Summary
환자 유래 종양 오가노이드는 기초 및 중개 연구를 위한 정교한 모델 시스템입니다. 이 방법 기사에서는 다양한 오가노이드 표현형의 동시 역학 평가를 위한 다중 형광 라이브 셀 이미징의 사용에 대해 자세히 설명합니다.
Abstract
암 환자 유래 오가노이드(PDO) 모델은 암 세포주와 비교하여 인간 질병을 더 잘 재현하는 다기능 연구 시스템입니다. PDO 모델은 세포외 기저막 추출물(BME)에서 환자 종양 세포를 배양하고 3차원 돔으로 도금하여 생성할 수 있습니다. 그러나 단층 배양에서 표현형 분석에 최적화된 시판되는 시약은 BME와 호환되지 않는 경우가 많습니다. 여기에서는 자동화된 라이브 셀 이미징 시스템을 사용하여 PDO 모델을 도금하고 약물 효과를 평가하는 방법을 설명합니다. 또한 kinetic 측정과 호환되는 형광 염료를 적용하여 세포 건강과 세포 사멸을 동시에 정량화합니다. 이미지 캡처는 며칠에 걸쳐 일정한 시간 간격으로 발생하도록 사용자 지정할 수 있습니다. 사용자는 개별 Z 평면 이미지 또는 여러 초점면의 연속 이미지의 Z 프로젝션에서 약물 효과를 분석할 수 있습니다. 마스킹을 사용하여 PDO 번호, 면적 및 형광 강도와 같은 특정 관심 파라미터를 계산합니다. 당사는 세포 독성 물질이 세포 건강, 세포 사멸 및 생존력에 미치는 영향을 입증하는 개념 증명 데이터를 제공합니다. 이 자동화된 키네틱 이미징 플랫폼은 암의 PDO 모델에서 다양한 치료 효과를 이해하기 위해 다른 표현형 판독으로 확장될 수 있습니다.
Introduction
환자 유래 종양 오가노이드(PDO)는 암 발생 및 치료 반응을 연구하기 위한 강력한 모델 시스템으로 빠르게 부상하고 있습니다. PDO는 원발성 종양 1,2의 복잡한 게놈 프로필과 구조를 재현하는 3차원(3D) 세포 배양 시스템입니다. 불멸화된 암 세포주의 전통적인 2차원(2D) 배양과 달리, PDO는 종양 내 이질성 3,4을 포착하고 유지하므로 기계론적 연구와 중개 연구 모두에 유용한 도구입니다. PDO가 점점 더 대중화된 모델 시스템이 되고 있지만, PDO 배양과 호환되는 세포 효과에 대한 상업적으로 이용 가능한 시약 및 분석 방법은 제한적입니다.
치료 반응의 미묘한 변화를 분석할 수 있는 강력한 방법이 없기 때문에 임상 번역이 방해를 받습니다. 3D 배양에서 최고의 세포 건강 시약인 CellTiter-Glo 3D는 ATP 수준을 세포 생존율의 결정 요인으로 활용합니다 5,6. 이 시약은 종말점 분석에 유용하지만 몇 가지 주의 사항이 있으며, 특히 분석 완료 후 다른 목적으로 샘플을 사용할 수 없다는 점이 가장 두드러집니다.
살아있는 세포 이미징은 형광 시약과 결합할 때 세포사멸 7,8,9 및 세포 독성10을 포함하여 PDO 모델 내에서 다양한 세포 건강 판독값을 정량화할 수 있는 정교한 형태의 키네틱 현미경입니다. 실제로, 살아있는 세포 이미징은 2D 플랫폼에서 화합물의 고처리량 스크리닝에 필수적이었습니다11,12. Incucyte와 같은 시스템은 기술을 저렴하게 만들어 다양한 환경에서 연구 그룹에 액세스할 수 있도록 했습니다. 그러나 3D 배양을 분석하기 위한 이러한 시스템의 적용은 아직 초기 단계에 있습니다.
여기에서는 다중 생세포 이미징을 사용하여 암의 PDO 모델에서 약물 반응을 평가하는 방법을 설명합니다(그림 1). 명시야 이미지 분석을 통해 PDO 크기 및 형태 변화를 운동학적으로 모니터링할 수 있습니다. 또한 세포 사멸을 위한 Annexin V Red Dye 및 세포 독성을 위한 Cytotox Green Dye와 같은 형광 시약을 사용하여 시간 경과에 따라 세포 과정을 동시에 정량화할 수 있습니다. 제시된 분석법은 Cytation 5 live-cell imaging system에 최적화되어 있지만, 이 프로토콜은 다양한 live-cell imaging 플랫폼에 적용될 수 있습니다.
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Protocol
인간 종양 표본을 사용한 연구는 아이오와 대학교 IRB(Institutional Review Board), 프로토콜 #201809807의 검토 및 승인을 받았으며 1964년 헬싱키 선언 및 이후 개정안에 명시된 윤리 기준에 따라 수행되었습니다. 연구에 참여한 모든 피험자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 포함 기준에는 암 진단과 종양 표본의 가용성이 포함됩니다.
1. 96웰 플레이트에 온전한 PDO 도금
- 시약을 준비합니다.
- 96웰 플레이트를 37°C에서 밤새 예열하고 BME를 4°C에서 밤새 해동합니다.
- 관심 있는 암 유형 배양에 최적화된 전체 오가노이드 배양 배지를 준비합니다. 본원에 제시된 실험에 사용되는 특정 배양 배지는 보충 표 1에 나와 있다.
참고: 종양 유형에 따라 미디어 구성 요소를 수정해야 할 수도 있습니다. 예를 들어, 오가노이드 배양 배지는 부인과 종양에 대해 100nM 에스트라디올로 보충된다13. 준비된 배지는 4°C에서 1개월 동안 안정적입니다. 장기 보관을 위해 배지를 50mL 튜브에 분주하고 -20°C에서 보관합니다.
- 4°C 및 37°C에서 오가노이드 배양 배지의 두 가지 부분 표본을 준비합니다. 예를 들어, 60웰을 96웰 플레이트에 도금하는 경우 따뜻한 오가노이드 배양 배지 6mL와 얼음처럼 차가운 오가노이드 배양 배지 150μL를 사용합니다.
- 오가노이드 세척 완충액 준비: 10mM HEPES, 1x Glutamax, 5mM EDTA 및 10μM Y-27632로 1x PBS를 보충합니다. 4 °C에서 보관
- 24웰 플레이트에서 배양된 PDO를 수확합니다. 달리 명시되지 않는 한 얼음 위나 4°C에서 모든 단계를 수행하십시오.
- 진공 라인 시스템을 사용하여 각 웰에서 매체를 흡입합니다.
- 500 μL의 얼음처럼 차가운 오가노이드 세척 버퍼를 추가하고 1000 μL 피펫터를 사용하여 2-3배 부드럽게 피펫팅합니다. 접시를 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
- 각 웰의 내용물을 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 모든 PDO가 현탁액에 있는지 확인하려면 추가로 300μL의 오가노이드 세척 완충액으로 각각을 잘 헹구고 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 350 x g 에서 5분 동안 원심분리기
- 진공 라인 시스템을 사용하여 BME/오가노이드 펠릿에서 상층액을 흡입하고 튜브에 ~ 5mL를 남깁니다. 20mL의 오가노이드 세척 완충액을 추가하고 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
- 4°C의 350 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. PDO 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 진공 라인 시스템으로 상층액을 흡입합니다.
- 96웰 플레이트에 PDO 도금: 달리 명시되지 않는 한 얼음 위에서 모든 단계를 수행합니다.
- PDO 펠릿을 적절한 양의 얼음처럼 차가운 오가노이드 배양 배지에 재현탁시켜 PDO 현탁액을 생성합니다. PDO 현탁액을 얼음처럼 차가운 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
참고: 오가노이드 배양 배지의 양을 계산하려면 PDO가 오가노이드 배양 배지와 BME의 1:1 비율로 5μL 돔에 도금된다는 점을 고려하여 96웰 플레이트에 도금할 웰 수를 결정합니다. 예를 들어, 하나의 96웰 플레이트를 도금하고 내부 60웰만 사용할 때 필요한 PDO 현탁액의 총량은 300μL(150μL 오가노이드 배양 배지 및 150μL BME)입니다. 서로 다른 BME 비율에서 최적의 성장을 보이는 모델의 경우 이 단계에서 BME: 배지의 비율이 수정될 수 있지만 각 특정 모델에 대한 모든 분석에서 비율을 표준화하는 것이 중요합니다. 피펫팅 오류를 설명하기 위해 각 구성 요소에 10%의 부피를 추가하십시오. - PDO 수를 계산합니다.
- PDO 현탁액 2.5μL를 얼음처럼 차가운 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 옮기고 2.5μL의 BME와 혼합합니다. 5μL 혼합물을 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 옮깁니다. 슬라이드를 덮지 마십시오. 혼합물은 돔으로 응고됩니다.
- 명시야 현미경을 사용하여 4x로 시각화합니다. 5μL 혼합물의 PDO 수를 계산합니다. 목표는 5 μL 돔 당 약 25-50 개의 PDO를 갖는 것입니다.
참고: 테스트 혼합물에서 원하는 밀도에 도달하지 못한 경우 오가노이드 배양 배지를 더 추가하거나 PDO 현탁액을 원심분리하고 PDO 펠릿을 더 적은 부피의 얼음처럼 차가운 오가노이드 배양 배지에 다시 현탁시켜 PDO 현탁액의 최종 부피를 조정합니다. 이 단계에서 PDO 서스펜션이 어떻게 수정되는지에 관계없이 BME의 최종 비율: 1.5.3단계의 PDO 서스펜션. 1:1이어야 합니다.
- 넓은 보어 팁이 있는 200μL 피펫터를 사용하여 PDO 현탁액과 동일한 양의 BME를 조심스럽게 혼합하여 오가노이드 배양 배지와 BME의 1:1 비율을 달성합니다. 돔의 무결성을 방해하는 기포를 피하십시오.
- 20μL 피펫터를 사용하여 예열된 96웰 플레이트의 각 웰 중앙에 5μL 돔을 파종하고 내부 60웰만 파종합니다. PDO의 균등한 분포를 보장하기 위해 직경이 넓은 팁이 있는 200μL 피펫터로 1.5mL 튜브의 내용물을 주기적으로 피펫팅합니다.
- 모든 우물에 씨를 뿌린 후 접시에 뚜껑을 놓고 부드럽게 뒤집습니다. 거꾸로 된 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 20분 동안 배양하여 돔이 응고되도록 합니다.
참고: 플레이트를 뒤집으면 BME/오가노이드 배양 배지 돔이 3D 구조를 유지하여 PDO 형성을 위한 적절한 공간을 제공합니다. - 접시를 뒤집어 뚜껑을 덮고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
- PDO 펠릿을 적절한 양의 얼음처럼 차가운 오가노이드 배양 배지에 재현탁시켜 PDO 현탁액을 생성합니다. PDO 현탁액을 얼음처럼 차가운 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
2. 멀티플렉싱을 위한 형광 염료의 처리 및 첨가
- BME 돔이 96웰 플레이트에서 응고되는 동안 형광 라이브 셀 이미징 시약의 희석액을 준비합니다. Annexin V Red Dye 및 Cytotox Green Dye를 멀티플렉싱하기 위한 특정 파라미터가 본원에 주어진다.
- 형광 시약 준비(-1일): 각 웰이 100μL의 염료 주입 배지로 처리된다고 가정하고 처리할 웰 수를 기준으로 오가노이드 배양 배지의 적절한 부피를 계산합니다. 예열된 오가노이드 배양 배지에서 염료를 원하는 농도로 희석합니다.
참고: 필요한 용지의 총량은 실험에 따라 다릅니다. 피펫팅 오류를 설명하기 위해 최종 부피에 10%를 추가합니다. 예를 들어, 96웰 플레이트의 내부 60웰을 처리하려면 6.6mL의 염료 주입 배지를 준비합니다(표 1). - 100μL의 2x 염료 투여 오가노이드 배양 배지로 각각을 잘 처리합니다. 200μL의 멸균 1x PBS를 플레이트의 외부 빈 웰에 추가합니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
알림: 주변 웰의 PBS는 내부 웰에서 매체의 증발을 감소시킵니다. - 약물/처리제 추가(0일): 웰당 100μL의 부피로 2배 농도로 예열된 오가노이드 배양 배지에서 약물을 준비합니다.
참고: DMSO는 고농도의 세포에 독성이 있을 수 있습니다. 이 연구에서 수행된 실험에서 0.1% DMSO의 농도는 초과되지 않습니다. 약물 외에도 일부 형광 시약은 DMSO 용액으로 배포됩니다. 이러한 시약으로 작업할 때 총 DMSO 농도를 고려하는 것이 중요합니다. - 각 웰에 100μL의 2x 염료 주입 배지를 추가합니다. 거품을 만들지 마십시오.
3. 이미징 파라미터 설정
- Cytation 5에 플레이트를 놓습니다. 열다 Gen5 소프트웨어. 새 작업 > Imager Manual Mode(이미저 수동 모드)를 클릭합니다. 지금 캡처를 선택하고 다음 설정을 입력합니다: 대물렌즈(원하는 배율 선택); 필터(마이크로플레이트 선택); 마이크로플레이트 형식(웰 수 선택); 및 용기 유형(플레이트 유형 선택). 뚜껑 사용 및 느린 이동통신사 속도 사용을 클릭합니다. 확인을 클릭합니다.
참고: 용기 유형: 플레이트에 대한 정보를 선택할 때 가능한 한 구체적으로 작성해야 하는데, 이는 소프트웨어가 플라스틱의 각 플레이트 유형 및 두께에 대해 대물렌즈에서 플레이트 바닥까지의 특정 거리로 보정되기 때문입니다.
느린 캐리어 속도: 플레이트를 로드/언로딩할 때 돔이 중단되지 않도록 하려면 이 상자를 선택합니다. - 전체 BME 돔을 이미지화할 Z-Stack을 만듭니다.
- 보려는 관심 웰을 선택합니다(왼쪽 패널, 히스토그램 아래).
- Bright Field(명시야) 채널(왼쪽 패널, 상단)을 선택합니다. 자동 노출을 클릭하고 필요에 따라 설정을 조정합니다.
- Z-Stack의 하단과 상단을 설정합니다. 이미징 모드 탭(왼쪽 패널, 가운데)을 확장합니다. Z-Stack 상자를 선택합니다. 코스 조정 화살표(왼쪽 패널, 가운데)를 사용하여 모든 PDO가 초점이 맞지 않고 흐릿해질 때까지 아래쪽 조정을 클릭합니다. 이것을 Z-Stack의 맨 아래로 설정합니다. 코스 조정 화살표를 사용하여 반대 방향으로 반복하여 Z-Stack의 상단을 설정합니다.
- Z-스택 설정이 관심 있는 다른 웰에 적합한지 확인하려면 다른 웰(왼쪽 패널, 히스토그램 아래)을 선택하고 Z-스택의 상단과 하단을 시각화합니다.
- 초점 위치를 수동으로 입력하려면 미세 조정(왼쪽 패널, 상단) 옆에 있는 세 개의 점을 클릭합니다. 창이 열립니다. 맨 위 Z-Stack 값(왼쪽 패널 중앙, 이미징 모드 아래에 있음)을 입력합니다. 맨 아래 Z-스택 값에 대해 반복합니다. 필요에 따라 3.2.3단계를 반복하여 원하는 Z 범위를 캡처하도록 조정합니다. 조정이 필요한 경우 다른 웰을 선택하여 설정을 확인합니다.
- 형광 채널의 노출 설정을 지정합니다. 설정은 두 개의 형광 채널(GFP 및 TRITC)에 대해 설명되어 있습니다. 형광 채널의 구체적인 수는 실험과 살아있는 세포 이미징 시스템에 설치된 형광 큐브에 따라 다릅니다.
알림: 실험이 끝날 때 신호 강도가 상당히 높을 것으로 예상되는 경우 사용자는 실험이 끝날 때 초기 매개변수를 설정할 때 적용할 수 있는 최적의 노출 설정을 결정하기 위해 테스트 실험을 수행하는 것을 고려해야 합니다.- 이미징 모드 탭(왼쪽 패널, 가운데)을 확장하고 이미징 단계 편집을 엽니다. 팝업 창이 나타납니다.
- 채널에서 원하는 채널 수에 대한 풍선을 클릭합니다. 명시야에 대해 하나의 채널을 지정하고 각 형광 채널에 대해 추가 채널을 지정합니다. 이 예에서 채널 1 = Bright Field; 채널 2 = GFP; 채널 3 = TRITC. 색상 드롭다운 메뉴를 사용하여 각 채널에 적합한 설정을 선택합니다. [확인]을 클릭하여 편집 창을 닫습니다.
- 각 형광등 채널을 설정합니다.
- 채널을 GFP(왼쪽 패널, 상단)로 전환합니다.
- 자동 노출(왼쪽 패널, 상단)을 클릭합니다. 노출 탭(왼쪽 패널, 가운데)을 확장하고 노출 설정을 조정하여 배경 신호를 최소화합니다.
- 3.3.3.3-3.3.3.6 단계에 따라 노출 설정을 이미지 모드 탭에 복사합니다.
- 이미징 단계 편집(Edit Imaging Step) 상자 옆에 있는 복사(Copy) 아이콘을 클릭합니다. 이미징 단계 편집을 클릭하면 다른 창이 열립니다.
- GFP 채널 아래의 노출 라인에서 클립보드 아이콘을 클릭하여 조명, 통합 시간 및 카메라 게인 설정을 채널에 추가합니다.
- TRITC 채널에 대해 3.3.3.4-3.3.3.5단계를 반복합니다. 확인을 클릭하여 창을 닫습니다.
- 이미지 전처리 및 Z-투영 단계를 설정하여 이미지 전처리를 자동화합니다.
- 카메라 아이콘(왼쪽 패널, 하단 모서리)을 클릭합니다. 새 창이 열립니다.
- Add Processing Step(처리 단계 추가)(왼쪽 패널, 하단)에서 Image Preprocessing(이미지 전처리)을 클릭합니다. 새 창이 열립니다.
- [Bright Field] 탭에서 [Apply Image Preprocessing]을 선택 취소합니다.
- 각 형광 채널(Fluorescent Channel ) 탭에서 이미지 사전 처리 적용(Apply Image Preprocessing )이 선택되어 있는지 확인합니다. [채널 1과 동일한 옵션 사용]을 선택 취소하고 [확인]을 클릭합니다. 창이 닫힙니다.
- 처리 단계 추가(Add Processing Step)에서 Z 투영(Z Projection)을 클릭합니다. 새 창이 열립니다. 원하는 경우 슬라이스 범위를 조정합니다(예: Z 범위 좁히기). 확인을 선택하여 창을 닫습니다.
- 프로토콜을 만듭니다.
- 도구 모음에서 이미지 세트를 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 Create experiment from this image set(이 이미지 세트에서 실험 만들기)를 클릭합니다. 이미징 창이 닫히고 절차 창이 열립니다.
알림: Imager Manual Mode 에서 선택한 매개변수는 자동으로 새 창에 로드되어 실험 프로토콜을 생성할 수 있습니다. - 온도 및 기울기 설정하기: 동작 머리말(왼쪽) 아래에서 온도 설정을 클릭하십시오. 새 창이 열립니다. Incubator On(인큐베이터 켜기)을 선택하고 Temperature(온도)에 원하는 온도를 수동으로 입력합니다. 그런 다음 그라데이션에서 수동으로 1을 입력합니다. 확인을 선택하여 창을 닫습니다.
알림: 1°C 기울기를 생성하면 플레이트 뚜껑에 결로가 형성되는 것을 방지할 수 있습니다. - 이미지에 웰을 지정합니다.
- Description(설명)에서 Image Step(이미지 단계)을 두 번 클릭합니다. 전체 플레이트(오른쪽 모서리, 상단)를 클릭합니다. 그러면 플레이트 레이아웃 창이 열립니다.
- 커서를 사용하여 관심 있는 우물을 강조 표시합니다. 확인을 클릭합니다. 원하는 경우 Autofocus Binning 및 Capture Binning 상자를 선택합니다. 확인을 클릭하여 창을 닫습니다.
알림: 비닝은 위의 3.3.3.2단계에서 설명한 대로 노출 조정이 필요합니다. 이 기능을 사용할 수 있는 특정 시나리오에 대해서는 토론 섹션을 참조하십시오.
- 키네틱 이미징의 간격을 설정합니다.
- Other(기타) 제목 아래에 있는 Options(옵션)를 클릭합니다(왼쪽). 불연속 운동 절차(Discontinuous Kinetic Procedure) 상자를 선택합니다.
- 예상 총 시간에 실험의 실행 시간(예: 5일)을 입력합니다. Estimated Interval(예상 간격)에 플레이트를 이미지화할 간격(예: 6시간마다)을 입력합니다.
- 각 실행 후 일시 중지를 클릭하여 플레이트가 인큐베이터로 옮겨질 시간을 허용합니다. 확인을 선택하여 창을 닫습니다.
- 데이터 축소 단계를 업데이트합니다.
- OK(확인)를 클릭하여 Procedure Window(절차 창)를 닫습니다. 데이터 축소 단계를 업데이트할 수 있는 탭이 열립니다. 예를 선택합니다. Image Preprocessing(이미지 전처리)을 두 번 클릭합니다. 다른 채널을 클릭하여 설정을 확인하고 확인을 클릭합니다.
- Z 투영을 두 번 클릭합니다. 다른 채널을 클릭하여 설정을 확인합니다. 확인을 클릭합니다. 그런 다음 확인을 다시 클릭하여 데이터 축소 창을 닫습니다.
- 플레이트 레이아웃의 서식을 지정합니다.
- 플레이트 레이아웃 마법사를 열고 3.6.2-3.6.3단계에 따라 웰 유형을 지정합니다.
- 도구 모음(왼쪽 모서리, 상단)에서 플레이트 레이아웃 아이콘을 클릭하여 플레이트 레이아웃 마법사를 엽니다.
- 실험에 사용된 웰 유형 옆에 있는 상자를 선택합니다. Assay Controls(분석 제어)에서 화살표를 사용하여 다양한 제어 유형의 수를 입력합니다. Next(다음 )를 클릭하여 Assay Control #1 창을 엽니다.
- 3.6.5-3.6.8 단계에 따라 분석 제어 웰 조건을 설정합니다.
- Assay Control #1 창에서 플레이트 레이아웃 ID(Plate Layout ID) 상자에 컨트롤 라벨을 입력합니다. 원하는 경우 옆에 있는 상자에 전체 이름을 입력합니다. 화살표를 사용하여 각 제어 조건에 대한 반복실험 횟수를 선택합니다.
- 제어 내에서 여러 농도 또는 희석 시리즈를 사용하는 경우 희석/농도 정의를 클릭하고 드롭다운 메뉴를 사용하여 유형을 선택합니다. 표의 각 농도/희석에 대한 값을 입력합니다.
알림: 농도가 일정한 증분으로 변하는 경우 자동 기능을 사용할 수 있습니다. - 도구 모음에서 색상 탭을 선택합니다. 드롭다운 메뉴에서 원하는 텍스트 색상과 제어할 배경색을 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
- 추가 컨트롤을 사용하여 필요에 따라 반복합니다.
- 설정 샘플 웰 조건 3.6.10-3.6.12에 따릅니다.
- Sample Setup(샘플 설정) 페이지에서 샘플 ID 접두사(예: SPL)를 입력합니다. 화살표를 사용하여 반복실험 횟수를 선택합니다. 처리 농도가 다양한 시료를 사용하는 경우 유형 드롭다운 메뉴에서 농도 또는 희석을 선택합니다. 표에 희석/농도를 입력하고 단위 상자에 단위를 입력합니다.
- 도구 모음에서 Identification Fields(식별 필드 )를 선택합니다. 표에 원하는 범주 이름 (예: 샘플 ID, 약물)을 입력합니다.
- 도구 모음에서 색상 탭을 선택합니다. 각 처리 그룹/샘플에 대해 다른 색상을 선택합니다. Finish(마침)를 클릭합니다. 그러면 플레이트 레이아웃 페이지가 열립니다.
알림: 왼쪽의 숫자는 다른 샘플 번호와 관련이 있습니다. - 3.6.14-3.6.16단계에 따라 샘플 ID를 할당합니다.
- 고르다 왼쪽 패널의 SPL1. 커서를 사용하여 우물을 선택합니다.
참고: 자동 선택 도구는 직렬 할당 상자에서 조정할 수 있습니다. 반복실험 횟수와 레이아웃의 방향을 미리 지정할 수 있습니다. - 다른 샘플로 반복하여 플레이트 레이아웃을 완성합니다. 만족스러우면 확인을 클릭합니다 .
- 파일 도구 모음에서 샘플 ID를 선택합니다. Sample ID 열에 각 샘플에 대한 적절한 정보(예: 약물 유형)를 입력합니다. OK를 누릅니다.
- 프로토콜을 저장합니다.
- 도구 모음에서 File( 파일 ) > Save Protocol as(다른 이름으로 프로토콜 저장)를 클릭합니다. 파일을 저장할 위치를 선택합니다. 파일 이름을 입력합니다. Save(저장 )를 클릭하여 창을 닫습니다.
- 도구 모음에서 File(파일) > Exit(종료 )를 클릭합니다. Imager Manual Mode 에 대한 변경 사항을 저장할 수 있는 탭이 열립니다. 아니요를 선택합니다.
- 실험 1에 대한 변경 사항을 저장할 수 있는 탭이 열립니다. 아니요를 선택합니다. 프로토콜 정의를 업데이트하기 위한 탭이 열립니다. 업데이트를 선택합니다. 소프트웨어를 닫습니다.
- 도구 모음에서 이미지 세트를 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 Create experiment from this image set(이 이미지 세트에서 실험 만들기)를 클릭합니다. 이미징 창이 닫히고 절차 창이 열립니다.
- 프로토콜을 BioSpa OnDemand로 가져오고 실험 설정을 완료합니다.
- BioSpa OnDemand(스케줄링 소프트웨어) 소프트웨어를 엽니다.
- 소프트웨어에서 사용 가능한 슬롯을 선택합니다.
- 살아있는 세포 이미징 시스템에서 플레이트를 제거합니다. 서랍 열기 를 클릭하여 스케줄링 소프트웨어의 해당 슬롯에 액세스하고 플레이트를 삽입합니다. [서랍 닫기]를 클릭합니다.
참고: 이 단계는 위의 3.5.7단계에서 프로토콜을 만든 후 언제든지 수행할 수 있습니다. 그러나 플레이트는 아래 단계 5에서 타이밍 실행을 수행하기 위해 Cytation 3.6.4.3에 있어야 합니다. - 프로토콜을 가져옵니다.
- Procedure Info(절차 정보) 탭의 드롭다운 메뉴에서 User(사용자)를 선택합니다. Protocol(프로토콜) 슬롯 옆에 있는 Select > Add a new entry(새 항목 추가)를 클릭합니다.
- Protocol(프로토콜) 슬롯 옆에 있는 Select(선택)를 클릭합니다. 그러면 파일 아키텍처에서 원하는 프로토콜로 이동할 수 있는 새 창이 열립니다. Open(열기 )을 클릭하여 프로토콜을 스케줄링 소프트웨어로 가져옵니다.
- 플레이트를 이미지화하는 데 필요한 시간을 입력합니다. 확인을 클릭하여 Gen5 프로토콜 목록 창을 닫습니다.
참고: 이 단계는 한 번에 여러 실험을 실행할 때 특히 중요합니다. 이미지를 만드는 데 필요한 시간을 결정하려면 지금 타이밍 실행 수행을 클릭합니다. 확인을 클릭합니다.
- 이미징 간격을 설정하고 실험을 예약합니다.
- 간격(Interval)에 3.5.4단계에서 지정한 이미징 간격을 입력합니다.
- Start Time Options(시작 시간 옵션)에서 When Available(사용 가능한 경우)을 선택합니다. 기간(Duration)에서 고정(Fixed) 또는 연속(Continuous)을 선택합니다.
참고: 사용 가능한 다음 시간에 프로토콜을 실행하는 대신 특정 시작 시간을 지정할 수 있습니다. 고정 기간을 선택하면 실험에 대한 특정 엔드포인트가 설정되며 사용자가 실험 기간을 지정해야 합니다. 연속 기간을 사용하면 끝점 없이 실험을 실행할 수 있으며 사용자가 실험을 중지해야만 종료할 수 있습니다. - 플레이트/베슬 예약(Schedule Plate/Vessel)을 클릭합니다. 그러면 플레이트 검증 시퀀스(Plate Validation Sequence) 가 열립니다. 제안된 첫 번째 읽기 시간과 함께 탭이 열립니다. Yes(예)를 클릭하여 이 일정을 수락합니다.
4. Gen5 소프트웨어의 이미지 분석 (그림 2)
- 이미지 분석 모듈을 엽니다.
- Gen5를 엽니다. Task Manager(작업 관리자)에서 Experiments(실험) > Open(열기)을 선택합니다. 실험을 선택하여 파일을 엽니다. 도구 모음에서 플레이트 > 뷰(Plate View)를 클릭합니다.
- 데이터 드롭다운 메뉴를 Z 투영으로 변경합니다. 관심 있는 우물을 두 번 클릭합니다. 새 이미지 분석 데이터 축소 단계를 설정하려는 > 분석을 선택합니다. 확인을 클릭합니다.
- 세포 분석
- 기본 마스크
- Analysis Settings(분석 설정)에서 Type: Cellular Analysis and Detection Channel: ZProj[Tsf[Bright Field]](왼쪽 패널, 중앙)를 선택합니다.
- 옵션을 클릭합니다. 그러면 Primary Mask and Count 페이지가 열립니다. Threshold(임계값) 상자에서 Auto(자동)를 선택하고 Apply(적용)를 클릭합니다. 객체 강조 표시 상자(오른쪽 패널, 하단)를 클릭하여 지정된 임계값 내에 있는 객체를 표시합니다. 관심 있는 개체를 포함하도록 필요에 따라 조정합니다.
참고: 임계값 설정은 픽셀 강도를 기반으로 합니다. 예를 들어 임계값을 5000으로 설정하면 강도가 5000보다 큰 픽셀이 분석에 포함됩니다. - 객체 선택에서 최소 및 최대 객체 크기(μm)를 지정합니다. 세포 파편/단일 세포를 제외하도록 필요에 따라 조정합니다.
알림: PDO 크기는 모델 및 유형에 따라 크게 다를 수 있습니다. Gen5 소프트웨어의 측정 도구를 사용하여 각 모델의 최소 및 최대 PDO 크기 임계값을 결정합니다. 사용자는 약물 처리 후 이후 시점에서 PDO 단편이 배제되는 것을 방지하기 위해 측정 도구에서 제공하는 값에 비해 더 작은 최소 PDO 크기 임계값을 선택할 수 있습니다. - 분석을 웰의 특정 영역으로 제한하려면 [전체 이미지 분석] 을 선택 취소하고 [플러그]를 클릭합니다. 이미지 플러그 창에서 드롭다운 메뉴를 사용하여 플러그 모양을 선택합니다. 관심 영역에 맞게 필요에 따라 크기 및 위치 매개변수를 조정합니다.
알림: 플러그 내의 PDO 수를 최대화하는 동시에 배경을 최소화하기 위해 PDO 없는 영역을 제외하는 것이 중요합니다. 반복실험에서 관심 객체의 대부분을 일관되게 캡처할 수 있는 플러그 크기를 지정합니다. 돔의 가장자리를 제외하는 플러그를 생성하는 것은 가장자리 주변의 돔의 극단적인 곡률에서 빛의 굴절로 인해 왜곡되어 나타날 수 있는 물체를 제외하기 때문에 중요합니다. 기본 에지 오브젝트 포함 을 선택 취소하여 플러그 내의 전체 PDO만 캡처할 수도 있습니다.
- 하위 모집단 분석. 하위 모집단 지정의 예가 그림 3에 나와 있습니다.
- Cellular Analysis(세포 분석) 도구 모음에서 Calculated Metrics(계산된 메트릭)를 클릭합니다. 관심 있는 개체 수준 메트릭 선택 또는 만들기(오른쪽 모서리, 하단)를 클릭합니다. Available Object metrics(사용 가능한 개체 메트릭)에서 관심 있는 메트릭(예: 순환성)을 선택하고 Insert(삽입) 버튼을 클릭합니다. 확인을 클릭합니다.
참고: 각 PDO 모델의 형태와 밀도는 하위 모집단을 구별하는 데 가장 적합한 메트릭을 결정합니다. - Cellular Analysis(세포 분석) 도구 모음에서 Subpopulation Analysis(하위 집단 분석)를 클릭합니다. 추가를 클릭하여 새 하위 모집단을 만듭니다. 팝업 창이 열립니다.
- 원하는 경우 하위 모집단의 이름을 입력합니다. Object Metrics(개체 메트릭)에서 관심 있는 메트릭을 선택하고 Add Condition(조건 추가)을 누릅니다. Edit Condition(조건 편집 ) 창에서 선택한 Object Metric(객체 메트릭)에 대한 파라미터를 입력합니다. 필요에 따라 추가 메트릭을 사용하여 반복합니다.
알림: 매개변수는 수동으로 조정하거나 파인더 도구를 사용하여 설정할 수 있습니다. 예를 들어, 파편을 제외하기 위해 사용자는 면적을 객체 메트릭으로 추가하고 800보다 작은 객체를 선택할 수 있습니다. 개체 메트릭으로서의 원형도는 일상적으로 사용되며 모델에 따라 원형도가 0.2-0.5보다 큰 모든 개체가 포함됩니다. - 창 하단의 표에서 표시할 결과를 확인합니다. OK(확인) > Apply(적용)를 클릭합니다.
- 하위 모집단 내의 개체를 보려면 개체 세부 정보 드롭다운 메뉴(오른쪽 패널, 가운데)를 사용하여 하위 모집단을 선택합니다. 매개변수에 속하는 개체는 이미지에서 강조 표시됩니다.
참고: 기본 마스크와 하위 모집단의 강조 색상을 변경하려면 설정(오른쪽 패널, 하단)을 클릭합니다. - 부분인구 파라미터를 조정하려면 Cellular Analysis(세포 분석) 도구 모음에서 Subpopulation Analysis(부분인구 분석) 창을 다시 엽니다. 하위 모집단을 선택하고 편집을 클릭합니다. 단계 추가를 클릭합니다.
참고: 이렇게 하면 모든 시점에서 실험 내의 모든 웰에 동일한 분석이 적용됩니다. 매트릭스 페이지의 드롭다운 메뉴에서 개별 보기에 대해 다른 메트릭을 선택할 수 있습니다.
- Cellular Analysis(세포 분석) 도구 모음에서 Calculated Metrics(계산된 메트릭)를 클릭합니다. 관심 있는 개체 수준 메트릭 선택 또는 만들기(오른쪽 모서리, 하단)를 클릭합니다. Available Object metrics(사용 가능한 개체 메트릭)에서 관심 있는 메트릭(예: 순환성)을 선택하고 Insert(삽입) 버튼을 클릭합니다. 확인을 클릭합니다.
- 기본 마스크
5. Gen5에서 Excel로 데이터 내보내기
- 내보낼 데이터 파일을 사용자 정의하려면 도구 모음에서 Report/Export Builders 아이콘을 선택합니다. 팝업 창에서 Excel로 새로 내보내기를 클릭합니다.
- 팝업 창의 Properties 페이지에서 Scope > Plate 및 Content > Custom을 선택합니다. 도구 모음에서 Content 옵션을 클릭합니다. 템플릿 편집을 클릭하면 Excel 프로그램이 열립니다.
- 스프레드시트 내에서 추가 기능 > Table > Well Data를 선택합니다. 다양한 선택 항목 위로 마우스를 가져가면 내보내기 옵션을 볼 수 있습니다. 관심 있는 메트릭(예: Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]])을 선택합니다.
참고: 플레이트 레이아웃은 Add-ins(추가 기능) > Protocol Summary(프로토콜 요약) > Layout(레이아웃)을 선택하여 스프레드시트 분석 템플릿에 추가할 수 있습니다. - 편집 창이 열립니다. 웰(Wells) 상자에서 내보낼 웰을 Well-ID 또는 Well #으로 지정합니다. 확인을 선택합니다. 템플릿이 스프레드시트 파일에 로드됩니다. 스프레드시트를 닫습니다. 템플릿이 자동으로 저장됩니다.
- Excel로 새 내보내기 창에서 확인을 클릭하고 보고서/내보내기 빌더 창을 닫습니다.
- Gen5 도구 모음에서 내보내기 아이콘을 클릭합니다. 원하는 내보내기 파일 옆에 있는 상자를 선택합니다. 확인을 클릭합니다. Gen5는 스프레드시트 템플릿을 자동으로 채우고 Excel에서 파일을 엽니다.
6. 외부 데이터 분석
- Excel에서 내보내기 파일(.xlsx)을 엽니다.
- 각 웰에 대해 각 개별 값을 해당 웰의 0:00 시점 값으로 나눕니다. 이렇게 하면 시점 0이 1로 설정되고 그 이후의 각 값은 초기 판독값을 기준으로 합니다.
- 데이터 분석 소프트웨어에서 새 파일을 엽니다. XY 배치 옵션을 선택합니다.
참고: 이 프로토콜에서는 GraphPad Prism(버전 9.5.1)이 사용되었습니다. - 각 데이터 그룹에 대한 입력 레이블입니다. 각 처리 그룹에 대한 시간 점과 해당 정규화 값을 복사하여 프리즘 테이블에 붙여넣습니다. 데이터에 대한 그래프가 자동으로 생성되며 그래프에서 찾을 수 있습니다.
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Representative Results
우리의 목표는 PDO 치료 반응을 평가하기 위해 다중 라이브 셀 이미징을 사용하는 타당성을 입증하는 것이었습니다. 개념 증명 실험은 자궁내막암의 두 가지 개별 PDO 모델인 ONC-10817 및 ONC-10811에서 수행되었습니다(ONC-10811 데이터는 보충 그림 1 및 보충 그림 2 참조). 세포사멸(Apoptosis, annexin V 염색) 및 세포독성(Cytotox Green uptake)은 세포사멸 유도제인 스타우로스포린(staurosporine)에 반응하여 운동학적으로 모니터링되었습니다. 구체적으로, PDO를 96웰 플레이트에 도말하고, Annexin V Red 및 Cytotox Green 염료로 처리하고, 그림 1의 다이어그램과 같이 37°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 배치했습니다. 두 개의 독립적인 PDO 모델에서 Annexin V 및 Cytotox Green 염료를 사용한 처리가 독성이 없음을 확인했습니다(보충 그림 2). 다음 날, PDO는 스타우로스포린(0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 500 nM)의 농도를 증가시켜 처리하였다. 그 후, Gen5 소프트웨어에서 프로토콜을 설정하고 실험을 5일 동안 실행하도록 설정했으며, 6시간마다 이미징했습니다. 데이터는 프로토콜의 섹션 4에 설명된 대로 Gen5 소프트웨어의 세포 분석 기능을 사용하여 분석되었습니다. 기본 마스크는 "Split touching objects"를 선택하지 않고 최소 30μm 및 최대 1000μm의 크기 매개변수로 자동 임계값 기능을 사용하여 설정되었습니다. PDO 하위 모집단은 순환성 > 0.25로 정의되었습니다. 지정된 PDO 하위 집단 내에서 TRITC(annexin V, apoptosis) 및 GFP 채널(Cytotox Green, 세포 독성)의 Object Mean Intensities를 추가 분석을 위해 .xlsx 파일로 내보냈습니다. GFP 및 TRITC 채널 모두의 각 시점에서 각 웰에 대한 Object Mean Intensity는 시간 0으로 정규화되었습니다. 그런 다음 정규화된 형광 데이터를 Prism 파일로 전송하고 라인 플롯으로 시각화했습니다.
스타우로스포린을 사용한 치료는 TRITC(annexin V) 및 GFP(Cytotox) 채널 모두에서 Object Mean Intensity의 증가에 의해 입증된 바와 같이 차량 대조군과 비교하여 시간이 지남에 따라 세포사멸의 상당한 용량 의존적 증가 및 세포 건강의 감소를 초래했습니다(그림 4, 그림 5, 보충 비디오 1, 보충 비디오 2, 보충 비디오 3, 보충 동영상 4, 보충 동영상 5, 보충 동영상 6, 보충 동영상 7). 500nM, 100nM 및 10nM 용량의 스타우로스포린은 각각 시간이 지남에 따라(그림 5A-C) 그리고 실험이 끝날 때(그림 5E,F) 세포 사멸과 세포 독성에서 통계적으로 유의하게 증가했습니다. 또한, 스타우로스포린은 전체 PDO 면적의 전반적인 감소로 입증된 바와 같이 이러한 농도에서 PDO 성장 및 형성을 효과적으로 억제한 반면, 대조군은 총 PDO 면적의 증가를 나타냈습니다(그림 4 및 그림 5D).
살아있는 세포 이미징의 주요 장점은 도금의 변동성을 보정할 수 있다는 것이므로, 세포 생존율을 종점 척도로 평가하는 실험을 수행했습니다. 개념 증명 종점 분석 데이터는 환자 유래 전립선암 이종이식에서 생성된 PDO 모델을 사용하여 수집되었습니다. 명시야 이미지는 치료 기간(0일)이 시작될 때 수집한 후 생존력(acridine orange, AO)과 세포 사멸(propidium iodide, PI)을 모두 측정하는 이중 염료 시약을 추가했습니다. AO 성분은 세포 생존율의 지표인 이중 가닥 DNA에 결합할 때 녹색 형광 신호를 방출합니다. PI 성분은 죽은 유핵 세포를 염색하고 치료에 대한 반응으로 세포 사멸을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. PDO 도금의 변동성을 설명하기 위해 명시야 이미지를 디지털 위상차 이미지로 변환하여 시간 0에서 웰당 PDO 수를 결정하는 방법을 고안했습니다(보충 그림 3 및 보충 파일 1).
전립선암 PDO는 세포 사멸을 유발하는 화학요법제인 다우노루비신으로 7일 동안 치료되었습니다. 실험이 완료되면, 보충 파일 1에 기술된 바와 같이 AOPI로 샘플을 염색한 후, Gen5에서 형광 이미지를 분석하였다. 그림 6A 는 7일째 AOPI 종점 분석의 이미지 패널을 보여줍니다. 비히클 처리된 PDO(1열)와 10μM 다우노루비신으로 처리된 PDO(2열)를 비교했을 때, 녹색 형광(생존력 측정, 2열)이 뚜렷하게 감소하고 적색 형광(세포 사멸 측정, 3열)이 증가했습니다. 그런 다음 이러한 결과를 그림 6B에서 정량화했으며, 여기서 AOPI 종말점 염색 기법을 사용하여 얻을 수 있는 판독 배열을 보여줍니다. 왼쪽 상단 플롯은 AO 염색에서 생성된 생존도 측정값을 나타내며, 0일차에 각 웰의 디지털 위상차 이미지 분석에 의해 결정된 PDO 수로 정규화됩니다. 이러한 데이터는 그림 6A의 시각적 결과와 상관관계가 있으며, 다우노루비신의 농도가 증가함에 따라 생존율이 급격히 감소했습니다. 이는 오른쪽 상단 그래프에 자세히 나와 있으며, 이는 PI 염색으로 획득한 적색 형광의 증가로 표시되는 세포 사멸의 증가를 보여줍니다.
그런 다음 PI 데이터를 생존도 판독값(AO)과 결합하여 생존 대 사멸 비율을 계산했습니다(그림 6B, 왼쪽 하단 그래프). 이 비율은 약물이 세포증식 억제 또는 세포독성인지 여부를 결정하는 데 유용한 접근 방식입니다. 구체적으로, 세포독성 약물은 세포증식 억제 약물이 성장을 억제하지만 세포 사멸을 유도하지 않을 수 있다는 사실 때문에 세포증식 억제 약물보다 0에 훨씬 더 가깝습니다. 마지막으로, PDO가 세포 사멸 및 번짐을 겪을 수 있는 경우에도 AO 염색의 녹색 형광을 사용하여 PDO의 면적을 정확하게 계산할 수 있습니다. 오른쪽 아래 그래프는 하위 모집단 분석에서 표시된 면적의 합을 PDO 번호로 나눈 값으로 계산된 평균 PDO 면적을 나타냅니다. 이 부위를 분석하면 치료가 단순히 PDO 성장을 억제하는지 아니면 실제로 PDO 퇴행을 유발하는지에 대한 추가 지표를 얻을 수 있습니다. 평균 PDO 면적 분석은 GFP 채널 및 세포 분석 기능을 사용하여 수행되었으며, 이는 명시야 이미지를 사용하여 총 PDO 면적을 계산한 그림 5D와 대조적입니다. 이러한 데이터는 데이터 가용성 및 사용자 관심에 따라 분석 파이프라인의 유연성을 강조합니다.
마지막으로, 생존도 판독의 황금 표준인 CellTiter-Glo 3D를 AOPI를 사용한 생존도 형광 판독과 비교했습니다(그림 6C). 이 정규화는 일반적으로 CellTiter-Glo 3D 키트를 사용하는 실험실에서 수행되지 않으므로 이 패널의 데이터는 시간 0 PDO 번호로 정규화되지 않았습니다. 두 분석 모두에서 약물 효과에 대해 동일한 경향을 관찰했으며, 다우노루비신 농도가 증가함에 따라 PDO 생존율이 감소했습니다. 이러한 판독 값의 유일한 시각적 차이점은 CellTiter-Glo 3D 분석이 AOPI 분석 전에 IC50에 도달하고 거의 완전히 0에 도달했다는 것입니다. 이 결과는 다우노루비신의 작용 기전으로 설명할 수 있습니다. 다우노루비신(Daunorubicin)은 토포이소머라아제-II 억제제(topoisomerase-II inhibitor)로, 이중 가닥 DNA 절단을 유도하여 세포주기 정지를 유도하고 결국 세포사멸을 유도한다14. 세포주기 정지 동안, ATP 고갈이 발생할 수 있다15. CellTiter-Glo 3D 분석이 발광 신호를 생성하기 위한 ATP-루시페라아제 반응을 기반으로 한다는 점을 감안할 때, 더 높은 농도의 다우노루비신에서 세포 생존율이 더 크게 감소한 것은 완전한 세포 사멸이 아닌 ATP 고갈 때문이라는 가설을 세웠습니다. 이 아이디어를 뒷받침하는 그림 6A 의 이미지는 녹색 형광으로 표시된 배양에서 PDO가 살아 있는 집단을 보여줍니다.
그림 1: 도금, 이미징 및 분석 프로토콜의 개요. PDO는 96웰 플레이트에 도금되고 형광 염료 및 약물로 처리됩니다. 실험을 위한 이미징 매개변수(예: 노출, Z-스택)는 Gen5 소프트웨어에서 생성됩니다. 이미지는 Cytation 5에 의해 수집되고 Gen5에서 처리되며 추가 분석을 위해 데이터가 내보내집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 세포 분석 기능 개요. 1: 플러그 지정: 플러그는 관심 영역을 포함하도록 지정됩니다. 2: 기본 마스크 설정: 기본 마스크는 선택한 채널의 크기와 픽셀 강도에 따라 관심 있는 개체를 정의합니다. 이 대표 이미지에서는 기본 마스크에 포함된 오브젝트의 윤곽선이 보라색으로 표시되어 있습니다. 3: 하위 모집단 정의: 분석을 위해 원하는 모집단을 더 구체화하기 위해 추가 하위 모집단을 정의할 수 있습니다. 예제 이미지의 하위 모집단(노란색 윤곽선)은 원형도(>0.25)와 면적(>800)을 기준으로 정의됩니다. 이미지는 4x 대물렌즈로 획득되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 세포 분석 기능을 사용한 하위 모집단 마스킹의 예. 부분모집단은 명시야 채널에서 정의됩니다. 예제 이미지의 하위 모집단(노란색 윤곽선)은 원형도(>0.25)와 면적(>800)을 기준으로 정의됩니다. 이미지는 4X 대물렌즈로 획득되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 스타우로스포린 처리는 세포사멸 및 세포 독성의 용량 의존적 증가를 초래합니다. GFP 및 TRITC 형광 오버레이를 사용한 명시야 이미지(4x 대물렌즈)는 3개의 시점(0시간, 54시간, 114시간)에서 500nM, 10nM 및 0.1nM 용량의 스타우로스포린에 대해 표시됩니다. 적색 형광 신호는 세포 사멸(아넥신 V)을 나타내고 녹색 형광 신호는 세포 독성(Cytotox)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: PDO 반응을 평가하기 위한 Multiplexed fluorescent live-cell imaging (멀티플렉싱 형광 라이브 셀 이미징). PDO 모델 ONC-10817을 96웰 플레이트에 도금하고 37°C에서 하룻밤 동안 Annexin V Red(1:400) 및 Cytotox Green(200nM) 염료로 배양했습니다. 다음 날, PDO는 스타우로스포린의 농도를 증가시켜 처리하고 ~5일 동안 6시간마다 이미지를 촬영했습니다. (ᅡ,ᄂ) 스타우로스포린에 대한 반응으로 (A) 세포 독성 또는 (B) 세포 사멸의 시간 및 용량 의존적 증가. 데이터는 GFP 또는 TRITC 채널에서 Object Mean Intensity로 표시되었습니다. (C) 100nM 또는 500nM 스타우로스포린에 대한 반응에서 세포사멸 및 세포독성의 시간 경과 비교. 데이터는 GFP 및 TRITC 채널에서 Object Mean Intensity 값으로 표시되었습니다. (D) 스타우로스포린은 PDO의 성장을 억제한다. 데이터는 평균 총 PDO 영역으로 표시되었습니다. A-D의 데이터는 각 웰에서 시간 0시간에 PDO 번호로 정규화되고 평균의 평균 및 표준 오차(SEM)로 표시되었습니다. 처리당 N=5개의 기술 반복실험. p < 0.0001 vs. 2-way ANOVA에 의한 차량 제어. (E) 실험 종료 시점(114시간)에 500nM 스타우로스포린 처리된 PDOS와 비히클의 대표적인 명시야, GFP 및 TRITC 이미지. 이미지는 4x 대물렌즈로 획득되었습니다. (F) 114시간 시점에서 세포 독성, 세포 사멸 및 생존력의 정량화. GFP 물체 평균 강도(왼쪽)와 TRITC 물체 평균 강도(가운데)는 패널 A-C의 결과를 사용하여 114시간 시점에서 계산되었습니다. 생존력(오른쪽)은 제조업체의 프로토콜에 따라 CellTiter-Glo 3D 시약을 사용하여 평가되었습니다. 원시 발광(RLU) 값은 시간 0h에서 총 PDO 영역으로 정규화되고 1.0으로 설정된 차량 제어에 대한 접힘 생존 가능성으로 표시되었습니다. ** p<0.01, ***p<0.001, **** p<0.0001 vs. Dunnett의 사후 테스트를 사용한 일원 분산 분석을 통한 차량 제어. N = 처리당 5회의 기술 반복실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 종말점 분석 데이터의 정규화를 지원하기 위한 라이브 셀 이미징 사용. PDO는 토포이소머라아제-II 억제제인 다우노루비신(daunorubicin)의 농도를 증가시켜 7일 동안 처리하였다. PDO를 AOPI 염색액에 노출시키고 보충 파일 1에 설명된 대로 이미징했습니다. AO = acridine orange, 생존 가능성의 척도 (GFP 채널); PI = propidium iodide, 세포 사멸 측정 (텍사스 레드 채널). (A) 10μM 다우노루비신 또는 비히클 대조군(0.1% DMSO)으로 처리 7일 후 AOPI 염색을 사용하여 획득한 대표 이미지. (B) AOPI 형광을 종말점 생존율/세포 사멸 방법으로 사용한 다양한 판독. 분석 방법에 대한 자세한 설명은 보충 파일 1 을 참조하십시오. 왼쪽 상단, AO 염색에 의해 결정된 7일 후의 PDO 생존력 분석. 오른쪽 상단, PI 염색에 의한 세포 사멸 분석. AO 및 PI 염색에 대한 데이터를 시간 0시간에 PDO 번호로 정규화한 다음 차량 제어로 정규화하여 1.0으로 설정하고 평균 및 표준 편차로 표시했습니다. 왼쪽 아래, AO 및 PI 염색에 대한 평균 물체 적분을 사용한 생존 가능 대 사멸 비율 계산. 오른쪽 아래, AO 염색에 의해 결정된 PDO 영역. 세포 분석은 GFP 채널에서 수행되었습니다. (C) PDO 실행 가능성을 테스트하기 위한 두 가지 방법의 비교. 이미징 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 CellTiter-Glo 3D 시약을 사용하여 생존도를 평가했습니다. 차량 제어에 대한 접힘 생존은 다우노루비신의 농도가 증가할 때 표시되었습니다. 데이터는 처리당 N = 6회의 기술 반복실험에 대한 평균 및 표준 편차를 나타냅니다. 데이터가 패널 C에서 시간 0시간으로 정규화되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 치료 | # 우물 수 | 미디어 볼륨 | 아넥신 | 100μM 사이토톡스 | ||
| 희석 | 음량 | 희석 | 음량 | |||
| 멀티플렉스 | 60 | 6.6 mL | 1:400 | 16.5 μL | 200 nM의 | 13.2 μL |
표 1: 멀티플렉싱 실험의 예. Annexin V Red는 자가사멸 세포막의 외부 엽단에 노출된 포스파티딜 세린과 결합합니다. 사이토톡스 그린(Cytotox Green)은 막 무결성이 손상된 세포에 통합되어 DNA와 결합합니다.
보충 그림 1: ONC-10811의 다중 라이브 셀 이미징. PDO를 96웰 플레이트에 도말하고, 37°C에서 하룻밤 동안 Annexin V Red(1:400) 및 Cytotox Green(200nM) 염료에서 배양했습니다. 다음 날, PDO는 점점 더 높은 농도의 스타우로스포린으로 처리되었으며 5일 동안 6시간마다 이미징되었습니다. (A) 스타우로스포린에 대한 반응으로 세포독성의 시간 및 용량 의존적 증가. 데이터는 GFP 채널에서 Object Mean Intensity로 표시되었습니다. (B) 114시간에서 스타우로스포린의 용량-반응. 데이터는 114시간 시점에서 GFP 채널의 Object Mean Intensity 값으로 표시되었습니다. (C) 스타우로스포린에 대한 반응으로 세포사멸의 시간 및 용량 의존적 증가. 데이터는 TRITC 채널에서 Object Mean Intensity로 표시되었습니다. (D) 114시간에서 스타우로스포린의 용량-반응. 데이터는 114시간 시점에서 TRITC 채널의 객체 평균 강도 값으로 표시되었습니다. A 및 C의 데이터는 웰 레벨에서 시간 0시간에 PDO 번호로 정규화되었습니다. N = 각 모형에서 처리당 5회의 기술 반복실험. p < 0.0001 vs. 2-way ANOVA에 의한 차량 제어. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: Annexin V 및 Cytotox를 사용한 치료는 PDO 생존력을 교란하지 않습니다. PDO를 96웰 플레이트에 도말하고, 37°C에서 하룻밤 동안 Annexin V Red(1:400) 및 Cytotox Green(200nM) 염료로 배양했습니다. 24시간 배양 후 제조업체의 프로토콜에 따라 CellTiter-Glo 3D 분석을 사용하여 생존력을 평가했습니다. (A) 24시간 시점에서 염료 처리 및 미처리 PDO의 생존력. RLU(Relative Light Unit) 값과 PDO 합계 영역으로 정규화된 값이 모두 표시됩니다. 구체적으로, 각 웰에 대한 CellTiter-Glo3D RLU는 도금 시(즉, 염료 첨가 직후) 해당 웰에 대한 PDO 영역의 합으로 정규화되었습니다. 총 PDO 면적은 세포 분석에서 "Object Sum Area" 계산을 사용하여 결정되었습니다. N = 10입니다. (B) 114시간 시점에서 염료 처리 및 미처리 PDO의 생존력. 원시 발광 값과 전체 PDO 영역으로 정규화된 값이 모두 표시됩니다. 각 웰에 대한 CellTiter-Glo3D RLU는 도금 후 24시간에 PDO 영역의 합계로 정규화되었으며, 이는 키네틱 이미징 실험에서 시간 0h에 해당합니다. N = 5입니다. A와 B의 유의성은 짝을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 평가되었습니다. p 값이 그래프에 나열됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 디지털 위상차를 사용한 PDO의 무표지 분석. 이 그림에는 보충 파일 1: Gen5 소프트웨어의 단일 초점면 분석(명시야/디지털 위상차 이미지) 및 디지털 위상차 이미지 분석에 대한 이미징 파라미터 설정에 설명된 대로 무표지 분석을 보여주는 대표 이미지(2.5x 대물렌즈)가 포함되어 있습니다. (A) 단일 초점면에서 전립선암 PDXO 모델의 명시야 이미지 예. (B) A의 명시야 이미지가 디지털 위상차 이미지로 변환되었습니다. 명시야 이미지의 어두운 물체는 디지털 위상차 이미지에서 밝게 나타나고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. (C) 디지털 위상차 이미지를 이용한 PDO 마스킹의 예. 관심 있는 물체의 가장자리는 명시야 이미지에 비해 훨씬 더 명확해집니다. 이 대표 이미지에서는 기본 마스크의 오브젝트가 노란색 윤곽선으로 표시되어 있습니다. (C)의 하위 모집단(분홍색으로 표시선)은 원형도(>0.3), 면적(>1000), 평균[Dig.Ph.Con] > 2000, StdDev[Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500 및 Peak[Dig.Ph.Con] > 12500을 기준으로 정의됩니다. 이 대표 그림에 사용된 매개변수는 그림 6 의 데이터에 적용되어 0일째의 셀 수로 정규화되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: PDO 모델은 형태 및 도금 일관성이 다를 수 있습니다. 상부 패널: BME 돔에서 PDO의 차등 분산의 예. 하단 패널: 원반형 PDO와 원형 PDO의 대표 이미지. 모든 이미지는 EVOS 현미경으로 획득되었습니다. 배율이 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 5: 형광 정량화를 위해 세포 분석 vs. 이미지 통계를 사용한 예제 이미지. 사용자는 세포 분석을 사용하여 이미지 내에서 특정 집단을 정의하고 해당 영역의 형광을 측정할 수 있습니다. Image Statistics는 배경 신호를 배제하는 임계값을 정의하여 이미지의 형광을 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이미지 통계 사용의 제한 사항에 대해서는 토론을 참조하십시오. 이미지는 4배 배율입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 오가노이드 배양 배지 성분. 시약은 부인과 암 PDO 배양에 최적화되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 1: 6시간마다 획득한 이미지를 사용한 500nM 스타우로스포린 치료의 타임랩스 비디오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 2: 6시간마다 획득한 이미지를 사용한 100nM 스타우로스포린 치료의 타임랩스 비디오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 3: 6시간마다 획득한 이미지를 사용한 10nM 스타우로스포린 처리의 타임랩스 비디오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 4: 6시간마다 획득한 이미지를 사용한 1nM 스타우로스포린 치료의 타임랩스 비디오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
PDO 배양은 세포 반응과 거동을 반영할 수 있는 능력으로 인해 체외 모델 시스템에서 점점 더 인기를 얻고 있다2. PDO 생성, 배양 및 확장 기술에서 상당한 발전이 이루어졌지만 치료 반응을 분석하는 방법은 뒤처져 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 3D 생존도 키트는 용해 종말점 분석으로, 잠재적으로 가치 있는 역학 반응 데이터를 놓치고 다른 방법에 의한 후속 분석을 제한한다8. 새로운 연구에서는 PDO 모델에서 약물 반응을 평가하기 위해 라이브 셀 이미징을 적용하고 있습니다. 여기에서는 다중 형광 생세포 이미징을 활용하여 시간 경과에 따른 PDO 치료 반응을 평가하는 방법을 제시합니다. 형광 염료를 다중화하면 서로 다른 세포 반응을 동시에 정량화할 수 있습니다. 세포사멸 및 세포독성 외에도 이 접근법은 PDO의 다른 표현형 효과를 조사하기 위해 향후 연구에서 확장될 수 있을 것으로 예상합니다.
여기에 제시된 프로토콜은 96웰 플레이트에서 돔으로 도금된 PDO의 동역학적 명시야 및 형광 이미지를 획득하도록 설계되었습니다. 주요 단계에는 1) 도금, 2) 염료 및 약물 처리, 3) 이미징 파라미터 정의, 4) 키네틱 이미지 획득 완료 시 이미지 전처리 및 분석, 5) 다른 통계 소프트웨어에서 분석을 위한 데이터 내보내기가 포함됩니다(그림 1). 원형(intact) PDO는 BME와 오가노이드 배양 배지(Organoid Culture Media)의 사전 정의된 비율(일반적으로 1:1)로 구성된 5μL BME 돔으로 96웰 플레이트에 도금됩니다. 여기에 제시된 프로토콜은 배치 간 변동성이 최소화되고 이미징을 위한 우수한 광학 특성으로 인해 UltiMatrix를 BME로 사용합니다. Matrigel과 같은 다른 BME에서 배양된 PDO 수확을 위한 수정뿐만 아니라 덩어리가 많고 해리하기 어려운 모델에 대한 수정이 필요할 수 있습니다( 예제 보충 그림 4 참조). 다음으로, 형광 염료를 100μL 부피의 2배 농도로 도금 시(-1일)에 오가노이드 배양 배지에 첨가하고 밤새 배양하여 기준선 세포 사멸을 결정합니다. 다음 날(0일)에 약물 또는 기타 처리제를 100μL 용량의 2배 농도로 오가노이드 배양 배지에 첨가한 다음 각 웰에 추가하여 최종 부피 200μL를 만듭니다. 200μL의 최종 부피는 이미징으로 메니스커스 효과를 줄입니다. Kinetic 이미지는 BioSpa 탁상용 인큐베이터와 함께 Cytation 5 플레이트 리더를 사용하여 획득합니다. BioSpa 인큐베이터는 37°C의 고정 온도 및 5%CO2 환경에서 실험용 플레이트를 배양할 수 있습니다. BioSpa에는 최대 8개의 플레이트를 보관할 수 있으며, 이를 통해 8개의 실험을 동시에 수행할 수 있습니다. 각 플레이트에 대한 이미징 매개변수는 "Imager Manual Mode"를 사용하여 Gen5 소프트웨어에서 설정되고 프로토콜로 저장됩니다. 그런 다음 프로토콜이 스케줄링 소프트웨어(BioSpa OnDemand)에 로드됩니다. BioSpa OnDemand 소프트웨어는 BioSpa 인큐베이터에서 Cytation 5로 플레이트를 물리적으로 옮기고 데이터 수집을 위해 Gen5에서 실행할 프로토콜을 지시하는 등 키네틱 이미지 획득을 위한 워크플로우를 자동화합니다. 이미지는 Gen5 소프트웨어의 세포 분석 기능을 사용하여 분석됩니다(그림 2). 형광 및 명시야 이미지의 Z 투영을 분석하는 구체적인 방법을 설명합니다. 단일 Z 평면 및/또는 명시야 이미지만 분석하는 구체적인 방법은 보충 파일 1에 나와 있습니다. 마지막으로, 사용자는 PDO 면적, 개수 및 평균 형광 강도와 같은 특정 데이터 기능을 정의하여 약물 효과에 대한 후속 통계 분석을 위해 Excel 스프레드시트로 내보낼 수 있습니다.
PDO 모델이 약물 효과를 조사하는 비교적 새로운 모델 시스템이라는 점을 감안할 때, 배양 조건, 특히 BME의 증가를 수용하는 방법은 여전히 등장하고 있다16. 약물 치료에 대한 PDO 반응을 평가하는 대부분의 연구는 세포 건강을 위한 대리물로 ATP 기반 종말점 분석(CellTiter-Glo 3D)에 의존합니다. 이 방법은 세포 용해가 필요하므로 후속 다운스트림 분석이 필요하지 않습니다. 형광 염색, 단일 시점 이미징 및 형태학적 추적과 같은 대체 종말점 분석은 약물 반응을 특성화하는 동시에 추가 목적으로 샘플을 사용할 수 있는 다른 지표를 제공했습니다. 예를 들어, 약물 효과의 고처리량 분석을 위해 인플레이트(in-plate) 종말점 고정 프로토콜이 적용되었다17,18. 이 방법의 장점은 일반적인 면역조직화학 및 면역형광 이미징19에 필요한 광범위한 처리를 우회하고 PDO 모델의 경우와 같이 샘플이 제한될 때 특히 유용하다는 것입니다. 또한 컨포칼 현미경을 사용한 고해상도 이미징이 가능합니다. 세포 용해가 필요하지 않은 또 다른 종점 분석법은 propidium iodide 또는 acridine orange와 같은 시약을 사용한 살아있는 세포 이미징입니다. 세포 생존율 및 사멸 평가를 위해 세포 용해가 필요하지 않은 CellTiter-Glo 3D와 AOPI의 비교 분석(그림 6C)은 PDO 모델에서 살아있는 세포 이미징 염료를 사용할 때의 이점을 강조합니다. 이 방법은 실험 18,19,20의 결론에서 표현형 효과를 평가하기 위해 우리를 포함한 여러 그룹에 의해 적용되었습니다. 그러나 인웰 고정(in-well fixation) 또는 종말점 라이브 셀 이미징 방법을 사용한 키네틱 데이터 수집에는 상당한 샘플이 필요합니다. 시간 경과에 따른 PDO의 무표지 형태학적 평가는 부분적으로 이러한 한계를 극복하고 광범위한 이미징 양식(8,10,17,18)을 사용하여 평가할 수 있지만, 형태학의 변화는 세포사멸 및 세포 생존율의 변화와 같은 잠재적인 약물 효과의 스펙트럼을 대표하지 않을 수 있습니다. 우리는 약물에 대한 반응의 형태학적 변화에서 상당한 모델 간 가변성을 관찰했습니다. 예를 들어, 일부 PDO는 세포 사멸을 겪으면서 면적이 증가하는 반면 다른 모델은 줄어들 수 있습니다. Kinetic morphologic assessments는 제한된 수의 연구에서 고정 또는 살아있는 세포 형광 종점 분석으로 다중화되었습니다18,20. 여기에 제시된 분석법은 고처리량 시스템에서 여러 세포 효과를 동시에 평가하기 위해 다양한 형광 염료를 다중화한 최초의 방법 중 하나입니다.
kinetic live-cell 이미징이 제공하는 가장 큰 개선 사항 중 하나는 종말점 분석과 관련된 주요 한계를 극복한다는 것입니다. 예를 들어, 웰당 동일한 수의 PDO를 도금하는 것은 기술적으로 어려운데, 대부분의 자동화된 셀 카운터는 60μm보다 작은 물체에 대해 게이트(gated)되기 때문입니다. 살아있는 세포 이미징을 통해 각 웰에서 시간 0시간에 PDO 수 또는 면적을 정규화할 수 있으며, 이를 사용하여 웰 간 도금 변화를 조정할 수 있습니다. PDO에 대한 최적 표준 종점 분석은 세포 생존율에 대한 대리물로 ATP를 측정하는 CellTiter-Glo 3D 키트입니다. 우리는 부인과 및 전립선암 PDO 13,21,22,23,24의 연구에서 이 분석을 광범위하게 사용했습니다. ATP 측정을 위해 세포 용해가 필요할 뿐만 아니라 약물 및 기타 치료 방식은 ATP 수치를 변화시켜 잠재적으로 치료 반응에 대한 부정확한 평가를 제공할 수 있습니다. 살아있는 세포 이미징 염료를 활용하면 세포 사멸 및 세포 독성과 같은 특정 세포 반응의 더 넓은 범위를 정량화할 수 있습니다. 중요한 것은 이러한 시약이 프로피듐 요오드화물의 경우와 같이 세포 생존력을 교란하거나 DNA 손상을 유도하지 않는다는 것입니다. 이를 통해 시간 경과에 따른 PDO 응답을 반복적으로 평가할 수 있습니다. 우리는 운동 측정을 위한 아크리딘 오렌지(AO)의 사용을 탐구하지 않았지만, AO에 대한 작용 메커니즘은 향후 그러한 적용을 배제해서는 안 됩니다.
종양은 다양한 게놈 프로필과 형태를 가진 여러 개의 별개의 세포 집단으로 구성됩니다. PDO 모델의 복잡한 이질성으로 인해 개별 PDO 응답은 다를 수 있으며 이러한 응답을 추적하는 것은 어렵습니다. 당사의 프로토콜은 웰 단위로 여러 PDO 응답 메트릭을 평가하는 방법을 제공합니다. 그러나 특정 기술적 고려 사항은 여전히 살아있는 세포 이미징에 적용됩니다. 96웰 플레이트를 시드하는 데 필요한 24웰 플레이트의 웰 수는 각 PDO 모델의 밀도와 성장률에 따라 달라집니다. 응집은 이미지 분석을 혼란스럽게 할 수 있기 때문에(보충 그림 4) PDO 모델은 도금 전에 추가 처리 단계가 필요할 수 있습니다. 필요한 경우, PDO는 넓지 않은 보어 p200 팁을 사용한 격렬한 피펫팅을 통해 가공 중에 기계적으로 전단될 수 있습니다. TrypLE Express를 사용한 효소 분해는 PDO 해리를 촉진하고 응집을 줄이기 위해 도금 전에 사용할 수도 있습니다. 경험에 비추어 볼 때, TrypLE 배양 기간은 모델에 따라 매우 다양합니다. 따라서 TrypLE 배양은 특히 연구자가 단일 세포 현탁액을 얻고자 하는 경우 각 모델에 맞게 최적화되어야 합니다. 효소 분해에 특히 민감한 PDO 모델의 경우 치료를 시작하기 전의 회복 시간이 필요할 수 있습니다.
특정 live-cell imaging 시약에 대한 방법을 제시합니다. 본원에 제시된 방법의 광범위한 적용 가능성에 있어서의 한계는 BME와 상용성이 있는 시약의 부족이다. PDO에 사용하도록 아직 최적화되지 않은 다른 염료/시약의 경우 최적의 농도를 결정하고 용매 효과를 최소화하기 위해 추가 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 관심 판독값(예: 세포사멸 또는 세포독성)에 따라 시약 조건을 최적화하기 위해 스타우로스포린 또는 다우노루비신13 과 같이 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려진 화합물을 사용한 처리를 사용해야 합니다. 추가 고려 사항은 염료를 BME 돔에 통합하기 위한 최적의 시간입니다. 실험에서는 염료를 돔에 완전히 흡수하고 기본 세포 건강을 결정하기 위해 처리 전에 하룻밤 배양을 수행합니다. 신호 강도는 시간이 지남에 따라 증가하기 때문에 연구원은 과다 노출 이미지를 피하기 위해 실험이 끝날 때 이상적인 노출 시간을 결정하기 위해 염료로 파일럿 연구를 수행해야 합니다. 마지막으로, 시약은 세포 과정을 방해해서는 안 됩니다. 예를 들어, DNA에 삽입되는 염료는 키네틱 이미징과 호환되지 않습니다. 그러나 라이브 셀 이미징은 종말점 분석에서 데이터 정규화에 사용할 수 있습니다. 실제로, 우리는 AOPI를 사용하여 세포 생존율과 생존 가능: 죽은 세포 비율을 정량화하는 보충 방법을 제시합니다. 이 실험에서 형광 신호는 0일째(치료일, 그림 6)에 살아있는 세포 이미징에 의해 결정되고 각 웰에 대한 PDO 번호로 정규화됩니다.
이 방법 논문의 또 다른 한계는 실험을 위해 수동 피펫팅에 의존한다는 것인데, 이는 기술 반복에서 더 큰 편차를 초래할 수 있습니다. 데이터 재현성의 추가적인 개선은 다른 사람들에 의해 입증된 바와 같이, 도금 및 약물 분배를 위한 자동화된 액체 핸들러의 사용과 같은 실험 공정의 다른 단계에 자동화를 추가함으로써 달성될 수 있다 8,10. 그러나 이러한 추가에는 모든 연구자가 사용할 수 없는 연구 인프라에 대한 추가 투자가 필요합니다. 각 모델에 대한 PDO 영역의 이질성을 감안할 때 시간 0h에서 초기 PDO 번호 또는 영역으로 결과를 정규화하는 것은 자동화된 시드를 사용하는 여전히 유용한 접근 방식입니다.
다른 살아있는 세포 이미징 플랫폼에 비해 Cytation 5의 주요 장점은 이미지 및 분석 기능을 맞춤화할 수 있다는 것입니다. 그러나 Cytation 5/Gen5 소프트웨어는 학습 곡선이 가파르며 사용자가 이미징에 대한 기초 지식을 가지고 있다고 가정합니다. 이 방법 논문의 목표 중 하나는 다른 연구자들이 PDO 연구 프로그램에 정교한 라이브 셀 이미징 기술을 통합하는 장벽을 줄이기 위한 단계별 지침을 제공하는 것입니다. 여기에 제시된 특정 분석 단계는 하나의 시스템에 대한 것이지만 사용자는 다운스트림 분석을 위해 NIH ImageJ와 같은 타사 소프트웨어를 사용해야 할 수 있다는 점을 이해하고 멀티플렉싱 원칙을 다른 플랫폼에 적용할 수 있습니다.
분석 지표는 실험 목표와 도금 조건을 모두 기준으로 선택해야 합니다. 예를 들어, 세포 사멸을 정량화하기 위해 형광 염료를 사용하여 실험을 수행하는 경우 형광 강도가 효과적인 판독 방법입니다. 가장 효과적인 형광 메트릭(Total Fluorescence vs. Object Mean Intensity)은 도금 조건에 따라 달라집니다(보충 그림 4). PDO가 고르게 분산되어 있고 더 원형적이고 응집력 있는 형태를 갖는 경우 정의된 PDO 부분집단에서 형광을 측정할 수 있습니다. Gen5 소프트웨어의 특정 기능은 Cellular Analysis이며 출력은 Object Mean Intensity입니다. 그러나 PDO 모델이 덩어리져 있거나 원반형 형태가 있는 경우 이미지 수준에서 형광 신호를 정량화하는 것이 좋습니다. 이 기능은 Image Statistics(이미지 통계)에서 찾을 수 있으며 출력은 Total Fluorescence Intensity(총 형광 강도)입니다. 이 방법은 개별 웰 레벨에서 변화를 관찰하는 데 유용하지만, 이 지표는 관심 객체에만 국한되지 않으며 실험 기간 동안 PDO가 지정된 플러그 밖으로 이동할 경우 잘못 변경될 수 있습니다. 상당한 파편이나 죽은 단일 세포가 있는 시나리오에서는 PDO와 특별히 관련되지 않은 형광 신호를 차단하기 위해 세포 분석을 사용하는 것이 좋습니다. 세포 분석과 이미지 통계를 사용한 차등 결과의 예는 보충 그림 5에 나와 있습니다.
이미지 통계 기능에 대한 최적의 임계값을 결정하기 위해 라인 도구를 사용할 수 있습니다. 라인 도구를 사용하여 사용자는 이미지 내의 형광 강도 범위를 결정할 수 있습니다. 하한 임계값을 이미지 내 피크 강도의 25% 값으로 설정합니다. 지정된 임계값에 포함된 형광 영역을 보려면 "Threshold Outliers" 상자를 선택합니다. 더 낮은 임계값의 추가 미세 조정이 필요할 수 있습니다.
살아있는 세포 이미징의 중요한 과제는 각 실험에서 생성된 방대한 양의 데이터를 저장하는 것입니다. 이는 Z-Stack을 사용하여 여러 초점면에 걸쳐 이미지를 생성하고 Z 투영을 생성하는 PDO 문화의 경우 특히 관련이 있습니다. 이 문제를 극복하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 첫째, 적절한 저장 용량을 확보하십시오. 총 17TB의 솔리드 스테이트 하드 드라이브 3개를 설치했습니다. 다른 옵션으로는 실험용 파일을 외장 하드 드라이브 또는 네트워크 스토리지로 전송하는 것이 있습니다. 클라우드 기반 스토리지에 파일을 직접 쓰는 것은 권장되지 않습니다. 외장 드라이브에 저장된 데이터를 분석하려면 실험 및 이미지 파일을 Gen5 소프트웨어가 장착된 컴퓨터로 전송하기만 하면 됩니다(참고: 대용량 파일은 전송하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있음). 분석하기 전에 이미지를 실험에 다시 연결해야 합니다. 실험 파일을 열고, 도구 모음에서 프로토콜을 클릭하고, 프로토콜 옵션을 선택합니다. 이미지 저장 옵션(Image Save Options)을 클릭하고 새 이미지 폴더 선택(Select new image folder)을 클릭합니다. 이미지 파일을 찾아 다시 연결할 폴더 선택을 클릭합니다.
실험의 목표에 따라 Gen5 내에서 범주화 기능을 사용하는 것이 적합할 수도 있습니다. 범주화는 픽셀 수를 줄여 파일 크기를 줄여 이미지 해상도를 낮춥니다(3.5.3.2단계 참조). 따라서 고해상도 이미지가 필요한 경우 범주화하지 않는 것이 좋습니다. 비닝 기능을 사용할 때 노출 설정을 조정해야 합니다. 실험 파일이 생성되면 이미지 섹션을 두 번 클릭하고 현미경 아이콘을 클릭하여 Imager Manual Mode를 다시 엽니다. 자동 노출 기능을 사용하거나 필요에 따라 노출을 수동으로 조정합니다.
요약하면, 세포독성 물질에 반응하여 PDO의 세포 사멸 및 세포 건강을 평가하는 방법을 제시합니다. 향후 연구는 방법을 최적화하고 세포독성이 아닌 세포증식 억제 약물의 다른 표현형 및 효과와 같은 PDO의 키네틱 이미징을 위한 추가 분석 전략을 개발하는 데 필요합니다. 주요 장애물은 BME와 호환되는 염료 및 시약의 상업적 가용성입니다. 이러한 모델에서 가장 많은 데이터를 추출하기 위해 kinetic live-cell 이미징을 최대한 활용할 수 있는 방법을 더 잘 이해하려면 아직 더 많은 작업이 필요합니다.
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Disclosures
KWT는 Immortagen Inc.의 공동 소유주이며, CJD는 애질런트의 직원입니다. JSdB는 Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo 및 Vertex Pharmaceuticals로부터 자문 위원회에서 활동하며 수수료를 받았습니다. AZ, 아스텔라스, 바이엘, 셀센트릭, 다이이치, 제넨테크, 젠맙, GSK, 얀센, 머크 세로노, MSD, 메나리니/실리콘 바이오시스템즈, 오리온, 사노피 아벤티스, 시에라 온콜로지, 타이호, 화이자, 버텍스로부터 연구 연구에 대한 자금 지원 또는 기타 지원을 받은 암 연구소(ICR)의 직원이며, DNA 복구 결함 암에서 아비라테론, PARP 억제에 상업적 관심을 가지고 있습니다. 및 PI3K/AKT 경로 억제제(개인 소득 없음); 코르티코스테로이드와 함께 아비라테론 아세테이트의 사용을 다루는 Janssen이 제출한 특허 8 822 438에 대한 재정적 이해관계가 없는 발명자로 지명되었습니다. 많은 업계 후원 임상 시험의 CI/PI였습니다. 미국 국립보건연구소(NIHR) 선임 연구원입니다. 다른 저자는 공개할 잠재적인 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
환자 종양 표본을 제공해준 아이오와 대학의 조직 조달 코어(Tissue Procurement Core)와 크리스틴 콜먼(Kristen Coleman) 박사, PDO 모델 생성에 도움을 준 산부인과의 소피아 가브릴로비치(Sofia Gabrilovich) 박사에게 감사드립니다. 또한 원고를 비판적으로 분석해 주신 Valerie Salvatico 박사(미국 애질런트)에게도 감사드립니다. 우리는 다음과 같은 자금 출처를 인정합니다 : NIH / NCI CA263783 및 DOD CDMRP CA220729P1 KWT로; 영국 암 연구(Cancer Research UK), 영국 전립선암 협회(Prostate Cancer UK), 전립선암 재단(Prostate Cancer Foundation) 및 의학 연구 위원회(Medical Research Council)에서 JSdB로 이동합니다. 연구비 지원자들은 실험의 설계나 분석, 출판 결정에 아무런 역할도 하지 않았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrfuge tube | Dot Scientific Inc | 1008113 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.100 | |
| 554 NM LED Cube | Agilent | 1225012 | |
| 96-well plate | Corning Costar | 3596 | Prewarmed to 37 °C |
| 96-well plate | Agilent | 204626-100 | Prewarmed to 37 °C |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media) |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634-010 | component of organoid culture media |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Final concentration is 1x (component of organoid culture media) |
| BioTek BioSpa 8 Automated Incubator | Agilent | BIOSPAG-SN | Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10) |
| BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader | Agilent | CYT5PW-SN | Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08) |
| Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Systems | BME001-10 | |
| Daunorubicin HCl | Sigma-Aldrich | S3035 | Reconstituted in DMSO |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Fisher | AM9260G | |
| Forskolin | Tocris | 1099 | Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media) |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Final concentration is 1x (component of organoid culture media) |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media) |
| Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein | Gibco | AF-100-15-1MG | Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Human FGF-10 Recombinant Protein | Gibco | 100-26-1MG | Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Human R-Spondin 1 Recombinant Protein | Gibco | 120-38-5UG | Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technologies | 7926 | Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Imaging Filter Cube- GFP | Agilent | 1225101 | |
| Imaging Filter Cube- TRITC | Agilent | 1225125 | |
| Imaging LED GFP/CFP | Agilent | 1225001 | |
| Incucyte Annexin V Red Dye | Sartorius | 4641 | Reconstituted in organoid culture media |
| Incucyte Cytotox Green Dye | Sartorius | 4633 | DMSO solution |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media) |
| Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution | Fisher-Scientific | 13366169 | Add 1:50 volume |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media) |
| Noggin | R&D Systems | 6057-NG | Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media) |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-05 | Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media) |
| Recombinant Human Heregulinβ-1 | Pepro Tech | 100-03 | Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Staurosporine solution from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | S6942 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604013 | |
| Y-27632, CAS 331752-47-7 | Sigma-Aldrich | 688000 | Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media) |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media) |
References
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