikk for objekter av interesse og kan endres feilaktig hvis PUD-ene beveger seg utenfor den angitte pluggen i løpet av eksperimentets varighet. I scenarier der det er betydelig rusk eller døde enkeltceller, anbefales bruk av cellulær analyse for å utelukke ethvert fluorescerende signal som ikke er spesifikt forbundet med en PUD. Et eksempel på differensialresultater ved bruk av cellulær analyse vs. bildestatistikk er presentert i tilleggsfigur 5.

For å bestemme den optimale terskelen for bildestatistikkfunksjonen, kan linjeverktøyet brukes. Ved hjelp av linjeverktøyet kan brukerne bestemme fluorescensintensitetsområdet i et bilde. Vi setter den nedre terskelen som 25% verdien av toppintensiteten i bildet. For å se de fluorescerende områdene som er inkludert i den angitte terskelen, merk av for "Threshold Outliers" -boksen. Ytterligere finjustering av nedre terskelverdi kan være nødvendig.

En betydelig utfordring i levende celleavbildning er lagring av den enorme mengden data som genereres med hvert eksperiment. Dette er spesielt relevant når det gjelder PUD-kulturer, hvor Z-stakker brukes til å avbilde over flere fokalplan og generere en Z-projeksjon. Det er flere metoder for å løse dette problemet. Først må du sørge for tilstrekkelig lagringskapasitet. Vi har installert tre solid state-harddisker med totalt 17 TB. Andre alternativer inkluderer overføring av eksperimentelle filer til eksterne harddisker eller nettverkslagring. Det anbefales ikke å skrive filer direkte til skybasert lagring. For å analysere data som er lagret på en ekstern stasjon, overfører du bare eksperimentet og bildefilene til en datamaskin utstyrt med Gen5-programvare (MERK: store filer kan ta lengre tid å overføre). Før analyse må bildene kobles til eksperimentet på nytt. Åpne eksperimentfilen, klikk Protokoll i verktøylinjen, velg Protokollalternativer. Klikk på Alternativer for lagring av bilde, og klikk på Velg ny bildemappe. Finn bildefilen, og klikk Velg mappe for å koble på nytt.

Avhengig av målene for eksperimentet, kan det også være hensiktsmessig å bruke binning-funksjonen i Gen5. Binning reduserer filstørrelsen ved å redusere antall piksler, noe som fører til lavere bildeoppløsning (se trinn 3.5.3.2). Derfor anbefales ikke binning hvis bilder med høy oppløsning kreves. Når du bruker binning-funksjonen, må eksponeringsinnstillingene justeres. Når den eksperimentelle filen er opprettet, dobbeltklikker du på Bilde-delen og klikker på mikroskopikonet for å åpne Imager Manual Mode på nytt. Bruk funksjonen Automatisk eksponering eller juster eksponeringen manuelt etter behov.

Oppsummert presenterer vi metoder for å vurdere apoptose og cellehelse av PUD som respons på cytotoksiske midler. Fremtidige studier er nødvendige for å optimalisere metoder og utvikle ytterligere analysestrategier for kinetisk avbildning av PUD, for eksempel andre fenotyper og effekter av legemidler som er cytostatiske snarere enn cytotoksiske. En stor hindring er den kommersielle tilgjengeligheten av fargestoffer og reagenser som er kompatible med BME. Det er fortsatt mer arbeid som er nødvendig for å bedre forstå hvordan kinetisk levende celleavbildning kan utnyttes fullt ut for å trekke ut mest mulig data fra disse modellene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

KWT er medeier i Immortagen Inc. CJD er ansatt i Agilent. JSdB har sittet i rådgivende styrer og mottatt honorarer fra Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo og Vertex Pharmaceuticals; er ansatt ved Institute of Cancer Research (ICR), som har mottatt finansiering eller annen støtte til sitt forskningsarbeid fra AZ, Astellas, Bayer, Cellcentric, Daiichi, Genentech, Genmab, GSK, Janssen, Merck Serono, MSD, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Pfizer og Vertex, og som har en kommersiell interesse i abirateron, PARP-hemming i DNA-reparasjon av defekte kreftformer, og PI3K/AKT-banehemmere (ingen personinntekt); ble navngitt som oppfinner, uten økonomisk interesse for patent 8 822 438, innsendt av Janssen som dekker bruk av abirateronacetat med kortikosteroider; har vært CI / PI i mange industrisponsede kliniske studier; og er seniorforsker ved Nasjonalt institutt for helseforskning (NIHR). Ingen andre forfattere har noen potensielle interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for Tissue Procurement Core og Dr. Kristen Coleman ved University of Iowa for å gi pasienttumorprøver og til Dr. Sofia Gabrilovich ved Institutt for obstetrikk og gynekologi for å bistå med generering av PUD-modeller. Vi takker også Dr. Valerie Salvatico (Agilent, USA) for kritisk analyse av manuskriptet. Vi anerkjenner følgende finansieringskilder: NIH / NCI CA263783 og DOD CDMRP CA220729P1 til KWT; Cancer Research UK, Prostate Cancer UK, Prostate Cancer Foundation og Medical Research Council til JSdB. Finansiørene hadde ingen rolle i utformingen eller analysen av eksperimenter eller beslutningen om å publisere.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrfuge tube Dot Scientific Inc 1008113
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62.554.100
554 NM LED Cube Agilent 1225012
96-well plate Corning Costar 3596 Prewarmed to 37 °C
96-well plate Agilent 204626-100 Prewarmed to 37 °C
A83-01 Tocris 2939 Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12 Gibco 12634-010 component of organoid culture media
B27 Supplement Gibco 17504044 Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator Agilent BIOSPAG-SN Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader Agilent CYT5PW-SN Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract R&D Systems BME001-10
Daunorubicin HCl Sigma-Aldrich S3035 Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2438
EDTA (0.5 M) Thermo Fisher AM9260G
Forskolin Tocris 1099 Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax Gibco 35050-061 Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES Gibco 15630-080 Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein Gibco AF-100-15-1MG Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein Gibco 100-26-1MG Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein Gibco 120-38-5UG Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution StemCell Technologies 7926 Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP Agilent 1225101
Imaging Filter Cube- TRITC Agilent 1225125
Imaging LED GFP/CFP Agilent 1225001
Incucyte Annexin V Red Dye Sartorius 4641 Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye Sartorius 4633 DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A7250 Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution Fisher-Scientific 13366169 Add 1:50 volume
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636 Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin R&D Systems 6057-NG Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x) Gibco 14190-144
Primocin InvivoGen ant-pm-05 Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1 Pepro Tech 100-03 Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich S6942
TrypLE Express Life Technologies 12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7 Sigma-Aldrich 688000 Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2758 Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  2. Lohmussaar, K., Boretto, M., Clevers, H. Human-derived model systems in gynecological cancer research. Trends Cancer. 6 (12), 1031-1043 (2020).
  3. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  4. de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Rep. 31 (11), 107762 (2020).
  5. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Curr Pharm Biotechnol. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  6. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  7. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer cell death analyzed by live cell imaging of spheroids. Sci Rep. 12 (1), 1488 (2022).
  8. Deben, C., et al. OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening. Cell Oncol (Dordr). 46 (2), 299-314 (2023).
  9. Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues). Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).
  10. Le Compte, M., et al. Multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis. J Vis Exp. 190, 64434 (2022).
  11. Hanson, K. M., Finkelstein, J. N. An accessible and high-throughput strategy of continuously monitoring apoptosis by fluorescent detection of caspase activation. Anal Biochem. 564-565, 96-101 (2019).
  12. Isherwood, B., et al. Live cell in vitro and in vivo imaging applications: accelerating drug discovery. Pharmaceutics. 3 (2), 141-170 (2011).
  13. Bi, J., et al. Successful patient-derived organoid culture of gynecologic cancers for disease modeling and drug sensitivity testing. Cancers (Basel). 13 (12), 2901 (2021).
  14. Binaschi, M., Zunino, F., Capranico, G. Mechanism of action of DNA topoisomerase inhibitors. Stem Cells. 13 (4), 369-379 (1995).
  15. Park, Y. Y., Ahn, J. H., Cho, M. G., Lee, J. H. ATP depletion during mitotic arrest induces mitotic slippage and APC/C(Cdh1)-dependent cyclin B1 degradation. Exp Mol Med. 50 (4), 1-14 (2018).
  16. Lukonin, I., Zinner, M., Liberali, P. Organoids in image-based phenotypic chemical screens. Exp Mol Med. 53 (10), 1495-1502 (2021).
  17. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nat Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  18. Ramm, S., et al. High-throughput live and fixed cell imaging method to screen matrigel-embedded organoids. Organoids. 2 (1), 1-19 (2023).
  19. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  20. Van Hemelryk, A., et al. Viability analysis and high-content live-cell imaging for drug testing in prostate cancer xenograft-derived organoids. Cells. 12 (10), 1377 (2023).
  21. Bi, J., et al. Advantages of tyrosine kinase anti-angiogenic cediranib over bevacizumab: Cell cycle abrogation and synergy with chemotherapy. Pharmaceuticals (Basel). 14 (7), 682 (2021).
  22. Bi, J., et al. Blocking autophagy overcomes resistance to dual histone deacetylase and proteasome inhibition in gynecologic cancer). Cell Death Dis. 13 (1), 59 (2022).
  23. Guo, C., et al. B7-H3 as a Therapeutic target in advanced prostate cancer. Eur Urol. 83 (3), 224-238 (2023).
  24. Gil, V., et al. HER3 is an actionable target in advanced prostate cancer. Cancer Res. 81 (24), 6207-6218 (2021).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 203
Multiplekset levende celleavbildning for legemiddelrespons i pasientavledede organoidmodeller av kreft
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colling, K. E., Symons, E. L.,… More

Colling, K. E., Symons, E. L., Buroni, L., Sumanasiri, H. K., Andrew-Udoh, J., Witt, E., Losh, H. A., Morrison, A. M., Leslie, K. K., Dunnill, C. J., de Bono, J. S., Thiel, K. W. Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer. J. Vis. Exp. (203), e66072, doi:10.3791/66072 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter