Multiplexerad avbildning av levande celler för läkemedelssvar i patienthärledda organoidmodeller av cancer

Summary

Tumörorganoider som härstammar från patienter är ett sofistikerat modellsystem för grundforskning och translationell forskning. Denna metodartikel beskriver användningen av multiplexerad fluorescerande levande cellavbildning för samtidig kinetisk bedömning av olika organoidfenotyper.

Abstract

Patient-derived organoid (PDO) modeller av cancer är ett multifunktionellt forskningssystem som bättre rekapitulerar mänskliga sjukdomar jämfört med cancercellinjer. PDO-modeller kan genereras genom att odla patienttumörceller i extracellulära basalmembranextrakt (BME) och plätera dem som tredimensionella kupoler. Kommersiellt tillgängliga reagenser som har optimerats för fenotypiska analyser i enskiktskulturer är dock ofta inte kompatibla med BME. Här beskriver vi en metod för att plåta PDO-modeller och bedöma läkemedelseffekter med hjälp av ett automatiserat system för avbildning av levande celler. Dessutom applicerar vi fluorescerande färgämnen som är kompatibla med kinetiska mätningar för att kvantifiera cellhälsa och apoptos samtidigt. Bildtagning kan anpassas så att den sker med jämna tidsintervall under flera dagar. Användare kan analysera läkemedelseffekter i enskilda Z-plansbilder eller en Z-projektion av seriella bilder från flera fokalplan. Med hjälp av maskering beräknas specifika parametrar av intresse, såsom SUB-nummer, area och fluorescensintensitet. Vi tillhandahåller proof-of-concept-data som visar effekten av cytotoxiska medel på cellhälsa, apoptos och livskraft. Denna automatiserade kinetiska bildplattform kan utökas till andra fenotypiska avläsningar för att förstå olika terapeutiska effekter i PDO-modeller av cancer.

Introduction

Patient-deriverade tumörorganoider (PDO) växer snabbt fram som ett robust modellsystem för att studera cancerutveckling och terapeutiska svar. SUB är tredimensionella (3D) cellodlingssystem som rekapitulerar den komplexa genomiska profilen och arkitekturen hos den primära tumören ^1,2. Till skillnad från traditionella tvådimensionella (2D) kulturer av odödliga cancercellinjer, fångar och upprätthåller PDO:er intratumoral heterogenitet ^3,4, vilket gör dem till ett värdefullt verktyg för både mekanistisk och translationell forskning. Även om SUB blir ett allt populärare modellsystem är kommersiellt tillgängliga reagenser och analysmetoder för cellulära effekter som är kompatibla med PDO-kulturer begränsade.

Bristen på robusta metoder för att analysera subtila förändringar i behandlingssvar hindrar klinisk översättning. Guldstandarden för cellhälsa i 3D-kulturer, CellTiter-Glo 3D, använder ATP-nivåer som en determinant för cellviabilitet ^5,6. Även om detta reagens är användbart för endpoint-analyser, finns det flera varningar, framför allt oförmågan att använda prover för andra ändamål efter avslutad analys.

Avbildning av levande celler är en sofistikerad form av kinetisk mikroskopi som, i kombination med fluorescerande reagenser, har kapacitet att kvantifiera en mängd olika cellhälsoavläsningar inom PDO-modeller, inklusive apoptos ^7,8,9 och cytotoxicitet¹⁰. Faktum är att avbildning av levande celler har varit en integrerad del av screening av föreningar med hög genomströmning i 2D-plattformar^11,12. System som Incucyte har gjort tekniken överkomlig och därmed tillgänglig för forskargrupper i en mängd olika miljöer. Tillämpningen av dessa system för att analysera 3D-kulturer är dock fortfarande i sin linda.

Här beskriver vi en metod för att bedöma läkemedelsrespons i PDO-modeller av cancer med hjälp av multiplexad avbildning av levande celler (Figur 1). Genom analys av ljusfältsbilder kan förändringar i SUB-storlek och morfologi övervakas kinetiskt. Dessutom kan cellulära processer samtidigt kvantifieras över tid med hjälp av fluorescerande reagenser, såsom Annexin V Red Dye för apoptos och Cytotox Green Dye för cytotoxicitet. Metoderna som presenteras är optimerade för Cytation 5 live-cell imaging system, men detta protokoll kan anpassas över olika live-cell imaging plattformar.

Protocol

Studier med humana tumörprover granskades och godkändes av University of Iowa Institutional Review Board (IRB), protokoll #201809807, och utfördes i enlighet med de etiska normer som fastställdes i 1964 års Helsingforsdeklaration och dess senare ändringar. Informerat samtycke inhämtades från alla försökspersoner som deltog i studien. Inklusionskriterier inkluderar en diagnos av cancer och tillgången på tumörprover.

1. Plätering av intakta skyddade ursprungsbeteckningar i en platta med 96 brunnar

1. Förbered reagenser.
   1. Förvärm 96-brunnars plattor vid 37 °C över natten och tina BME över natten vid 4 °C.
   2. Förbered fullständiga organoidodlingsmedier som är optimerade för att odla cancertypen av intresse. Specifika odlingssubstrat som används för de experiment som visas här finns i tilläggstabell 1.
      OBS: Mediakomponenter kan behöva modifieras för olika tumörtyper. Till exempel kompletteras organoidodlingsmediet med 100 nM östradiol för gynekologiska tumörer¹³. Förberedda medier är stabila vid 4 °C i 1 månad. För långtidsförvaring, fördela mediet i 50 ml rör och förvara vid -20 °C.
2. Bered två separata alikvoter av organoidodlingssubstrat vid 4 °C och 37 °C. Till exempelample, om 60 brunnar pläteras i en 96-hålsplatta, använd 6 ml varmt organoidodlingsmedium och 150 μL iskallt organoidodlingsmedium.
3. Förbered organoid tvättbuffert: Komplettera 1x PBS med 10 mM HEPES, 1x Glutamax, 5 mM EDTA och 10 μM Y-27632. Förvaras vid 4 °C
4. Skörda SUB odlade i en platta med 24 brunnar. Utför alla steg på is eller vid 4 °C om inget annat anges.
   1. Aspirera media från varje brunn med hjälp av ett vakuumledningssystem.
   2. Tillsätt 500 μL iskall organoidtvättbuffert och pipettera försiktigt 2-3 gånger med en 1000 μL pipett. Inkubera plattan på is i 10 min.
   3. Överför innehållet i varje brunn till ett 50 ml koniskt rör. För att säkerställa att alla skyddade ursprungsbeteckningar är suspenderade, skölj varje brunn med ytterligare 300 μl organoidtvättbuffert och överför till det 50 ml koniska röret. Centrifugera i 5 minuter vid 350 x g vid 4 °C
   4. Aspirera supernatanten från BME/organoidpelleten med hjälp av ett vakuumledningssystem, lämna ~ 5 ml kvar i röret. Tillsätt 20 ml organoid tvättbuffert och återsuspendera försiktigt pelleten med en 10 ml serologisk pipett. Inkubera på is i 10 min.
   5. Centrifugera i 5 minuter vid 350 x g vid 4 °C. Aspirera supernatanten med ett vakuumledningssystem, var noga med att inte störa PDO-pelleten.
5. Plätering av skyddade ursprungsbeteckningar i en platta med 96 brunnar: Utför alla steg på is om inget annat anges.
   1. Återsuspendera SUB-pelleten i en lämplig mängd iskallt organoidodlingsmedium för att skapa en SUB-suspension. Överför PDO-suspensionen till ett iskallt 1.5 ml mikrocentrifugrör.
      OBS: För att beräkna mängden organoidodlingsmedia, bestäm antalet brunnar som ska pläteras i en 96-hålsplatta, med hänsyn till att SUB är pläterade i en 5 μL kupol i förhållandet 1:1 mellan organoidodlingsmedia och BME. Till exempel, vid plätering av en 96-brunnars platta och endast de inre 60 brunnarna, kommer den totala mängden PDO-suspension som behövs att vara 300 μL: 150 μL organoidodlingssubstrat och 150 μL BME. För modeller som uppvisar optimal tillväxt vid olika procentandelar av BME kan förhållandet mellan BME: media modifieras i detta steg, även om det är viktigt att standardisera förhållandet för alla analyser för varje specifik modell. Om du vill ta hänsyn till pipetteringsfel lägger du till 10 % volym till varje komponent.
   2. Räkna antalet skyddade ursprungsbeteckningar.
      1. Överför 2,5 μl av SUB-suspensionen till ett iskallt 1,5 ml mikrocentrifugrör och blanda med 2,5 μl BME. Överför 5 μL-blandningen till ett rent glasobjektglas. Täck inte över rutschkanan. Blandningen kommer att stelna till en kupol.
      2. Visualisera med hjälp av ett ljusfältsmikroskop vid 4x. Räkna antalet skyddade ursprungsbeteckningar i 5 μL-blandningen. Målet är att ha ungefär 25-50 SUB per 5 μL kupol.
         ANMÄRKNING: Om den önskade densiteten inte uppnås i testblandningen, justera den slutliga volymen av SUB-suspensionen antingen genom att tillsätta mer organoidodlingssub eller centrifugera SUB-suspensionen och återsuspendera SUB-pelleten i en lägre volym iskallt organoidodlingsmedium. Oavsett hur PDO-suspensionen modifieras i detta steg, är det slutliga förhållandet mellan BME: PDO-suspension i steg 1.5.3. bör vara 1:1.
   3. Använd en 200 μL pipettor med breda borrspetsar och blanda försiktigt PDO-suspensionen med lika mycket BME för att uppnå ett 1:1-förhållande mellan organoidodlingsmedia och BME. Undvik bubblor som stör kupolernas integritet.
   4. Använd en 20 μL pipettor och så 5 μL kupoler i mitten av varje brunn på en förvärmd 96-brunnsplatta, så endast de inre 60 brunnarna. För att säkerställa en jämn fördelning av de skyddade ursprungsobjekten ska du regelbundet pipettera innehållet i 1,5 ml-röret med en 200 μL pipett med breda spetsar.
   5. När alla brunnar har såtts, lägg locket på plattan och vänd försiktigt upp. Inkubera den uppochnedvända plattan vid 37 °C i 20 minuter i vävnadsinkubatorn så att kupolerna stelnar.
      OBS: Invertering av plattan säkerställer att BME/organoidodlingsmediekupolen behåller 3D-strukturen för att ge tillräckligt med utrymme för PDO-bildning.
   6. Vänd plattan så att den sitter med locket uppåt och inkubera i 5 min vid 37 °C.

2. Behandlingar och tillsats av fluorescerande färgämnen för multiplexering

1. Medan BME-kupolerna stelnar i 96-brunnsplattorna, förbereder utspädningar av fluorescerande reagenser för avbildning av levande celler. Specifika parametrar för multiplexering av Annexin V Red Dye och Cytotox Green Dye anges här.
2. Beredning av fluorescerande reagens (dag -1): Beräkna lämplig volym organoidodlingssubstrat baserat på antalet brunnar som ska behandlas, med antagande att varje brunn kommer att behandlas med 100 μl färgämnesdoserat medium. Späd färgämnet i förvärmda organoidodlingsmedier till önskad koncentration.
   OBS: Den totala mängden media som behövs varierar beroende på experimentet. Lägg till 10 % till den slutliga volymen för att ta hänsyn till pipetteringsfel. Till exempelample, för att behandla de inre 60 brunnarna på en 96-hålsplatta, förbered 6.6 ml färgdoserat media (tabell 1).
3. Behandla varje brunn med 100 μL 2x färgämnesdoserat organoidodlingsmedium. Tillsätt 200 μL steril 1x PBS till plattans yttre tomma brunnar. Inkubera vid 37 °C över natten.
   OBS: PBS i de perifera brunnarna minskar avdunstningen av media från de inre brunnarna.
4. Tillsats av läkemedel/behandlingsmedel (dag 0): Bered läkemedel i förvärmda organoidodlingsmedier vid en 2x koncentration i en volym av 100 μL per brunn.
   OBS: DMSO kan vara giftigt för celler vid höga koncentrationer. En koncentration på 0,1 % DMSO överskrids inte i de experiment som utförs i denna studie. Förutom läkemedel distribueras vissa fluorescerande reagenser som en DMSO-lösning. Det är viktigt att ta hänsyn till den totala DMSO-koncentrationen när man arbetar med sådana reagenser.
5. Tillsätt 100 μL 2x färgämnesdoserat medium till varje brunn; Undvik att skapa bubblor.

3. Ställa in bildparametrar

1. Placera plattan i Cytation 5. Öppna Gen5-programvara. Klicka på Ny aktivitet > manuellt läge för bildåtergivning. Välj Fånga nu och ange följande inställningar: Mål (välj önskad förstoring); Filter (välj mikroplatta); Mikroplattformat (välj antal brunnar); och Kärltyp (välj plåttyp). Klicka på Använd lock och Använd långsammare bärarhastighet. Klicka på OK.
   OBS: Kärltyp: Var så specifik som möjligt när du väljer information om plattan eftersom programvaran är kalibrerad till det specifika avståndet från objektivet till plattans botten för varje platttyp och tjocklek på plasten.
   Långsammare bärarhastighet: Välj den här rutan för att undvika att kupolerna störs vid lastning/lossning av plåtar.
2. Skapa en Z-Stack som avbildar hela BME-kupolen.
   1. Välj en brunn av intresse att visa (vänster panel, under histogrammet).
   2. Välj Bright Field-kanalen (vänster panel, överst). Klicka på Exponera automatiskt och justera inställningarna efter behov.
   3. Ställ in nederkanten och toppen av Z-stacken: Expandera fliken Bildläge (vänster panel, mitten). Markera rutan Z-Stack . Använd kursjusteringspilarna (vänster panel, mitten) och klicka på nedjusteringen tills alla PDO:er har kommit in och sedan ur fokus och är suddiga. Ställ in detta som botten av Z-stacken. Upprepa i motsatt riktning med hjälp av kursjusteringspilarna för att ställa in toppen av Z-stacken.
   4. För att säkerställa att Z-Stack-inställningarna är lämpliga för andra brunnar av intresse, välj en annan brunn (vänster panel, under histogrammet) och visualisera toppen och botten av Z-stacken.
   5. För att manuellt ange fokuspositionerna, klicka på de tre prickarna bredvid finjusteringen (vänster panel, överst). Ett fönster öppnas; skriv in det översta Z-Stack-värdet (finns i den vänstra panelen, i mitten, under Bildläge). Upprepa för det nedersta Z-Stack-värdet. Justera efter behov för att fånga önskat Z-intervall genom att upprepa steg 3.2.3. Om justeringar var nödvändiga, välj en annan brunn för att verifiera inställningarna.
3. Ställ in exponeringsinställningarna för lysrörskanalen/lysrörskanalerna. Inställningarna beskrivs för två lysrörskanaler (GFP och TRITC). Det specifika antalet fluorescerande kanaler beror på experimentet och vilka fluorescerande kuber som är installerade i avbildningssystemet för levande celler.
   OBS: Om signalintensiteten förväntas vara betydligt högre i slutet av experimentet, bör användare överväga att utföra testexperiment för att bestämma de optimala exponeringsinställningarna i slutet av experimentet som sedan kan tillämpas när de initiala parametrarna ställs in.
   1. Expandera fliken Bildläge (vänster panel, mitten) och öppna Redigera bildsteg. Ett popup-fönster visas.
   2. Under Kanaler klickar du på bubblan för önskat antal kanaler. Ange en kanal för ljusfält och ytterligare kanaler för varje lysrörskanal. I det här exemplet är kanal 1 = ljust fält; Kanal 2 = GFP; Kanal 3 = TRITC. Använd rullgardinsmenyn Färg för att välja lämplig inställning för varje kanal. Stäng redigeringsfönstret genom att klicka på OK.
   3. Ställ in varje fluorescerande kanal.
      1. Byt kanal till GFP (vänster panel, överst).
      2. Klicka på Exponera automatiskt (vänster panel, överst). Expandera fliken Exponering (vänster panel, mitten) och justera exponeringsinställningarna för att minimera bakgrundssignalen.
      3. Kopiera exponeringsinställningarna till fliken Bildläge genom att följa steg 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. Klicka på ikonen Kopiera bredvid rutan Redigera bildsteg . Klicka på Redigera bildsteg så öppnas ett annat fönster.
      5. Under GFP-kanalen klickar du på Urklipp ikonen i raden Exponering för att lägga till inställningarna Belysning, Integrationstid och Kameraförstärkning till kanalen.
      6. Upprepa steg 3.3.3.4-3.3.3.5 för TRITC-kanalen. Klicka på OK för att stänga fönstret.
4. Ställ in bildförbehandlings- och Z-projektionsstegen för att automatisera bildförbehandling.
   1. Klicka på kameraikonen (vänster panel, nedre hörnet). Ett nytt fönster öppnas.
   2. Under Lägg till bearbetningssteg (vänster panel, nederst), klicka på Bildförbehandling. Ett nytt fönster öppnas.
   3. På fliken Ljust fält avmarkerar du Använd bildförbehandling.
   4. För varje flik för fluorescerande kanal ser du till att Använd bildförbehandling är markerat. Avmarkera Använd samma alternativ som kanal 1 och klicka på OK. Fönstret stängs.
   5. Under Lägg till bearbetningssteg klickar du på Z-projektion. Ett nytt fönster öppnas. Om så önskas kan du justera segmentintervallet (t.ex. för att minska Z-intervallet). Stäng fönstret genom att välja OK.
5. Skapa protokoll.
   1. Klicka på Bilduppsättning i verktygsfältet. I listrutan klickar du på Skapa experiment från den här bilduppsättningen. Bildfönstret stängs och procedurfönstret öppnas.
      OBS: Parametrarna som valts i Imager Manual Mode kommer automatiskt att laddas in i det nya fönstret, varigenom ett experimentellt protokoll kan skapas.
   2. Ställ in temperatur och gradient: Klicka på Ställ in temperatur under rubriken Åtgärder (vänster). Ett nytt fönster öppnas. Välj Inkubator På och ange önskad temperatur manuellt under Temperatur. Ange sedan 1 manuellt under Övertoning. Stäng fönstret genom att välja OK.
      OBS: Att skapa en lutning på 1 °C förhindrar att kondens bildas på plattans lock.
   3. Utse brunnar till bilden.
      1. Dubbelklicka på bildsteget under Beskrivning. Klicka på Full plåt (höger hörn, överst). Detta öppnar fönstret Plåtlayout .
      2. Markera brunnar av intresse med hjälp av markören. Klicka på OK. Om så önskas, markera rutorna Autofocus Binning och Capture Binning . Klicka på OK för att stänga fönstret.
         OBS: Gruppering kräver exponeringsjustering, som beskrivs i steg 3.3.3.2 ovan. Se avsnittet Diskussion för specifika scenarier där den här funktionen kan användas.
   4. Ställ in intervall för kinetisk avbildning.
      1. Klicka på Alternativ under rubriken Övrigt (vänster). Markera rutan Discontinuous Kinetic Procedure .
      2. Under Beräknad total tid anger du körningstiden för experimentet (t.ex. 5 dagar). Under Uppskattat intervall anger du intervallet för att avbilda plattan (t.ex. var 6:e timme).
      3. Klicka på Pausa efter varje körning för att ge plattan tid att överföras till inkubatorn. Stäng fönstret genom att välja OK.
   5. Uppdatera stegen för datareduktion.
      1. Klicka på OK för att stänga procedurfönstret. En flik öppnas för att uppdatera dataminskningsstegen. Välj Ja. Dubbelklicka på Bildförbehandling. Klicka dig igenom de olika kanalerna för att verifiera inställningarna och klicka på OK.
      2. Dubbelklicka på Z-projektion. Klicka dig igenom de olika kanalerna för att verifiera inställningarna. Klicka på OK. Klicka sedan på OK igen för att stänga fönstret Datareducering.
   6. Formatera plåtlayouten.
      1. Öppna guiden Plåtlayout och ange brunnstyper enligt steg 3.6.2-3.6.3.
      2. Klicka på ikonen Plåtlayout i verktygsfältet (vänster hörn, överst) för att öppna guiden Plåtlayout.
      3. Markera rutorna bredvid de brunnstyper som används i experimentet. Under Analyskontroller anger du antalet olika kontrolltyper med hjälp av pilarna. Klicka på Nästa för att öppna fönstret Assay Control #1 .
      4. Ställ in villkoren för analyskontrollbrunnen enligt steg 3.6.5-3.6.8.
      5. I fönstret Analyskontroll #1 anger du kontrolletiketten i rutan Plåtlayout-ID . Om du vill kan du ange det fullständiga namnet i rutan bredvid. Välj antalet replikat för respektive kontrollvillkor med hjälp av pilarna.
      6. Om du använder flera koncentrationer eller en utspädningsserie i styrsystemet klickar du på Definiera utspädningar/koncentrationer och använder rullgardinsmenyn för att välja Typ. Ange värden för varje koncentration/utspädning i tabellen.
         OBS: Autofunktionen kan användas om koncentrationerna ändras med en konsekvent ökning.
      7. Välj fliken Färg i verktygsfältet. Välj önskad textfärg och bakgrundsfärg för kontroll i rullgardinsmenyn. Klicka på Nästa.
      8. Upprepa vid behov med ytterligare kontroller.
      9. Ställ in provbrunnsförhållanden enligt 3.6.10-3.6.12.
      10. På sidan Exempelkonfiguration anger du exempel-ID-prefixet (t.ex. SPL). Välj antalet replikat med hjälp av pilarna. Om du använder prover med varierande behandlingskoncentrationer, välj Koncentrationer eller Spädningar i rullgardinsmenyn Typ . Ange utspädningar/koncentrationer i tabellen och ange enheter i rutan Enhet .
      11. Välj Identifieringsfält i verktygsfältet. Ange önskat kategorinamn (t.ex . prov-ID, läkemedel) i tabellen.
      12. Välj fliken Färg i verktygsfältet. Välj en annan färg för varje behandlingsgrupp/prov. Klicka på Slutför. Då öppnas sidan Plåtlayout.
          OBS: Siffrorna på vänster sida korrelerar med de olika samplingsnumren.
      13. Tilldela exempel-ID:t enligt steg 3.6.14-3.6.16.
      14. Utvald SPL1 från den vänstra panelen. Använd markören för att välja brunnar.
          OBS: Autoselect-verktyg kan justeras i den seriella tilldelningsrutan. Antalet replikat och layoutens orientering kan bestämmas i förväg.
      15. Upprepa med andra prover för att slutföra plattans layout. När du är nöjd klickar du på OK.
      16. I verktygsfältet Arkiv väljer du Exempel-ID:t. Fyll i kolumnerna Prov-ID med lämplig information för varje prov (t.ex. läkemedelstyp). Tryck på OK.
   7. Spara protokollet.
      1. I verktygsfältet klickar du på Arkiv > Spara protokoll som. Välj den plats där du vill spara filen. Ange ett filnamn. Klicka på Spara för att stänga fönstret.
      2. Klicka på Arkiv > Avsluta i verktygsfältet. En flik öppnas för att spara ändringar i Imager Manual Mode. Välj Nej.
      3. En flik öppnas där du kan spara ändringarna i Experiment 1. Välj Nej. En flik öppnas för att uppdatera protokolldefinitionen. Välj Uppdatera. Stäng programvaran.
6. Importera protokollet till BioSpa OnDemand och slutför installationen av experimentet.
   1. Öppna programvaran BioSpa OnDemand (schemaläggningsprogram).
   2. Välj en ledig plats i programvaran.
   3. Ta bort plattan från avbildningssystemet för levande celler. Klicka på Öppna låda för att komma åt lämplig plats i schemaläggningsprogrammet och sätt in plattan. Klicka på Stäng lådan.
      OBS: Detta steg kan utföras när som helst när protokollet har skapats i steg 3.5.7 ovan. Plattan måste dock vara i Cytation 5 för att utföra en tidtagningskörning i nedanstående steg 3.6.4.3.
   4. Importera protokollet.
      1. Under fliken Procedurinformation väljer du Användare i den nedrullningsbara menyn. Bredvid protokollplatsen klickar du på Välj > Lägg till en ny post.
      2. Bredvid protokollplatsen klickar du på Välj. Detta öppnar ett nytt fönster för att navigera till önskat protokoll i filarkitekturen. Klicka på Öppna för att importera protokollet till schemaläggningsprogrammet.
      3. Ange hur lång tid som behövs för att avbilda plåten. Klicka på OK för att stänga fönstret Gen5-protokolllista .
         Det här steget är särskilt viktigt när du kör flera experiment samtidigt. Om du vill ta reda på hur lång tid det tar att avbilda klickar du på Utför en tidskörning nu. Klicka på OK.
   5. Ställ in bildintervall och schemalägg experimentet.
      1. Under Intervall anger du det bildintervall som anges i steg 3.5.4.
      2. Under Alternativ för starttid väljer du När det är tillgängligt. Under Varaktighet väljer du Fast eller Kontinuerlig.
         OBS: En specifik starttid kan anges istället för att köra protokollet vid nästa tillgängliga tidpunkt. Om du väljer Fast varaktighet anges en specifik slutpunkt för experimentet och användaren måste ange en tidsram för experimentet. Kontinuerlig varaktighet gör att experimentet kan köras utan slutpunkt och kan bara avslutas av en användare som stoppar experimentet.
      3. Klicka på Schemaplåt/kärl. Detta öppnar plåtvalideringssekvensen. En flik öppnas med den föreslagna första lästiden. Klicka på Ja för att acceptera det här schemat.

4. Bildanalys i Gen5-programvara (bild 2)

1. Öppna modulen Bildanalys.
   1. Öppna Gen5. I Aktivitetshanteraren väljer du Experiment > Öppna. Välj experimentet för att öppna filen. Klicka på Platta > vy i verktygsfältet.
   2. Ändra rullgardinsmenyn Data till Z-projektion. Dubbelklicka på en brunn av intresse. Välj Analysera > jag vill ställa in ett nytt datareduktionssteg för bildanalys. Klicka på OK.
2. Cellulär analys
   1. Primär mask
      1. Under Analysinställningar väljer du Typ: Cellulär analys- och detekteringskanal: ZProj[Tsf[Bright Field]] (vänster panel, mitten).
      2. Klicka på Alternativ. Då öppnas sidan Primärmask och antal . I rutan Tröskelvärde markerar du Auto och klickar på Använd. Klicka på rutan Markera objekt (höger panel, nederst) för att visa objekt inom det angivna tröskelvärdet. Justera efter behov för att inkludera objekt av intresse.
         Tröskelvärdena baseras på pixelintensiteten. Om tröskelvärdet till exempel är inställt på 5000 inkluderas pixlar med en intensitet som är större än 5000 i analysen.
      3. Under Objektval anger du den minsta och största objektstorleken (μm). Justera vid behov för att utesluta cellulärt skräp/enstaka celler.
         OBS: PDO-storleken kan variera avsevärt mellan olika modeller och typer. Använd mätverktyget i Gen5-programvaran för att fastställa tröskelvärdena för minsta och högsta PDO-storlek för varje modell. Användarna kan välja ett lägre tröskelvärde för minsta SUB-storlek i förhållande till det värde som mätverktyget ger för att förhindra att fragment av den skyddade ursprungsbeteckningen utesluts vid senare tidpunkter efter läkemedelsbehandling.
      4. Om du vill begränsa analysen till ett visst område i brunnen avmarkerar du Analysera hela bilden och klickar på Plugin. I fönstret Bildplugg använder du den nedrullningsbara menyn för att välja Pluggform . Justera storleks- och positionsparametrarna efter behov för att passa intresseområdet.
         OBS: Det är viktigt att maximera antalet SUB-enheter i kontakten samtidigt som du utesluter SUB-fria områden för att minimera bakgrunden. Ange en kontaktstorlek som konsekvent samlar in majoriteten av objekten av intresse i replikaten. Att generera en plugg som också utesluter kupolens kanter är viktigt eftersom det utesluter alla föremål som kan verka förvrängda på grund av ljusets brytning från kupolens extrema krökning runt kanterna. Inkludera primära kantobjekt kan också avmarkeras för att endast fånga hela SUB:er i kontaktdonet.
   2. Analys av delpopulationer. Ett exempel på hur en delpopulation kan betecknas finns i figur 3.
      1. Klicka på Beräknade värden i verktygsfältet Cellulär analys. Klicka på Välj eller skapa måttenheter på objektnivå av intresse (höger hörn, nederst). Under Tillgängliga objektmått väljer du mått av intresse (t.ex. cirkularitet) och klickar på knappen Infoga. Klicka på OK.
         OBS: Morfologin och densiteten för varje PDO-modell avgör de bästa mätvärdena av intresse för att särskilja delpopulationen.
      2. Klicka på Subpopulationsanalys i verktygsfältet Cellulär analys . Klicka på Lägg till för att skapa en ny delpopulation. Ett popup-fönster öppnas.
      3. Om du vill kan du ange ett namn för delpopulationen. Under Objektmått väljer du ett mått av intresse och trycker på Lägg till villkor. I fönstret Redigera villkor anger du parametrar för den valda objektmåttenheten. Upprepa med ytterligare mätvärden efter behov.
         OBS: Parametrar kan justeras manuellt eller ställas in med sökverktyget. Om du till exempel vill utesluta skräp kan användare lägga till Area som ett objektmått och välja objekt som är mindre än 800. Cirkularitet som objektmått används rutinmässigt, och alla objekt med en cirkularitet större än 0,2-0,5 ingår, beroende på modell.
      4. I tabellen längst ned i fönstret markerar du de önskade resultaten som ska visas. Klicka på OK > Verkställ.
      5. Om du vill visa objekten i delpopulationen använder du listrutan Objektinformation (höger panel, mitten) för att välja delpopulationen. Objekt som faller inom parametrarna kommer att markeras i bilden.
         Om du vill ändra markeringsfärgerna för den primära masken och underpopulationen klickar du på Inställningar (höger panel, nederst).
      6. Om du vill justera parametrarna för delpopulationen öppnar du fönstret Delpopulationsanalys igen i verktygsfältet Cellanalys . Markera delpopulationen och klicka på Redigera. Klicka på Lägg till steg.
         OBS: Detta kommer att tillämpa samma analys på alla brunnar inom experimentet vid alla tidpunkter. I rullgardinsmenyn på Matrix-sidan kan olika mätvärden väljas för individuell visning.

5. Exportera data från Gen5 till Excel

1. Om du vill anpassa en datafil för export väljer du ikonen Rapport-/exportverktyg i verktygsfältet. I popup-fönstret klickar du på Ny export till Excel.
2. På sidan Egenskaper i popup-fönstret väljer du Omfattning > plåt och innehåll > anpassad. Klicka på alternativet Innehåll i verktygsfältet. Klicka på Redigera mall, så öppnas Excel-programmet.
3. I kalkylbladet väljer du Tillägg > Tabell > brunnsdata. Håll muspekaren över de olika valen för att se alternativ för export. Välj mått av intresse (t.ex. Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
   Du kan lägga till plattlayouten i kalkylbladsanalysmallen genom att välja Tillägg > Protokollsammanfattning > layout.
4. Ett redigeringsfönster öppnas. I rutan Wells anger du brunnarna för export antingen med Well-ID eller Well #. Välj OK. En mall kommer att laddas in i kalkylbladsfilen. Stäng kalkylarket. Mallen sparas automatiskt.
5. Klicka på OK i fönstret Ny export till Excel och stäng fönstret Rapport-/exportverktyg .
6. Klicka på ikonen Exportera i verktygsfältet Gen5. Markera rutan bredvid önskad exportfil. Klicka på OK. Gen5 fyller automatiskt i kalkylbladsmallen och öppnar filen i Excel.

6. Extern dataanalys

1. Öppna Exportera fil (.xlsx) i Excel.
2. För varje brunn dividerar du varje enskilt värde med tidspunktsvärdet 0:00 för den brunnen. Detta kommer att ställa in tidspunkt 0 lika med 1, och varje värde utöver det kommer att vara relativt till den första avläsningen.
3. Öppna en ny fil i dataanalysprogrammet. Välj layoutalternativet XY .
   OBS: I detta protokoll användes GraphPad Prism (version 9.5.1).
4. Indataetiketter för varje datagrupp. Kopiera och klistra in tidpunkterna och motsvarande normaliserade värden för varje behandlingsgrupp i Prism-tabellen. En graf för data genereras automatiskt och finns under Grafer.

Representative Results

Vårt mål var att demonstrera möjligheten att använda multiplexad avbildning av levande celler för att bedöma PDO-terapeutiskt svar. Proof of concept-experiment utfördes i två separata PDO-modeller av endometriecancer: ONC-10817 och ONC-10811 (se kompletterande figur 1 och kompletterande figur 2 för ONC-10811-data). Apoptos (annexin V-färgning) och cytotoxicitet (Cytotox Green-upptag) övervakades kinetiskt som svar på det apoptosinducerande medlet staurosporin. Specifikt pläterades SUB i 96-hålsplattor, behandlades med Annexin V Red och Cytotox Green-färgämnen och placerades i en 37 °C inkubator över natten som visas i figur 1. Vi bekräftade i två oberoende SUB-modeller att behandling med Annexin V och Cytotox Green-färgämnen inte är toxisk (tilläggsfigur 2). Följande dag behandlades SUB med ökande koncentrationer av staurosporin (0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 500 nM). Därefter upprättades protokoll i Gen5-programvaran och experimenten ställdes in för att köras under en period på 5 dagar och avbildas var 6:e timme. Data analyserades med hjälp av funktionen för cellulär analys i Gen5-programvaran enligt beskrivningen i avsnitt 4 i protokollet. Den primära masken ställdes in med hjälp av den automatiska tröskelfunktionen med "Dela beröringsobjekt" avmarkerat och med storleksparametrar på minimum: 30 μm och maximalt: 1000 μm. Delpopulationen av den skyddade ursprungsbeteckningen definierades av cirkularitet > 0,25. Objektmedelintensiteterna i TRITC (annexin V, apoptos) och GFP-kanalerna (Cytotox Green, cytotoxicitet) inom den angivna subpopulationen av SUB exporterades som en .xlsx fil för vidare analys. Objektets medelintensitet för varje brunn vid varje tidpunkt i både GFP- och TRITC-kanalerna normaliserades till tid 0. Normaliserade fluorescensdata överfördes sedan till en Prism-fil och visualiserades som ett linjediagram.

Behandling med staurosporin resulterade i en signifikant, dosberoende ökning av apoptos och en minskning av cellhälsan över tid jämfört med vehikelkontroll, vilket framgår av ökningen av objektmedelintensiteten i både TRITC-kanalerna (annexin V) och GFP (Cytotox) (figur 4, figur 5, kompletterande video 1, kompletterande video 2, kompletterande video 3, Kompletterande video 4, Kompletterande video 5, Kompletterande video 6 och Kompletterande video 7). Doserna 500 nM, 100 nM och 10 nM staurosporin resulterade var och en i en statistiskt signifikant ökning av både apoptos och cytotoxicitet över tid (Figur 5A-C) samt i slutet av experimentet (Figur 5E,F). Dessutom hämmade staurosporin effektivt tillväxt och bildning av SUB vid dessa koncentrationer, vilket visades av en total minskning av den totala SUB-arealen, medan kontrollbrunnarna uppvisade en ökning av den totala SUB-arean (figur 4 och figur 5D).

Eftersom en stor fördel med avbildning av levande celler är möjligheten att korrigera för variabilitet i plätering, utförde vi ett experiment där cellviabilitet bedömdes som ett effektmått. Proof-of-concept-effektanalysdata samlades in med hjälp av en PDO-modell som genererades från ett patienthärlett xenograft av prostatacancer. Ljusfältsbilder samlades in i början av behandlingsperioden (dag 0), följt av tillsats av ett dubbelt färgreagens som mäter både viabilitet (akridinorange, AO) och celldöd (propidiumjodid, PI). AO-komponenten avger en grön fluorescerande signal vid bindning till dubbelsträngat DNA, en indikator på cellviabilitet. PI-komponenten färgar döda kärnförsedda celler och kan användas för att kvantifiera celldöd som svar på behandling. För att ta hänsyn till variabilitet i PDO-plätering utarbetade vi en metod för att bestämma antalet SUB:er per brunn vid tidpunkt 0 genom att konvertera ljusfältsbilder till bilder med digital faskontrast (kompletterande figur 3 och tilläggsfil 1).

Prostatacancer PDO behandlades med daunorubicin, ett kemoterapimedel som orsakar celldöd, i 7 dagar. Efter avslutat experiment färgades proverna med AOPI enligt beskrivningen i tilläggsfil 1, följt av analys av fluorescerande bilder i Gen5. Figur 6A visar en panel med bilder från AOPI-slutpunktsanalysen dag 7. Vid jämförelse av vehikelbehandlade SUB (rad ett) med SUB behandlade med 10 μM daunorubicin (rad två) sågs en tydlig minskning av grön fluorescens (viabilitetsmått, kolumn två) och en ökning av röd fluorescens (mått på celldöd, kolumn tre). Dessa resultat kvantifierades sedan i figur 6B, där vi visar den rad avläsningar som kan uppnås med hjälp av AOPI-slutpunktsfärgningstekniken. Det övre vänstra diagrammet visar lönsamhetsmätningen som genererats från AO-fläcken, normaliserad till PDO-antalet som bestäms av bildanalys med digital faskontrast för varje brunn på dag 0. Dessa data korrelerar med det visuella resultatet från figur 6A, där viabiliteten minskade drastiskt när koncentrationen av daunorubicin ökade. Detta rekapituleras ytterligare i den övre högra grafen, som visar en ökning av celldöd som betecknas av en ökning av röd fluorescens som förvärvats med PI-färgen.

PI-data kombinerades sedan med viabilitetsavläsningen (AO) för att beräkna ett livskraftigt förhållande till dött förhållande (figur 6B, nedre vänstra diagrammet). Detta förhållande är ett användbart tillvägagångssätt för att avgöra om ett läkemedel är cytostatiskt eller cytotoxiskt. Specifikt kommer ett cytotoxiskt läkemedel att nå mycket närmare 0 än ett cytostatika på grund av det faktum att ett läkemedel som är cytostatika kommer att hämma tillväxt men kanske inte inducera celldöd. Slutligen kan arean av de skyddade ursprungsbeteckningarna beräknas exakt med hjälp av den gröna fluorescensen hos AO-färgen, även när de skyddade ursprungsbeteckningarna kan genomgå celldöd och blebbning. Det nedre högra diagrammet visar den genomsnittliga SUB-arealen, som beräknades som summan av det område som betecknades i delpopulationsanalysen dividerat med PSUB-numret. Analys av området kan ge ytterligare indikation på om en behandling helt enkelt hämmar PDO-tillväxt eller faktiskt orsakar PDO-regression. Observera att analysen av den genomsnittliga SUB-arean utfördes med hjälp av GFP-kanalen och cellulär analysfunktion, till skillnad från figur 5D, som använde ljusfältsbilderna för att beräkna den totala PDO-arean. Dessa data visar flexibiliteten i analyspipelinen beroende på datatillgänglighet och användarintresse.

Slutligen jämförde vi guldstandarden för viabilitetsavläsningar, CellTiter-Glo 3D, med viabilitetsfluorescensavläsningen med AOPI (Figur 6C). Observera att data i den här panelen inte normaliserades till PDO-numret för tid 0 eftersom den här normaliseringen vanligtvis inte utförs av laboratorier som använder CellTiter-Glo 3D-satsen. Vi observerade samma trend för läkemedelseffekt i båda analyserna, där PDO-viabiliteten minskade när daunorubicinkoncentrationen ökade. Den enda visuella skillnaden mellan dessa avläsningar var att CellTiter-Glo 3D-analysen nådde en IC50 före AOPI-analysen och nästan helt nådde 0. Detta resultat kan förklaras av daunorubicins verkningsmekanism. Daunorubicin är en topoisomeras-II-hämmare som introducerar dubbelsträngade DNA-brott, vilket leder till cellcykelstopp och så småningom apoptos¹⁴. Under cellcykelstopp kan ATP-utarmning inträffa¹⁵. Med tanke på att CellTiter-Glo 3D-analysen är baserad på en ATP-luciferasreaktion för att generera en luminiscenssignal, antar vi att den starkare minskningen av cellviabilitet vid högre koncentrationer av daunorubicin berodde på ATP-utarmning snarare än fullständig celldöd. Som stöd för denna idé visar bilderna i figur 6A en population som lever med skyddade ursprungsbeteckningar i kulturen, vilket betecknas med grön fluorescens.

Figur 1: Översikt över plätering, avbildning och analysprotokoll. SUB pläteras i en 96-hålars platta och behandlas med fluorescerande färgämnen och läkemedel. Bildparametrar för experimentet (t.ex. exponering, Z-stack) skapas i Gen5-programvaran. Bilder hämtas av Cytation 5 och bearbetas i Gen5, och data exporteras för vidare analys. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Översikt över funktionen Cellulär analys. 1: Utse kontakt: En kontakt är avsedd att innehålla intresseområden. 2: Ställ in primärmask: Den primära masken definierar objekt av intresse baserat på storlek och pixelintensitet i en valfri kanal. I den här representativa bilden har objekt som ingår i den primära masken en lila kontur. 3: Definiera delpopulation: En ytterligare delpopulation kan definieras för att ytterligare förfina den önskade populationen för analys. Delpopulationen i exempelbilden (markerad i gult) definieras baserat på cirkularitet (>0,25) och area (>800). Bilderna förvärvades med ett 4x-objektiv. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Exempel på maskering av delpopulationer med hjälp av funktionen Cellulär analys. Delpopulationer definieras i ljusfältskanalen. Delpopulationen i exempelbilderna (markerad i gult) definieras baserat på cirkularitet (>0,25) och area (>800). Bilderna togs med ett 4X-objektiv. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Staurosporinbehandling resulterar i en dosberoende ökning av apoptos och cytotoxicitet. Ljusfältsbilder (4x objektiv) med GFP- och TRITC-fluorescensöverlägg visas för doserna 500 nM, 10 nM och 0,1 nM staurosporin vid 3 tidpunkter: 0 timmar, 54 timmar, 114 timmar. Den röda fluorescerande signalen indikerar apoptos (annexin V) och den gröna fluorescerande signalen indikerar cytotoxicitet (Cytotox). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Multiplexerad fluorescerande avbildning av levande celler för att bedöma PDO-svar. PDO-modell ONC-10817 pläterades i 96-hålsplattor och inkuberades med färgämnena Annexin V Red (1:400) och Cytotox Green (200 nM) över natten vid 37 °C. Följande dag behandlades PDO:er med ökande koncentrationer av staurosporin och avbildades var 6:e timme i ~5 dagar. (A,B) Tids- och dosberoende ökning av (A) cytotoxicitet eller (B) apoptos som svar på staurosporin. Data plottades som objektets medelintensitet i GFP- eller TRITC-kanalen. C) Jämförelse av tidsförloppet för apoptos och cytotoxicitet som svar på 100 nM eller 500 nM staurosporin. Data plottades som värdena för objektmedelintensitet i GFP- och TRITC-kanalerna. D) Staurosporin hämmar tillväxten av skyddade ursprungsbeteckningar. Data plottades som den genomsnittliga totala SUB-arealen. Data i A-D normaliserades till SUB-nummer vid tiden 0 h i varje brunn och plottades som medelvärdet och standardfelet för medelvärdet (SEM). N = 5 tekniska replikat per behandling. p < 0,0001 jämfört med fordonskontroll med 2-vägs ANOVA. (E) Representativa ljusfälts-, GFP- och TRITC-bilder av 500 nM staurosporinbehandlade SUB jämfört med vehikel i slutet av experimentet (114 timmar). Bilderna förvärvades med ett 4x-objektiv. F) Kvantifiering av cytotoxicitet, apoptos och viabilitet vid 114 timmar. GFP Object Mean Intensity (vänster) och TRITC Object Mean Intensity (mitten) beräknades vid 114 timmars tidpunkt med hjälp av resultat från panelerna A-C. Viabiliteten (till höger) bedömdes med hjälp av CellTiter-Glo 3D-reagenset enligt tillverkarens protokoll. Råluminescensvärden (RLU) normaliserades till den totala SUB-arean vid tidpunkten 0 h och plottades som vikningsviabiliteten i förhållande till fordonskontrollen, som sattes till 1,0. ** p<0,01, ***p<0,001, **** p<0,0001 jämfört med fordonskontroll via envägs ANOVA med Dunnetts post-hoc-test. N = 5 tekniska replikat per behandling. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Användning av avbildning av levande celler för att underlätta normaliseringen av endpoint-analysdata. SUB behandlades med ökande koncentrationer av topoisomeras-II-hämmaren daunorubicin i 7 dagar. SUB exponerades för AOPI Staining Solution och avbildades enligt beskrivningen i kompletterande fil 1. AO = akridinorange, ett mått på livsduglighet (GFP-kanal); PI = propidiumjodid, ett mått på celldöd (Texas Red channel). (A) Representativa bilder tagna med AOPI-färgning efter 7 dagars behandling med 10 μM daunorubicin eller vehikelkontroll (0,1 % DMSO). (B) Olika avläsningar med AOPI-fluorescens som slutpunktsviabilitet/celldödsmetod. Se tilläggsfil 1 för en detaljerad beskrivning av analysmetoderna. Uppe till vänster, analys av SUB:s livskraft efter 7 dagar enligt AO-färgning. Uppe till höger, analys av celldöd genom PI-färgning. Data för AO- och PI-färgning normaliserades till SUB-nummer vid tiden 0 h och sedan till fordonskontroll, som sattes till 1,0, och plottades som medelvärde och standardavvikelse. Nere till vänster, beräkning av förhållandet mellan livskraftig och död med hjälp av de genomsnittliga objektintegralerna för AO- och PI-färgerna. Nederst till höger, område av SUB som bestäms av AO-färgning. Cellulär analys utfördes i GFP-kanalen. C) Jämförelse av två metoder för att testa den skyddade ursprungsbeteckningens livskraft. Efter avbildning utvärderades viabiliteten med hjälp av CellTiter-Glo 3D-reagenset enligt tillverkarens protokoll. Vecköverlevnaden i förhållande till vehikelkontroll plottades vid ökande koncentrationer av daunorubicin. Data representerar medelvärdet och standardavvikelsen för N = 6 tekniska replikat per behandling. data normaliserades inte till tid 0 h i panel C. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Behandling	# av brunnar	Mediavolym	Bilaga		100 μM Cytotox
			Utspädning	Volym	Utspädning	Volym
Multiplex	60	6,6 ml	1:400	16,5 μL	200 nM	13,2 μL

Tabell 1: Exempel på multiplexeringsexperiment. Annexin V Red binder exponerat fosfatidylserin på den yttre bipacksedeln i apoptotiska cellmembran. Cytotox Green integreras i celler med nedsatt membranintegritet och binder DNA.

Tilläggsfigur 1: Multiplexerad avbildning av levande celler av ONC-10811. SUB pläterades i 96-hålsplattor och inkuberades i färgämnena Annexin V Red (1:400) och Cytotox Green (200 nM) över natten vid 37 °C. Följande dag behandlades SUB med ökande koncentrationer av staurosporin och avbildades var 6:e timme i 5 dagar. A) Tids- och dosberoende ökning av cytotoxicitet som svar på staurosporin. Data plottades som objektets medelintensitet i GFP-kanalen. (B) Dos-respons för staurosporin vid 114 timmar. Data plottades som värdena för objektmedelintensitet i GFP-kanalen vid 114-timmarstidpunkten. (C) Tids- och dosberoende ökning av apoptos som svar på staurosporin. Data plottades som objektets medelintensitet i TRITC-kanalen. D) Dos-respons för staurosporin efter 114 timmar. Data plottades som objektmedelintensitetsvärden i TRITC-kanalen vid 114 timmars tidpunkt. Data i A och C normaliserades till SUB-nummer vid tidpunkten 0 h på brunnsnivå. N = 5 tekniska replikat per behandling i varje modell. p < 0,0001 jämfört med fordonskontroll med 2-vägs ANOVA. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfigur 2: Behandling med Annexin V och Cytotox stör inte den skyddade ursprungsbeteckningens livsduglighet. SUB pläterades i 96-hålsplattor och inkuberades med färgämnena Annexin V Red (1:400) och Cytotox Green (200 nM) över natten vid 37 °C. Efter den 24 timmar långa inkubationen bedömdes viabiliteten med hjälp av CellTiter-Glo 3D-analysen enligt tillverkarens protokoll. A) Livsduglighet i färgämnesbehandlade och obehandlade skyddade ursprungsbeteckningar inom 24 timmar. Både relativa ljusenhetsvärden (RLU) och värden normaliserade till SUB-summaarea presenteras. Specifikt normaliserades CellTiter-Glo3D RLU för varje brunn till summeringen av SUB-arean för den brunnen vid tidpunkten för plätering (dvs. omedelbart efter färgtillsats). Den totala PDO-arean bestämdes med hjälp av "Object Sum Area"-beräkningen i cellulär analys. N = 10. B) Livsduglighet i färgämnesbehandlade och obehandlade skyddade ursprungsbeteckningar vid 114 timmar. Både råa luminiscensvärden och värden normaliserade till den totala PDO-arean presenteras. CellTiter-Glo3D RLU för varje brunn normaliserades till summeringen av PDO-arean 24 timmar efter plätering, vilket motsvarar tiden 0 h i de kinetiska avbildningsexperimenten. N = 5. Signifikans i A och B bedömdes med hjälp av ett oparat t-test; p-värden listas i diagrammen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Etikettfri analys av SUB med hjälp av digital faskontrast. Den här figuren innehåller representativa bilder (2,5x objektiv) som visar etikettfri analys enligt beskrivningen i tilläggsfilen 1: Ställa in bildparametrar för en enda fokalplansanalys (ljusfälts-/digitala faskontrastbilder) och bildanalys med digital faskontrast i Gen5-programvaran. (A) Exempel på ljusfältsbild av en PDXO-modell för prostatacancer i ett enda fokalplan. (B) Den ljusa fältbilden i A konverterades till en digital faskontrastbild. Mörka objekt i den ljusa fältbilden ser ljusa ut i bilden med digital faskontrast och vice versa. C) Exempel på PDO-maskering med hjälp av den digitala faskontrastbilden. Observera att kanterna på objekt av intresse blir mycket mer definierade jämfört med de ljusa fältbilderna. I den här representativa bilden har objekt i den primära masken en gul kontur. Delpopulationen i (C) (markerad i rosa) definieras baserat på cirkularitet (>0,3), area (>1000), medelvärde [Dig.Ph.Con] > 2000, StdDev [Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500 och Peak [Dig.Ph.Con] > 12500. Parametrarna som används i denna representativa figur tillämpades på data i figur 6 för att normalisera till cellantal på dag 0. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: Modeller för skyddad ursprungsbeteckning kan variera i fråga om morfologi och pläteringskonsistens. Övre panel: Exempel på differentiell spridning av SUB i BME-kupolerna. Nedre panel: Representativa bilder av diskohesiva kontra cirkulära SUB. Alla bilder är tagna med ett EVOS-mikroskop. Förstoringar noteras. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfigur 5: Exempelbilder med cellulär analys kontra bildstatistik för kvantifiering av fluorescens. Med hjälp av cellulär analys kan användare definiera specifika populationer i en bild och mäta fluorescens i dessa regioner. Bildstatistik kan också användas för att mäta fluorescens i en bild genom att definiera ett tröskelvärde för att utesluta bakgrundssignaler. Se Diskussion om begränsningarna med att använda bildstatistik. Bilderna har 4x förstoring. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggstabell 1: Komponenter för organoidodling. Observera att reagenser har optimerats för odling av gynekologiska cancer-PDO:er. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande video 1: Time-lapse-video av 500 nM staurosporinbehandling med bilder tagna var 6:e timme. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande video 2: Time-lapse-video av 100 nM staurosporinbehandling med bilder tagna var 6:e timme. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande video 3: Time-lapse-video av 10 nM staurosporinbehandling med bilder tagna var 6:e timme. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande video 4: Time-lapse-video av 1 nM staurosporinbehandling med bilder tagna var 6:e timme. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande video 5: Time-lapse-video av 0,1 nM staurosporinbehandling med bilder tagna var 6:e timme. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande video 6: Time-lapse-video av 0,01 nM staurosporinbehandling med bilder tagna var 6:e timme. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande video 7: Time-lapse-video av fordon (0,06 % DMSO) med bilder tagna var 6:e timme. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 1: Tilläggsprotokoll. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

PDO-kulturer blir ett allt populärare in vitro-modellsystem på grund av deras förmåga att återspegla cellulära svar och beteenden². Betydande framsteg har gjorts inom PDO-generering, odling och expansionstekniker, men metoder för att analysera terapeutiska svar har släpat efter. Kommersiellt tillgängliga 3D-viabilitetskit är lytiska slutpunktsanalyser, som går miste om potentiellt värdefulla kinetiska responsdata och begränsar efterföljande analyser med andra metoder⁸. Nya studier tillämpar avbildning av levande celler för att bedöma läkemedelssvar i PDO-modeller. Här presenterar vi en metod för att bedöma PDO-terapeutiska svar över tid med hjälp av multiplexerad fluorescerande avbildning av levande celler. Multiplexering av fluorescerande färgämnen gör det möjligt att kvantifiera olika cellulära svar samtidigt. Förutom apoptos och cytotoxicitet ser vi framför oss att detta tillvägagångssätt kan utvidgas i framtida studier för att undersöka andra fenotypiska effekter i SUB.

Protokollet som presenteras här är utformat för att samla in kinetiska ljusfälts- och fluorescerande bilder av SUB:er pläterade som kupoler i en 96-hålsplatta. Viktiga steg inkluderar 1) plätering, 2) behandling med färgämne och läkemedel, 3) definition av avbildningsparametrar, 4) förbehandling och analys av bilder vid slutförandet av kinetisk bildinsamling, och 5) dataexport för analys i annan statistisk programvara (figur 1). Intakta SUB pläteras i en 96-hålars platta som 5 μL BME-kupoler som består av ett fördefinierat förhållande mellan BME och organoidodlingsmedia (vanligtvis 1:1). Protokollet som presenteras här använder UltiMatrix som BME på grund av minimal variabilitet från batch till batch och överlägsna optiska egenskaper för avbildning. Modifieringar för skörd av SUB odlade i andra BME, såsom Matrigel, kan vara nödvändiga, liksom för modeller som är klumpiga och svåra att dissociera (se exemplen i tilläggsfigur 4). Därefter tillsätts fluorescerande färgämnen till organoidodlingsmediet vid pläteringstillfället (dag -1) vid en 2x koncentration i en volym på 100 μL och inkuberas över natten för att bestämma celldöd vid baslinjen. Följande dag (dag 0) tillsätts läkemedel eller andra behandlingar till organoidodlingsmedia i en 2x koncentration i en volym på 100 μL och tillsätts sedan till varje brunn för en slutlig volym på 200 μL. Den slutliga volymen på 200 μL minskar meniskeffekten med avbildning. Kinetiska bilder samlas in med hjälp av Cytation 5-plattläsaren i samarbete med BioSpa-bordsinkubatorn. BioSpa-inkubatorn möjliggör inkubation av experimentplattor vid en fast temperatur på 37 °C och 5 % CO₂ -miljö. Upp till 8 plattor kan förvaras i BioSpa och därmed kan 8 experiment utföras samtidigt. Bildparametrar för varje platta ställs in i Gen5-programvaran med hjälp av "Imager Manual Mode" och sparas som ett protokoll. Protokollet laddas sedan in i schemaläggningsprogrammet (BioSpa OnDemand). Programvaran BioSpa OnDemand automatiserar arbetsflödet för kinetisk bildinsamling, inklusive den fysiska överföringen av plattan från BioSpa-inkubatorn till Cytation 5 och dikterar vilket protokoll som ska köras i Gen5 för datainsamling. Bilderna analyseras med hjälp av funktionen Cellular Analysis i Gen5-programvaran (figur 2). Vi beskriver specifika metoder för att analysera Z-projektioner av fluorescerande och ljusfältsbilder. Specifika metoder för att analysera enstaka Z-plan och/eller endast ljusfältsbilder finns i tilläggsfil 1. Slutligen kan användare definiera specifika datafunktioner, såsom SUB-område, antal och genomsnittlig fluorescensintensitet, för att exportera som ett Excel-kalkylblad för efterföljande statistisk analys av läkemedelseffekter.

Med tanke på att PDO-modeller är ett relativt nytt modellsystem för att undersöka läkemedelseffekter, håller metoder för att anpassa sig till odlingsförhållandena, i synnerhet tillväxt i BME, fortfarande på att växa fram¹⁶. Huvuddelen av studierna som utvärderar PDO-svar på läkemedelsbehandling förlitar sig på ATP-baserade endpoint-analyser som ett surrogat för cellhälsa (CellTiter-Glo 3D). Denna metod kräver celllys, vilket utesluter efterföljande nedströmsanalyser. Alternativa endpoint-analyser, såsom fluorescerande färgning, enkel tidsavbildning och morfologisk spårning, har tillhandahållit andra mätvärden för att karakterisera läkemedelsrespons samtidigt som provanvändning för ytterligare ändamål möjliggörs. Till exempel har endpoint-fixeringsprotokoll i plattan tillämpats för analys av läkemedelseffekter med hög genomströmning^17,18. En fördel med denna metod är att den kringgår den omfattande bearbetning som krävs vid typisk immunhistokemi och immunofluorescensavbildning¹⁹ och är särskilt användbar när proverna är begränsade, vilket är fallet för PDO-modeller. Den är också mottaglig för högupplöst avbildning med konfokalmikroskopi. En annan endpoint-analys som inte kräver celllys är avbildning av levande celler med reagenser som propidiumjodid eller akridinapelsin. Vår jämförande analys av CellTiter-Glo 3D och AOPI, varav den senare inte kräver celllys, för bedömning av cellviabilitet och celldöd (Figur 6C) belyser fördelarna med att använda färgämnen för avbildning av levande celler i PDO-modeller. Denna metod har tillämpats av flera grupper, inklusive vår, för att bedöma fenotypiska effekter i slutet av ett experiment 18,19,20. Insamling av kinetiska data med hjälp av antingen in-well-fixering eller slutpunktsmetoder för avbildning av levande celler kräver dock betydande prov. Märkningsfri morfologisk bedömning av SUB över tid övervinner delvis denna begränsning och kan bedömas med hjälp av ett brett spektrum av avbildningsmodaliteter 8,10,17,18, men förändringar i morfologi kanske inte är representativa för spektrumet av potentiella läkemedelseffekter såsom apoptos och förändringar i cellviabilitet. Vi har observerat signifikanta modell-till-modell-variabilitet i morfologiska förändringar som svar på läkemedel. Till exempel kommer vissa SUB:er att öka i yta när de genomgår apoptos, medan andra modeller kan krympa. Kinetiska morfologiska bedömningar har multiplexerats med antingen fasta eller levande cellfluorescerande effektmått i ett begränsat antal studier^18,20. Metoderna som presenteras här är bland de första som multiplexerar olika fluorescerande färgämnen för att samtidigt bedöma flera cellulära effekter i ett system med hög genomströmning.

En av de största förbättringarna med kinetisk avbildning av levande celler är att den övervinner viktiga begränsningar i samband med endpoint-analyser. Till exempel är det tekniskt svårt att plätera lika många SUB:er per brunn eftersom de flesta automatiserade cellräknare är låsta för objekt som är mindre än 60 μm. Avbildning av levande celler möjliggör normalisering till SUB-nummer eller area vid tiden 0 h i varje brunn, som sedan kan användas för att justera för variation i plätering mellan brunnar. Den gyllene standardslutpunktsanalysen för SUB:er är CellTiter-Glo 3D-kitet, som mäter ATP som ett surrogat för cellviabilitet. Vi har i stor utsträckning använt denna analys i våra studier av gynekologisk och prostatacancer med SUB 13,21,22,23,24. Förutom att kräva celllys för ATP-åtgärder kan läkemedel och andra terapeutiska modaliteter förändra ATP-nivåerna, vilket kan ge en felaktig bedömning av terapeutiskt svar. Att använda färgämnen för avbildning av levande celler möjliggör kvantifiering av ett bredare spektrum av specifika cellulära svar, såsom apoptos och cytotoxicitet. Det är viktigt att dessa reagenser inte stör cellernas livskraft eller inducerar DNA-skador, vilket är fallet med propidiumjodid; Detta möjliggör upprepad bedömning av PDO-svaret över tid. Även om vi inte har undersökt användningen av akridinorange (AO) för kinetiska åtgärder, bör verkningsmekanismen för AO inte utesluta sådan tillämpning i framtiden.

Tumörer består av flera distinkta cellpopulationer med varierande genomiska profiler och morfologier. På grund av PDO-modellernas komplexa heterogenitet kan enskilda PDO-svar variera, och det är svårt att spåra dessa svar. Vårt protokoll tillhandahåller en metod för att bedöma flera PDO-svarsmått på brunnsbasis. Vissa tekniska överväganden gäller dock fortfarande för avbildning av levande celler. Antalet brunnar på en platta med 24 brunnar som behövs för att så en platta med 96 brunnar beror på densiteten och tillväxthastigheten för varje PDO-modell. Eftersom klumpning kan förvirra bildanalys (tilläggsfigur 4) kan PDO-modeller behöva ytterligare bearbetningssteg före plätering. Vid behov kan SUB klippas mekaniskt under bearbetningen genom kraftig pipettering med en p200-spets utan brett hål. Enzymatisk nedbrytning med TrypLE Express kan också användas före plätering för att främja PDO-dissociation och minskad klumpbildning. Enligt vår erfarenhet har vi noterat att längden på TrypLE-inkubationen varierar mycket beroende på modell. Därför bör TrypLE-inkubationen optimeras för varje modell, särskilt om forskarna vill få fram encellssuspensioner. Återhämtningstid innan behandlingen påbörjas kan vara nödvändig för PDO-modeller som är särskilt känsliga för enzymatisk nedbrytning.

Vi presenterar metoder för specifika reagenser för avbildning av levande celler. En begränsning i den breda tillämpligheten av de metoder som presenteras här är en brist på reagenser som är kompatibla med BME. För andra färgämnen/reagenser som ännu inte har optimerats för användning i SUB kan ytterligare felsökning vara nödvändig för att bestämma den optimala koncentrationen och minimera lösningsmedelseffekter. Beroende på avläsningen av intresse (t.ex. apoptos eller cytotoxicitet) bör behandling med en förening som är känd för att inducera celldöd, såsom staurosporin eller daunorubicin¹³ , användas för att optimera reagensförhållandena. En ytterligare faktor är den optimala tiden för färgämnesintegrering i BME-kupolen. I våra experiment utför vi en inkubation över natten före behandling för att möjliggöra fullständigt upptag av färgämnet i kupolerna samt bestämma cellhälsan vid baslinjen. Eftersom signalintensiteten kommer att öka med tiden bör forskare utföra pilotstudier med färgämnena för att bestämma den idealiska exponeringstiden i slutet av experimentet för att undvika överexponerade bilder. Slutligen bör reagenser inte störa cellulära processer. Till exempel är färgämnen som interkalerar till DNA inte kompatibla med kinetisk avbildning. Avbildning av levande celler kan dock användas för datanormalisering i slutpunktsanalyser. Vi presenterar en kompletterande metod för att kvantifiera cellviabilitet och förhållandet mellan livskraft och döda celler med hjälp av AOPI. I detta experiment normaliseras den fluorescerande signalen till PDO-nummer för varje brunn som bestäms genom avbildning av levande celler på dag 0 (behandlingsdag, figur 6).

En annan begränsning med denna metodartikel är beroendet av manuell pipettering för experiment, vilket kan leda till större varians i tekniska replikat. Ytterligare förbättringar av datareproducerbarheten kan uppnås genom tillägg av automatisering till andra steg i den experimentella processen, såsom användning av en automatiserad vätskehanterare för plätering och läkemedelsdispensering, vilket har visats av andra ^8,10. Detta tillägg kräver dock en ytterligare investering i forskningsinfrastruktur som kanske inte är tillgänglig för alla forskare. Med tanke på heterogeniteten i PDO-området för varje modell är normalisering av resultat till det ursprungliga PDO-numret eller området vid tidpunkten 0 h fortfarande en användbar metod med automatiserad seeding.

En viktig fördel med Cytation 5 jämfört med andra plattformar för avbildning av levande celler är möjligheten att anpassa bild- och analysfunktioner. Programvaran Cytation 5/Gen5 har dock en brant inlärningskurva och förutsätter att användarna har en grundläggande kunskap om bildbehandling. Ett av målen med denna metodartikel är att ge steg-för-steg-instruktioner för att minska barriären för andra forskare att införliva sofistikerade tekniker för avbildning av levande celler i sina PDO-forskningsprogram. Även om de specifika analysstegen som presenteras här är för ett system, kan användare tillämpa multiplexeringsprinciperna på andra plattformar, med förståelse för att nedströmsanalys kan kräva användning av programvara från tredje part, såsom NIH ImageJ.

Analysmått bör väljas baserat på både experimentella mål och pläteringsförhållanden. Till exempel, om experimentet utförs med ett fluorescerande färgämne för att kvantifiera celldöd, är fluorescensintensitet en effektiv avläsning. Det mest effektiva fluorescensmåttet (total fluorescens kontra objektmedelintensitet) beror på pläteringsförhållandena (tilläggsfigur 4). Om SUB är jämnt fördelade och har en mer cirkulär, sammanhängande morfologi kan fluorescens bestämmas i en definierad subpopulation av den skyddade ursprungsbeteckningen. Den specifika funktionen i Gen5-programvaran är cellulär analys och utdata är objektmedelintensitet. Men om PDO-modellen är klumpig eller har en diskret morfologi rekommenderar vi att fluorescenssignalen kvantifieras på bildnivå. denna funktion finns under Bildstatistik, och utdata är Total fluorescensintensitet. Även om den här metoden är användbar för att observera förändringar på den enskilda brunnsnivån, är det här måttet inte specifikt för objekt av intresse och kan ändras felaktigt om SUB:erna rör sig utanför den angivna pluggen under experimentets varaktighet. I scenarier där det finns betydande skräp eller döda enskilda celler, föreslås användning av cellulär analys för att stänga ute alla fluorescerande signaler som inte är specifikt associerade med en PDO. Ett exempel på differentiella resultat med hjälp av cellulär analys kontra bildstatistik presenteras i kompletterande figur 5.

För att bestämma det optimala tröskelvärdet för bildstatistikfunktionen kan linjeverktyget användas. Med hjälp av linjeverktyget kan användare bestämma intervallet för fluorescensintensitet i en bild. Vi ställer in det lägre tröskelvärdet som 25 % av toppintensiteten i bilden. Om du vill visa de fluorescerande områden som ingår i det angivna tröskelvärdet markerar du rutan "Tröskelavvikelser". Ytterligare finjustering av det lägre tröskelvärdet kan bli nödvändig.

En stor utmaning vid avbildning av levande celler är att lagra den enorma mängd data som genereras vid varje experiment. Detta är särskilt relevant när det gäller PDO-kulturer, där Z-Stacks används för att avbilda över flera fokalplan och generera en Z-projektion. Det finns flera metoder för att lösa detta problem. Se först till att det finns tillräcklig lagringskapacitet. Vi har installerat tre SSD-hårddiskar på totalt 17 TB. Andra alternativ är att överföra experimentella filer till externa hårddiskar eller nätverkslagring. Vi rekommenderar inte att du skriver filer direkt till molnbaserad lagring. För att analysera data som har lagrats på en extern enhet, överför helt enkelt experimentet och bildfilerna till en dator utrustad med Gen5-programvara (OBS: stora filer kan ta längre tid att överföra). Före analysen måste bilderna länkas om till experimentet. Öppna experimentfilen, klicka på Protokoll i verktygsfältet och välj Protokollalternativ. Klicka på Alternativ för att spara bild och klicka på Välj ny bildmapp. Leta reda på bildfilen och klicka på Välj mapp för att länka om.

Beroende på målen för experimentet kan det också vara lämpligt att använda diskretiseringsfunktionen i Gen5. Binning minskar filstorleken genom att minska antalet pixlar, vilket leder till lägre bildupplösning (se steg 3.5.3.2). Därför rekommenderas inte gruppering om högupplösta bilder krävs. När du använder binning-funktionen måste exponeringsinställningarna justeras. När den experimentella filen har skapats, dubbelklicka på avsnittet Bild och klicka på mikroskopikonen för att öppna Imager Manual Mode igen. Använd funktionen Autoexponera eller justera exponeringen manuellt efter behov.

Sammanfattningsvis presenterar vi metoder för att bedöma apoptos och cellhälsa hos SUBs som svar på cytotoxiska ämnen. Framtida studier är nödvändiga för att optimera metoder och utveckla ytterligare analysstrategier för kinetisk avbildning av SUB, såsom andra fenotyper och effekter av läkemedel som är cytostatika snarare än cytotoxiska. Ett stort hinder är den kommersiella tillgängligheten av färgämnen och reagenser som är kompatibla med BME. Det krävs fortfarande mer arbete för att bättre förstå hur kinetisk avbildning av levande celler kan utnyttjas fullt ut för att extrahera mest data från dessa modeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)