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Cancer Research

Imagem Multiplexada de Células Vivas para Respostas a Drogas em Modelos de Câncer Organoides Derivados de Pacientes

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/66072
Automatic Translation
*1,2, *1, *3, 1, 1, 1,4, 1, 1, 5, 6, 3, 1,7
1Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, 4Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 6Agilent Technologies, 7Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa
* These authors contributed equally

Summary

Organoides tumorais derivados de pacientes são um sofisticado sistema modelo para pesquisa básica e translacional. Este artigo de métodos detalha o uso de imagens de células vivas fluorescentes multiplexadas para avaliação cinética simultânea de diferentes fenótipos organoides.

Abstract

Modelos organoides derivados do paciente (DOP) de câncer são um sistema de pesquisa multifuncional que recapitula melhor a doença humana em comparação com linhagens de células cancerosas. Modelos de DOP podem ser gerados pela cultura de células tumorais de pacientes em extratos extracelulares da membrana basal (EMB) e plaqueando-os como cúpulas tridimensionais. No entanto, reagentes comercialmente disponíveis que foram otimizados para ensaios fenotípicos em culturas de monocamada muitas vezes não são compatíveis com EMB. Neste artigo, descrevemos um método para plaquear modelos de DOP e avaliar os efeitos de drogas usando um sistema automatizado de imagens de células vivas. Além disso, aplicamos corantes fluorescentes compatíveis com medidas cinéticas para quantificar a saúde celular e a apoptose simultaneamente. A captura de imagem pode ser personalizada para ocorrer em intervalos de tempo regulares ao longo de vários dias. Os usuários podem analisar os efeitos da droga em imagens individuais do plano Z ou uma projeção Z de imagens seriais de múltiplos planos focais. Usando mascaramento, parâmetros específicos de interesse são calculados, como número de DOP, área e intensidade de fluorescência. Fornecemos dados de prova de conceito demonstrando o efeito de agentes citotóxicos na saúde celular, apoptose e viabilidade. Esta plataforma de imagem cinética automatizada pode ser expandida para outras leituras fenotípicas para entender diversos efeitos terapêuticos em modelos de PDO de câncer.

Introduction

Organoides tumorais derivados de pacientes (DOPs) estão emergindo rapidamente como um sistema modelo robusto para estudar o desenvolvimento de câncer e respostas terapêuticas. As DOPs são sistemas tridimensionais (3D) de cultura celular que recapitulam o complexo perfil genômico e a arquiteturado tumor primário1,2. Ao contrário das culturas bidimensionais (2D) tradicionais de linhagens celulares de câncer imortalizadas, as DOPs capturam e mantêm a heterogeneidade intratumoral 3,4, tornando-as uma ferramenta valiosa para pesquisas mecanicistas e translacionais. Embora as DOPs estejam se tornando um sistema modelo cada vez mais popular, os reagentes comercialmente disponíveis e os métodos de análise para efeitos celulares compatíveis com culturas de DOP são limitados.

A falta de métodos robustos para analisar mudanças sutis na resposta ao tratamento dificulta a tradução clínica. O reagente de saúde celular padrão-ouro em culturas 3D, CellTiter-Glo 3D, utiliza os níveis de ATP como determinante da viabilidade celular 5,6. Embora esse reagente seja útil para ensaios de desfecho, há várias ressalvas, principalmente a incapacidade de usar amostras para outros fins após a conclusão do ensaio.

A imagem de células vivas é uma forma sofisticada de microscopia cinética que, quando combinada com reagentes fluorescentes, tem a capacidade de quantificar uma variedade de leituras de saúde celular dentro de modelos de DOP, incluindo apoptose 7,8,9 e citotoxicidade10. De fato, imagens de células vivas têm sido parte integrante da triagem de compostos em plataformas 2D com alto rendimento11,12. Sistemas como o Incucyte tornaram a tecnologia acessível e, portanto, acessível a grupos de pesquisa em uma variedade de cenários. No entanto, a aplicação desses sistemas para analisar culturas 3D ainda está engatinhando.

Neste artigo, descrevemos um método para avaliar a resposta a drogas em modelos de câncer com DOP usando imagens multiplexadas de células vivas (Figura 1). Através da análise de imagens de campo claro, mudanças no tamanho e morfologia da DOP podem ser monitoradas cineticamente. Além disso, os processos celulares podem ser quantificados simultaneamente ao longo do tempo usando reagentes fluorescentes, como o corante vermelho Anexina V para apoptose e o corante verde Cytotox para citotoxicidade. Os métodos apresentados são otimizados para o sistema de imagem de células vivas Cytation 5, mas este protocolo pode ser adaptado em diferentes plataformas de imagem de células vivas.

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Protocol

Estudos utilizando espécimes de tumores humanos foram revisados e aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional (IRB) da Universidade de Iowa, protocolo #201809807, e realizados de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores. O termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido de todos os sujeitos participantes do estudo. Os critérios de inclusão incluem o diagnóstico de câncer e a disponibilidade de espécimes tumorais.

1. Chapeamento de DOPs intactas em uma placa de 96 poços

  1. Preparar reagentes.
    1. Pré-aqueça placas de 96 poços a 37 °C durante a noite e descongele BME durante a noite a 4 °C.
    2. Preparar meios de cultura organoides completos otimizados para cultivar o tipo de câncer de interesse. Os meios de cultura específicos utilizados para os experimentos aqui apresentados são apresentados na Tabela Suplementar 1.
      NOTA: Os componentes do meio podem precisar ser modificados para diferentes tipos de tumor. Por exemplo, o meio de cultura organoide é suplementado com estradiol 100 nM para tumores ginecológicos13. O meio preparado é estável a 4 °C durante 1 mês. Para armazenamento a longo prazo, aliquotar o meio em tubos de 50 mL e armazenar a -20 °C.
  2. Preparar duas alíquotas separadas de meios de cultura organoides a 4 °C e 37 °C. Por exemplo, se 60 poços estiverem sendo plaqueados em uma placa de 96 poços, use 6 mL de meio de cultura organoide quente e 150 μL de meio de cultura organoide gelado.
  3. Prepare o tampão de lavagem organoide: Suplemento 1x PBS com 10 mM HEPES, 1x Glutamax, 5 mM EDTA e 10 μM Y-27632. Conservar a 4 °C
  4. Colher DOPs cultivadas em placa de 24 poços. Execute todas as etapas no gelo ou a 4 °C, salvo indicação em contrário.
    1. Aspirar o meio de cada poço usando um sistema de linha de vácuo.
    2. Adicionar 500 μL de tampão de lavagem organoide gelado e pipetar suavemente 2-3x usando um pipetador de 1000 μL. Incubar a placa no gelo por 10 min.
    3. Transfira o conteúdo de cada poço para um tubo cônico de 50 mL. Para garantir que todas as DOPs estejam em suspensão, lave cada poço com mais 300 μL de tampão de lavagem organoide e transfira para o tubo cônico de 50 mL. Centrifugar durante 5 min a 350 x g a 4 °C
    4. Aspirar o sobrenadante do BME/pastilha organoide usando um sistema de linha de vácuo, deixando ~ 5 mL restantes no tubo. Adicionar 20 mL de tampão de lavagem organoide e ressuspender suavemente o pellet usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Incubar no gelo por 10 min.
    5. Centrifugar durante 5 min a 350 x g a 4 °C. Aspirar o sobrenadante com um sistema de linha de vácuo, tomando cuidado para não interromper a pastilha DOP.
  5. Plating PDOs em uma placa de 96 poços: Execute todas as etapas no gelo, salvo indicação em contrário.
    1. Ressuspender o pellet de DOP em uma quantidade apropriada de meio de cultura organoide gelado para criar uma suspensão de DOP. Transfira a suspensão de DOP para um tubo de microcentrífuga gelado de 1,5 mL.
      NOTA: Para calcular a quantidade de meios de cultura organoides, determinar o número de poços a serem plaqueados em uma placa de 96 poços, levando em consideração que as DOPs são plaqueadas em uma cúpula de 5 μL em uma proporção de 1:1 de meios de cultura organoides e BME. Por exemplo, ao plaquear uma placa de 96 poços e usar apenas os 60 poços internos, a quantidade total de suspensão de DOP necessária será de 300 μL: 150 μL de meio de cultura organoide e 150 μL de EMB. Para modelos que apresentam crescimento ótimo em diferentes porcentagens de EMB, a razão BME:meio pode ser modificada nesta etapa, embora seja importante padronizar a razão em todos os ensaios para cada modelo específico. Para contabilizar o erro de pipetagem, adicione 10% de volume a cada componente.
    2. Conte o número de DOPs.
      1. Transferir 2,5 μL da suspensão de DOP para um tubo de microcentrífuga gelado de 1,5 mL e misturar com 2,5 μL de EMB. Transfira a mistura de 5 μL para uma lâmina limpa de microscópio de vidro. Não cubra o slide. A mistura vai se solidificar em uma cúpula.
      2. Visualize usando um microscópio de campo brilhante em 4x. Contar o número de DOP na mistura de 5 μL; o objetivo é ter cerca de 25-50 DOPs por cúpula de 5 μL.
        NOTA: Se a densidade desejada não for atingida na mistura de ensaio, ajustar o volume final da suspensão de DOP adicionando mais meios de cultura organoides ou centrifugando a suspensão de DOP e ressuspendendo a pastilha de DOP num volume inferior de meios de cultura organoides gelados. Independentemente da forma como a suspensão de DOP é modificada nesta etapa, a relação final de BME: suspensão de DOP na etapa 1.5.3. deve ser 1:1.
    3. Usando um pipetador de 200 μL com pontas largas, misture cuidadosamente a suspensão de DOP com uma quantidade igual de BME para obter uma proporção de 1:1 de meios de cultura organoides para BME. Evite bolhas, que irão atrapalhar a integridade das cúpulas.
    4. Usando um pipetor de 20 μL, semeie cúpulas de 5 μL no centro de cada poço de uma placa pré-aquecida de 96 poços, semeando apenas os 60 poços internos. Para garantir a distribuição igualitária das DOP, pipetar periodicamente o conteúdo do tubo de 1,5 mL com um pipetador de 200 μL com pontas largas.
    5. Depois que todos os poços tiverem sido semeados, coloque a tampa no prato e inverta suavemente. Incubar a placa invertida a 37 °C durante 20 minutos na incubadora de cultura de tecidos para permitir que as cúpulas se solidifiquem.
      NOTA: A inversão da placa garante que a cúpula do meio de cultura BME/organoide mantenha a estrutura 3D para fornecer espaço adequado para a formação de DOP.
    6. Vire a placa de modo que fique com a tampa para cima e incube por 5 min a 37 °C.

2. Tratamentos e adição de corantes fluorescentes para multiplexação

  1. Enquanto as cúpulas BME estão se solidificando nas placas de 96 poços, prepare diluições de reagentes fluorescentes de imagem de células vivas. Parâmetros específicos para multiplexação do corante vermelho Annexin V e corante verde Cytotox são dados aqui.
  2. Preparação de reagentes fluorescentes (Dia -1): Calcular o volume adequado de meios de cultura organoides com base no número de poços a serem tratados, supondo que cada poço será tratado com 100 μL de meio corante. Diluir o corante em meio de cultura organoide pré-aquecido até a concentração desejada.
    NOTA: A quantidade total de mídia necessária irá variar dependendo do experimento. Adicione 10% ao volume final para contabilizar o erro de pipetagem. Por exemplo, para tratar os 60 poços internos de uma placa de 96 poços, prepare 6,6 mL de meio dosado com corante (Tabela 1).
  3. Trate cada poço com 100 μL de 2x meios de cultura organoides dosados com corante. Adicionar 200 μL de 1x PBS estéril aos orifícios vazios externos da placa. Incubar a 37 °C durante a noite.
    NOTA: O PBS nos poços periféricos diminui a evaporação do meio dos poços internos.
  4. Adição de fármacos/agentes de tratamento (Dia 0): Preparar fármacos em meios de cultura organoides pré-aquecidos a uma concentração de 2x num volume de 100 μL por poço.
    NOTA: DMSO pode ser tóxico para as células em altas concentrações. A concentração de 0,1% de DMSO não é excedida nos experimentos realizados neste estudo. Além dos fármacos, alguns reagentes fluorescentes são distribuídos como solução de DMSO. É importante levar em conta a concentração total de DMSO ao trabalhar com esses reagentes.
  5. Adicionar 100 μL de 2x meio corante a cada poço; Evite criar bolhas.

3. Configuração de parâmetros de imagem

  1. Coloque a placa no Cytation 5. Abrir Software Gen5. Clique em Nova Tarefa > Modo Manual do Imageador. Selecione Capturar agora e insira as seguintes configurações: Objetivo (selecione a ampliação desejada); Filtro (selecionar microplaca); Formato de microplaca (selecionar número de poços); e Tipo de vaso (selecionar tipo de placa). Clique em Usar tampa e Usar velocidade de portadora mais lenta. Clique em OK.
    NOTA: Tipo de vaso: Seja o mais específico possível ao selecionar informações sobre a placa, pois o software é calibrado para a distância específica da objetiva ao fundo da placa para cada tipo de placa e espessura do plástico.
    Velocidade da transportadora mais lenta: Selecione esta caixa para evitar a interrupção das cúpulas ao carregar/descarregar placas.
  2. Crie um Z-Stack que irá criar imagens de toda a cúpula BME.
    1. Selecione um poço de interesse para visualizar (painel esquerdo, abaixo do histograma).
    2. Selecione o canal Campo Brilhante (painel esquerdo, parte superior). Clique em Expor automaticamente e ajuste as configurações conforme necessário.
    3. Defina a parte inferior e superior da guia Z-Stack: Expanda o Modo de Criação de Imagem (painel esquerdo, meio). Marque a caixa Z-Stack . Usando as setas de ajuste de curso (painel esquerdo, meio), clique no ajuste para baixo até que todos os PDOs tenham entrado e saído do foco e estejam confusos. Defina isso como a parte inferior do Z-Stack. Repita na direção oposta usando as setas de ajuste de curso para definir a parte superior do Z-Stack.
    4. Para garantir que as configurações do Z-Stack sejam apropriadas para outros poços de interesse, selecione outro poço (painel esquerdo, abaixo do histograma) e visualize a parte superior e inferior do Z-Stack.
    5. Para inserir manualmente as posições focais, clique nos três pontos ao lado do ajuste fino (painel esquerdo, parte superior). Uma janela será aberta; digite o valor Z-Stack superior (localizado no painel esquerdo, ao centro, em Modo de Imagem). Repita para o valor Z-Stack inferior. Ajuste conforme necessário para capturar a faixa Z desejada repetindo a etapa 3.2.3. Se forem necessários ajustes, selecione outro poço para verificar as configurações.
  3. Defina as configurações de exposição para o(s) canal(es) fluorescente(s). As configurações são descritas para dois canais fluorescentes (GFP & TRITC). O número específico de canais fluorescentes dependerá do experimento e de quais cubos fluorescentes serão instalados no sistema de imagem de células vivas.
    NOTA: Se a intensidade do sinal for significativamente maior no final do experimento, os usuários devem considerar a realização de experimentos de teste para determinar as configurações de exposição ideais no final do experimento que podem ser aplicadas ao configurar os parâmetros iniciais.
    1. Expanda a guia Modo de Criação de Imagem (painel esquerdo, no meio) e abra Editar Etapa de Criação de Imagens. Uma janela pop-up será exibida.
    2. Em Canais, clique na bolha para o número desejado de canais. Designe um canal para campo brilhante e canais adicionais para cada canal fluorescente. Neste exemplo, Canal 1 = Campo Brilhante; Canal 2 = GFP; Canal 3 = TRITC. Usando os menus suspensos Cores, selecione a configuração apropriada para cada canal. Feche a janela de edição clicando em OK.
    3. Configure cada canal fluorescente.
      1. Mude o canal para GFP (painel esquerdo, superior).
      2. Clique em Exposição automática (painel esquerdo, parte superior). Expanda a guia Exposição (painel esquerdo, meio) e ajuste as configurações de exposição para minimizar o sinal de fundo.
      3. Copie as configurações de exposição para a guia Modo de imagem seguindo as etapas 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. Clique no ícone Copiar ao lado da caixa Editar etapa de geração de imagens . Clique em Editar etapa de geração de imagens, que abrirá outra janela.
      5. No canal GFP, clique no ícone Área de transferência na linha Exposição para adicionar as configurações Iluminação, Tempo de integração e Ganho de câmera ao canal.
      6. Repita as etapas 3.3.3.4-3.3.3.5 para o canal TRITC. Clique em OK para fechar a janela.
  4. Configure as etapas de pré-processamento e projeção Z da imagem para automatizar o pré-processamento da imagem.
    1. Clique no ícone Câmera (painel esquerdo, canto inferior). Uma nova janela será aberta.
    2. Em Adicionar etapa de processamento (painel esquerdo, parte inferior), clique em Pré-processamento de imagem. Uma nova janela será aberta.
    3. Na guia Campo Brilhante , desmarque Aplicar Pré-processamento de Imagem.
    4. Para cada guia Canal Fluorescente , verifique se a opção Aplicar Pré-processamento de Imagem está selecionada. Desmarque Usar as mesmas opções do canal 1 e clique em OK. A janela será fechada.
    5. Em Adicionar etapa de processamento, clique em Projeção Z. Uma nova janela será aberta. Se desejar, ajuste o intervalo de fatias (por exemplo, para reduzir o intervalo Z). Feche a janela selecionando OK.
  5. Criar protocolo.
    1. Clique em Conjunto de imagens na barra de ferramentas. No menu suspenso, clique em Criar experimento a partir deste conjunto de imagens. A Janela de Criação de Imagens será fechada e a Janela de Procedimento será aberta.
      NOTA: Os parâmetros selecionados no Modo Manual do Imager serão automaticamente carregados na nova janela, onde um protocolo experimental pode ser criado.
    2. Defina a temperatura e o gradiente: clique em Definir temperatura sob o título Ações (à esquerda). Uma nova janela será aberta. Selecione Incubadora ligada e insira manualmente a temperatura desejada em Temperatura. Em seguida, em Gradiente, insira manualmente 1. Feche a janela selecionando OK.
      NOTA: A criação de um gradiente de 1 °C impedirá a formação de condensação na tampa da placa.
    3. Designe poços para a imagem.
      1. Clique duas vezes na etapa de imagem em Descrição. Clique em Chapa cheia (canto direito, parte superior). Isso abrirá a janela Layout da placa .
      2. Destaque poços de interesse usando o cursor. Clique em OK. Se desejar, marque as caixas Autofocus Binning e Capture Binning . Clique em OK para fechar a janela.
        NOTA: Binning exigirá ajuste de exposição, conforme descrito na etapa 3.3.3.2 acima. Consulte a seção Discussão para cenários específicos nos quais esse recurso pode ser usado.
    4. Defina intervalos para imagens cinéticas.
      1. Clique em Opções sob o título Outro (à esquerda). Marque a caixa Procedimento cinético descontínuo .
      2. Em Tempo Total Estimado, insira o tempo de execução do experimento (por exemplo, 5 dias). Em Intervalo estimado, insira o intervalo para obter a imagem da placa (por exemplo, a cada 6 h).
      3. Clique em Pausar após cada execução para dar tempo para que a placa seja transferida para a incubadora. Feche a janela selecionando OK.
    5. Atualize as etapas de redução de dados.
      1. Clique em OK para fechar a Janela de Procedimento. Uma guia será aberta para atualizar as etapas de redução de dados. Selecione Sim. Clique duas vezes em Pré-processamento de imagem. Clique nos diferentes canais para verificar as configurações e clique em OK.
      2. Clique duas vezes em Projeção Z. Clique nos diferentes canais para verificar as configurações. Clique em OK. Em seguida, clique em OK novamente para fechar a janela de redução de dados.
    6. Formate o layout da chapa.
      1. Abra o Assistente de layout de placa e designe tipos de poço seguindo as etapas 3.6.2-3.6.3.
      2. Clique no ícone Layout de Placa na barra de ferramentas (canto esquerdo, superior) para abrir o Assistente de Layout de Placa.
      3. Marque as caixas ao lado dos tipos de poço usados no experimento. Em Controles de Ensaio, insira o número de diferentes tipos de controle usando as setas. Clique em Avançar para abrir a janela Controle de Ensaio #1 .
      4. Defina as condições do poço de controle de ensaio seguindo as etapas 3.6.5-3.6.8.
      5. Na janela Controle de Ensaio #1, insira o rótulo do controle na caixa ID do layout da placa . Se desejar, digite o nome completo na caixa adjacente. Selecione o número de réplicas para a respectiva condição de controle usando as setas.
      6. Se estiver usando várias concentrações ou uma série de diluição dentro do controle, clique em Definir diluições/concentrações e use o menu suspenso para selecionar o Tipo. Introduzir valores para cada concentração/diluição no quadro.
        NOTA: A função auto pode ser usada se as concentrações mudarem por um incremento consistente.
      7. Selecione a guia Cor na barra de ferramentas. Escolha a cor do texto desejado e a cor do plano de fundo para controle no menu suspenso. Clique em Avançar.
      8. Repita conforme necessário com controles adicionais.
      9. Definir as condições do poço de amostra de acordo com 3.6.10-3.6.12.
      10. Na página Configuração de Exemplo , insira o Prefixo de ID de exemplo (por exemplo, SPL). Selecione o número de réplicas usando as setas. Se estiver usando amostras com concentrações de tratamento variadas, selecione Concentrações ou Diluições no menu suspenso Tipo . Indicar diluições/concentrações no quadro e introduzir unidades na caixa Unidade .
      11. Selecione Campos de identificação na barra de ferramentas. Insira o(s) nome(s) de categoria desejado(s) (por exemplo, ID da amostra, medicamento) na tabela.
      12. Selecione a guia Cor na barra de ferramentas. Selecione uma cor diferente para cada grupo/amostra de tratamento. Clique em Concluir. Isso abrirá a página Layout da placa.
        NOTA: Os números no lado esquerdo correlacionam-se com os diferentes números de amostra.
      13. Atribua IDs de exemplo seguindo as etapas 3.6.14-3.6.16.
      14. Selecionar SPL1 no painel esquerdo. Use o cursor para selecionar poços.
        Observação : ferramentas de seleção automática podem ser ajustadas na caixa de atribuição serial. O número de réplicas e a orientação do layout podem ser pré-designados.
      15. Repita com outras amostras para completar o layout da placa. Quando estiver satisfeito, clique em OK.
      16. Na barra de ferramentas Arquivo , selecione IDs de exemplo. Preencha as colunas ID da amostra com as informações apropriadas para cada amostra (por exemplo, tipo de medicamento). Pressione OK.
    7. Salve o protocolo.
      1. Na barra de ferramentas, clique em Arquivo > Salvar protocolo como. Selecione o local para salvar o arquivo. Insira um nome de arquivo. Clique em Salvar para fechar a janela.
      2. Clique em Arquivo > Sair na barra de ferramentas. Uma guia será aberta para salvar as alterações no Modo Manual do Imager. Selecione Não.
      3. Uma guia será aberta para salvar as alterações no Experimento 1. Selecione Não. Uma guia será aberta para atualizar a definição do protocolo. Selecione Atualizar. Feche o software.
  6. Importe o protocolo para o BioSpa OnDemand e conclua a configuração do Experimento.
    1. Abra o software BioSpa OnDemand (software de agendamento).
    2. Selecione um slot disponível no software.
    3. Remova a placa do sistema de imagem de células vivas. Clique em Abrir Gaveta para acessar o slot apropriado no software de agendamento e insira a placa. Clique em Fechar Gaveta.
      Observação : esta etapa pode ser executada em qualquer ponto uma vez que o protocolo foi criado na etapa 3.5.7 acima. No entanto, a placa deve estar no Cytation 5 para executar uma corrida de temporização no passo 3.6.4.3 abaixo.
    4. Importe o protocolo.
      1. Na guia Informações do Procedimento , selecione Usuário no menu suspenso. Ao lado do slot Protocolo , clique em Selecionar > Adicionar uma nova entrada.
      2. Ao lado do slot Protocolo, clique em Selecionar. Isso abrirá uma nova janela para navegar até o protocolo desejado na arquitetura de arquivos. Clique em Abrir para importar o protocolo para o software de agendamento.
      3. Insira a quantidade de tempo necessária para criar imagens da placa. Clique em OK para fechar a janela Lista de Protocolos Gen5 .
        Observação : esta etapa é especialmente importante ao executar vários experimentos ao mesmo tempo. Para determinar o tempo necessário para criar a imagem do, clique em Executar uma execução de tempo agora. Clique em OK.
    5. Defina intervalos de imagem e agende o experimento.
      1. Em Intervalo, insira o intervalo de imagem designado na etapa 3.5.4.
      2. Em Opções de Hora de Início, selecione Quando Disponível. Em Duração, selecione Fixo ou Contínuo.
        Observação : uma hora de início específica pode ser designada em vez de executar o protocolo na próxima hora disponível. A seleção de Duração Fixa definirá um ponto de extremidade específico para o experimento e exigirá que o usuário designe um período de tempo experimental. A Duração Contínua permitirá que o experimento seja executado sem ponto de extremidade e só poderá ser encerrado por um usuário interrompendo o experimento.
      3. Clique em Agendar Placa/Embarcação. Isso abrirá a Sequência de Validação de Placa. Uma guia será aberta com o horário de primeira leitura proposto. Clique em Sim para aceitar esta agenda.

4. Análise das imagens no software Gen5 (Figura 2)

  1. Abra o módulo de Análise de Imagens.
    1. Abra o Gen5. No Gerenciador de Tarefas, selecione Experimentos > Abrir. Selecione o experimento para abrir o arquivo. Clique em Placa > Exibir na barra de ferramentas.
    2. Altere o menu suspenso Dados para Projeção Z. Clique duas vezes em um poço de interesse. Selecione Analisar > desejo configurar uma nova etapa de redução de dados de Análise de Imagem. Clique em OK.
  2. Análise celular
    1. Máscara primária
      1. Em Configurações de análise, selecione Tipo: Canal de detecção e análise celular: ZProj[Tsf[Campo brilhante]] (painel esquerdo, centro).
      2. Clique em Opções. Isso abrirá a página Máscara primária e Contagem . Na caixa Limite , marque Automático e clique em Aplicar. Clique na caixa Realçar Objetos (painel direito, inferior) para mostrar objetos dentro do limite designado. Ajuste conforme necessário para incluir objetos de interesse.
        Observação : configurações de limite são baseadas na intensidade de pixel. Por exemplo, se o limite for definido como 5000, pixels com intensidade maior que 5000 serão incluídos na análise.
      3. Em Seleção de Objeto, designe o tamanho mínimo e máximo do objeto (μm). Ajuste conforme necessário para excluir detritos celulares/células únicas.
        NOTA: O tamanho da DOP pode variar significativamente entre diferentes modelos e tipos. Use a ferramenta de medição no software Gen5 para determinar os limites mínimos e máximos de tamanho PDO para cada modelo. Os usuários podem escolher um limite mínimo de tamanho de DOP menor em relação ao valor fornecido pelo instrumento de medição, a fim de evitar a exclusão de fragmentos de DOP em momentos posteriores após o tratamento medicamentoso.
      4. Para limitar a análise a uma determinada região do poço, desmarque Analisar imagem inteira e clique em Conectar. Na janela Plugue de imagem , use o menu suspenso para selecionar a forma Plug . Ajuste os parâmetros de tamanho e posição conforme necessário para se ajustar à região de interesse.
        NOTA: É importante maximizar o número de PDOs dentro do plugue e, ao mesmo tempo, excluir áreas livres de PDO para minimizar o plano de fundo. Designe um tamanho de plugue que capture consistentemente a maioria dos objetos de interesse em replicações. Gerar um plugue que também exclua as bordas da cúpula é importante, pois exclui quaisquer objetos que possam parecer distorcidos devido à refração da luz da curvatura extrema da cúpula ao redor das bordas. Incluir objetos de borda primária também pode ser desmarcada para capturar apenas PDOs inteiros dentro do plugue.
    2. Análise de subpopulações. Um exemplo de designação de subpopulação é fornecido na Figura 3.
      1. Clique em Métricas calculadas na barra de ferramentas Análise celular. Clique em Selecionar ou criar métricas de interesse no nível de objeto (canto direito, parte inferior). Em Métricas de objeto disponíveis, selecione métricas de interesse (por exemplo, circularidade) e clique no botão Inserir. Clique em OK.
        NOTA: A morfologia e a densidade de cada modelo de DOP determinarão as melhores métricas de interesse para distinguir a subpopulação.
      2. Clique em Análise de Subpopulação na barra de ferramentas Análise Celular . Clique em Adicionar para criar uma nova subpopulação. Uma janela pop-up será aberta.
      3. Se desejar, insira um nome para a subpopulação. Em Métricas de Objeto, selecione uma métrica de interesse e pressione Adicionar Condição. Na janela Editar Condição , insira parâmetros para a Métrica de Objeto escolhida. Repita com métricas adicionais conforme necessário.
        NOTA: Os parâmetros podem ser ajustados manualmente ou definidos usando a ferramenta localizador. Por exemplo, para excluir detritos, os usuários podem adicionar Área como uma Métrica de Objeto e selecionar objetos menores que 800. A circularidade como métrica de objeto é usada rotineiramente, e quaisquer objetos com circularidade maior que 0,2-0,5 são incluídos, dependendo do modelo.
      4. Na tabela na parte inferior da janela, verifique os resultados desejados para exibição. Clique em OK > Aplicar.
      5. Para exibir os objetos dentro da subpopulação, use o menu suspenso Detalhes do objeto (painel direito, centro) para selecionar a subpopulação. Os objetos que se enquadram nos parâmetros serão realçados na imagem.
        Observação : para alterar as cores de realce da máscara primária e subpopulação, clique em configurações (painel direito, parte inferior).
      6. Para ajustar os parâmetros de subpopulação, reabra a janela Análise de Subpopulação na barra de ferramentas Análise Celular . Selecione a subpopulação e clique em Editar. Clique em Adicionar etapa.
        NOTA: Isso aplicará a mesma análise a todos os poços dentro do experimento em todos os pontos de tempo. No menu suspenso na página Matriz, diferentes métricas podem ser selecionadas para visualização individual.

5. Exportando dados do Gen5 para o Excel

  1. Para personalizar um arquivo de dados para exportação, selecione o ícone Construtores de Relatório/Exportação na barra de ferramentas. Na janela pop-up, clique em Nova exportação para o Excel.
  2. Na página Propriedades da janela pop-up, selecione Escopo > Chapa e Conteúdo > Personalizado. Clique na opção Conteúdo na barra de ferramentas. Clique em Editar modelo, que abrirá o programa Excel.
  3. Na planilha, selecione Suplementos > Tabela > Dados de Poços. Passe o mouse sobre as várias seleções para ver as opções de exportação. Selecione a métrica de interesse (por exemplo, Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
    NOTA: O layout da placa pode ser adicionado ao modelo de análise de planilha selecionando Suplementos > Resumo do Protocolo > Layout.
  4. Uma janela Editar será aberta. Na caixa Poços , designe os poços para exportação por Well-ID ou Well #. Selecione OK. Um modelo será carregado no arquivo de planilha. Feche a planilha. O modelo é salvo automaticamente.
  5. Clique em OK na janela Nova exportação para Excel e feche a janela Construtores de Relatório/Exportação .
  6. Clique no ícone Exportar na barra de ferramentas Gen5. Marque a caixa ao lado do arquivo de exportação desejado. Clique em OK. O Gen5 preencherá automaticamente o modelo de planilha e abrirá o arquivo no Excel.

6. Análise de dados externos

  1. Abra o arquivo de exportação (.xlsx) no Excel.
  2. Para cada poço, divida cada valor individual pelo valor de 0:00 ponto de tempo para esse poço. Isso definirá o ponto de tempo 0 igual a 1, e cada valor além disso será relativo à leitura inicial.
  3. Abra um novo arquivo no software de análise de dados. Selecione a opção de layout XY .
    OBS: Neste protocolo foi utilizado o GraphPad Prism (versão 9.5.1).
  4. Rótulos de entrada para cada grupo de dados. Copie e cole os pontos de tempo e os valores normalizados correspondentes para cada grupo de tratamento na tabela Prism. Um gráfico para os dados será gerado automaticamente e pode ser encontrado em Gráficos.

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Representative Results

Nosso objetivo foi demonstrar a viabilidade do uso de imagens multiplexadas de células vivas para avaliar a resposta terapêutica da DOP. Experimentos de prova de conceito foram realizados em dois modelos separados de DOP de câncer de endométrio: ONC-10817 e ONC-10811 (veja a Figura Suplementar 1 e a Figura Suplementar 2 para dados do ONC-10811). A apoptose (coloração da anexina V) e a citotoxicidade (captação do Cytotox Green) foram monitoradas cineticamente em resposta ao agente indutor de apoptose, a estaurosporina. Especificamente, as DOPs foram plaqueadas em placas de 96 poços, tratadas com os corantes Annexin V Red e Cytotox Green e colocadas em uma incubadora de 37 °C durante a noite, conforme diagramado na Figura 1. Confirmamos em dois modelos independentes de DOP que o tratamento com os corantes Annexin V e Cytotox Green não é tóxico (Figura 2 suplementar). No dia seguinte, as DOPs foram tratadas com concentrações crescentes de estaurosporina (0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 500 nM). Posteriormente, foram estabelecidos protocolos no software Gen5 e os experimentos foram realizados em um período de 5 dias, com obtenção de imagens a cada 6 h. Os dados foram analisados utilizando-se a função Análise Celular do software Gen5, conforme descrito na seção 4 do protocolo. A Máscara Primária foi ajustada utilizando a função Auto threshold com a opção "Split touching objects" desmarcada e com parâmetros de tamanho mínimo: 30 μm e máximo: 1000 μm. A subpopulação DOP foi definida por circularidade > 0,25. As intensidades médias do objeto nos canais TRITC (anexina V, apoptose) e GFP (Cytotox Green, citotoxicidade) dentro da subpopulação designada DOP foram exportadas como um arquivo .xlsx para análise posterior. A intensidade média do objeto para cada poço em cada ponto de tempo nos canais GFP e TRITC foi normalizada para o tempo 0. Os dados normalizados de fluorescência foram então transferidos para um arquivo Prism e visualizados como um gráfico de linhas.

O tratamento com estaurosporina resultou em um aumento significativo e dose-dependente da apoptose e uma diminuição na saúde celular ao longo do tempo em comparação com o controle do veículo, como evidenciado pelo aumento da intensidade média do objeto em ambos os canais TRITC (anexina V) e GFP (Cytotox) (Figura 4, Figura 5, Vídeo Suplementar 1, Vídeo Suplementar 2, Vídeo Suplementar 3, Vídeo Suplementar 4, Vídeo Suplementar 5, Vídeo Suplementar 6 e Vídeo Suplementar 7). As doses de 500 nM, 100 nM e 10 nM de estaurosporina resultaram, cada uma, em um aumento estatisticamente significativo tanto na apoptose quanto na citotoxicidade ao longo do tempo (Figura 5A-C), bem como ao final do experimento (Figura 5E,F). Além disso, a estaurosporina inibiu efetivamente o crescimento e a formação de DOP nessas concentrações, como demonstrado por uma diminuição global na área total de DOP, enquanto os poços controle exibiram um aumento na área total de DOP (Figura 4 e Figura 5D).

Uma vez que uma grande vantagem da imagem de células vivas é a capacidade de corrigir a variabilidade no plaqueamento, realizamos um experimento em que a viabilidade celular foi avaliada como uma medida de desfecho. Os dados do ensaio de desfecho de prova de conceito foram coletados usando um modelo de DOP que foi gerado a partir de um xenoenxerto de câncer de próstata derivado do paciente. Imagens de campo brilhante foram coletadas no início do período de tratamento (dia 0), seguidas pela adição de um reagente corante duplo que mede a viabilidade (laranja de acridina, AO) e morte celular (iodeto de propídio, PI). O componente AO emite um sinal fluorescente verde ao se ligar ao DNA de fita dupla, um indicador da viabilidade celular. O componente IP cora células nucleadas mortas e pode ser usado para quantificar a morte celular em resposta ao tratamento. A fim de explicar a variabilidade no revestimento de DOP, desenvolvemos um método para determinar o número de DOPs por poço no tempo 0 convertendo imagens de campo brilhante em imagens de Contraste de Fase Digital (Figura Suplementar 3 e Arquivo Suplementar 1).

As DOPs do câncer de próstata foram tratadas com daunorrubicina, um agente quimioterápico que causa morte celular, por 7 dias. Após a conclusão do experimento, as amostras foram coradas com AOPI conforme descrito no Arquivo Suplementar 1, seguido da análise das imagens fluorescentes em Gen5. A Figura 6A mostra um painel de imagens do ensaio de desfecho AOPI no dia 7. Ao comparar as DOP tratadas com veículo (linha um) com as DOP tratadas com 10 μM de daunorrubicina (linha dois), houve uma clara diminuição da fluorescência verde (medida de viabilidade, coluna dois) e um aumento da fluorescência vermelha (medida de morte celular, coluna três). Esses resultados foram então quantificados na Figura 6B, onde mostramos a matriz de leituras que podem ser obtidas usando a técnica de coloração de desfecho AOPI. O gráfico superior esquerdo mostra a medida de viabilidade gerada a partir da coloração AO, normalizada para a contagem de DOP determinada pela análise de imagens de Contraste de Fase Digital de cada poço no Dia 0. Esses dados correlacionam-se com o resultado visual da Figura 6A, segundo o qual, à medida que a concentração de daunorrubicina aumentava, a viabilidade diminuía drasticamente. Isso é ainda recapitulado no gráfico superior direito, que demonstra um aumento na morte celular denotado por um aumento da fluorescência vermelha adquirida com a coloração do IP.

Os dados de IP foram então combinados com a leitura de viabilidade (AO) para calcular uma Razão Viável/Morta (Figura 6B, gráfico inferior esquerdo). Essa relação é uma abordagem útil para determinar se uma droga é citostática ou citotóxica. Especificamente, uma droga citotóxica atingirá muito mais próximo de 0 do que uma droga citostática devido ao fato de que uma droga citostática inibirá o crescimento, mas pode não induzir a morte celular. Por fim, a área das DOPs pode ser calculada com precisão usando a fluorescência verde da coloração AO, mesmo quando as DOPs podem estar sofrendo morte celular e blebbing. O gráfico inferior direito representa a área média da DOP, que foi calculada como a soma da área indicada na análise da subpopulação dividida pelo número da DOP. A análise da área pode dar mais indicações sobre se um tratamento está simplesmente inibindo o crescimento da DOP ou realmente causando regressão da DOP. Nota-se que a análise da área média da DOP foi realizada utilizando o canal GFP e a função Análise Celular, em contraste com a Figura 5D, que utilizou as imagens de campo claro para calcular a área total da DOP. Esses dados destacam a flexibilidade do pipeline de análise, dependendo da disponibilidade dos dados e do interesse do usuário.

Finalmente, comparamos o padrão-ouro para leituras de viabilidade, CellTiter-Glo 3D, com a leitura de fluorescência de viabilidade usando AOPI (Figura 6C). Observe que os dados neste painel não foram normalizados para o número PDO de tempo 0, uma vez que essa normalização normalmente não é realizada por laboratórios usando o kit CellTiter-Glo 3D. Observamos a mesma tendência para o efeito da droga em ambos os ensaios, em que a viabilidade da DOP diminuiu à medida que a concentração de daunorrubicina aumentou. A única diferença visual entre essas leituras foi que a análise 3D do CellTiter-Glo atingiu um IC50 antes da análise AOPI e quase completamente atingiu 0. Esse resultado pode ser explicado pelo mecanismo de ação da daunorrubicina. A daunorrubicina é um inibidor da topoisomerase-II que introduz quebras de DNA de fita dupla, levando à parada do ciclo celular e, eventualmente, à apoptose14. Durante a parada do ciclo celular, pode ocorrer depleção de ATP15. Dado que o ensaio CellTiter-Glo 3D é baseado em uma reação ATP-luciferase para gerar um sinal de luminescência, nós hipotetizamos que a redução mais forte na viabilidade celular em concentrações mais altas de daunorrubicina foi devido à depleção de ATP em vez de morte celular completa. Corroborando essa ideia, as imagens da Figura 6A retratam uma população vivendo de DOPs na cultura, como denotado pela fluorescência verde.

Figure 1
Figura 1: Visão geral do protocolo de plaqueamento, imagem e análise. As DOPs são plaqueadas em uma placa de 96 poços e tratadas com corantes fluorescentes e medicamentos. Os parâmetros de imagem para o experimento (por exemplo, Exposição, Pilha Z) são criados no software Gen5. As imagens são adquiridas pelo Cytation 5 e processadas no Gen5, e os dados são exportados para análise posterior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Visão geral do recurso Análise celular. 1: Designar plugue: um plugue é designado para incluir áreas de interesse. 2: Definir máscara primária: A máscara primária define objetos de interesse com base no tamanho e na intensidade de pixels em um canal de escolha. Nesta imagem representativa, os objetos incluídos na máscara primária são delineados em roxo. 3: Definir subpopulação: Uma subpopulação adicional pode ser definida para refinar ainda mais a população desejada para análise. A subpopulação na imagem de exemplo (delineada em amarelo) é definida com base na circularidade (>0,25) e área (>800). As imagens foram adquiridas com objetiva de 4x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Exemplos de mascaramento de subpopulação usando o recurso Análise Celular. As subpopulações são definidas no canal de campo brilhante. A subpopulação nas imagens de exemplo (delineada em amarelo) é definida com base na circularidade (>0,25) e área (>800). As imagens foram adquiridas com objetiva 4X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: O tratamento com estaurosporina resulta em um aumento dose-dependente da apoptose e citotoxicidade. Imagens de campo brilhante (objetiva 4x) com sobreposição de fluorescência GFP e TRITC são mostradas para as doses de 500 nM, 10 nM e 0,1 nM de estaurosporina em 3 momentos: 0 h, 54 h, 114 h. O sinal fluorescente vermelho indica apoptose (anexina V), e o sinal fluorescente verde indica citotoxicidade (Cytotox). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Imagem de células vivas fluorescentes multiplexada para avaliar a resposta da DOP. A DOP modelo ONC-10817 foi semeada em placas de 96 poços e incubada com os corantes Vermelho Anexina V (1:400) e Verde Cytotox (200 nM) durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, as DOPs foram tratadas com concentrações crescentes de estaurosporina e foram fotografadas a cada 6 h por ~5 dias. (A,B) Aumento tempo-dependente da (A) citotoxicidade ou (B) apoptose em resposta à estaurosporina. Os dados foram tabulados como Intensidade média do objeto no canal GFP ou TRITC. (C) Comparação do tempo de evolução da apoptose e citotoxicidade em resposta à estaurosporina 100 nM ou 500 nM. Os dados foram tabulados como os valores de Intensidade Média do Objeto nos canais GFP e TRITC. (D) A estaurosporina inibe o crescimento das DOP. Os dados foram tabulados como a área total média da DOP. Os dados em A-D foram normalizados para o número de DOP no tempo 0 h em cada poço e plotados como média e erro padrão da média (EPM). N=5 repetições técnicas por tratamento. p < 0,0001 vs. controle do veículo por ANOVA de 2 vias. (E) Imagens representativas de campo brilhante, GFP e TRITC de DOPs tratadas com estaurosporina 500 nM versus veículo no final do experimento (114 h). As imagens foram adquiridas com objetiva de 4x. (F) Quantificação da citotoxicidade, apoptose e viabilidade no tempo de 114 h. A Intensidade Média do Objeto GFP (esquerda) e a Intensidade Média do Objeto TRITC (meio) foram calculadas no tempo de 114 h usando os resultados dos painéis A-C. A viabilidade (direita) foi avaliada com o reagente CellTiter-Glo 3D de acordo com o protocolo do fabricante. Os valores de luminescência bruta (RLU) foram normalizados para a área total da DOP no tempo 0 h e plotados como a viabilidade da dobra em relação ao controle do veículo, que foi fixado em 1,0. ** p<0,01, ***p<0,001, **** p<0,0001 vs. controle do veículo via ANOVA unidirecional com teste post-hoc de Dunnett. N = 5 repetições técnicas por tratamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Uso de imagens de células vivas para auxiliar na normalização dos dados do ensaio de desfecho. As DOPs foram tratadas com concentrações crescentes do inibidor da topoisomerase-II, daunorrubicina, por 7 dias. As DOPs foram expostas à Solução de Coloração AOPI e obtidas como descrito no Arquivo Suplementar 1. AO = laranja de acridina, uma medida de viabilidade (canal de GFP); IP = iodeto de propídio, uma medida de morte celular (Texas Red channel). (A) Imagens representativas obtidas pela coloração AOPI após 7 dias de tratamento com daunorrubicina 10 μM ou controle veicular (DMSO 0,1%). (B) Leituras diferentes usando fluorescência AOPI como um método de viabilidade de desfecho/morte celular. Consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter uma descrição detalhada dos métodos de análise. No canto superior esquerdo, análise da viabilidade da DOP após 7 dias, determinada pela coloração AO. No canto superior direito, análise da morte celular pela coloração do IP. Os dados para coloração AO e IP foram normalizados para o número de DOP no tempo 0 h e, em seguida, para o veículo controle, que foi fixado em 1,0, e plotado como média e desvio padrão. No canto inferior esquerdo, cálculo da razão viável/morta utilizando as integrais médias dos objetos para as colorações AO e PI. Inferior direita, área de DOPs determinada pela coloração AO. A análise celular foi realizada no canal GFP. (C) Comparação de dois métodos para testar a viabilidade da DOP. Após a obtenção de imagens, a viabilidade foi avaliada usando o reagente CellTiter-Glo 3D de acordo com o protocolo do fabricante. A sobrevivência das dobras em relação ao controle do veículo foi plotada em concentrações crescentes de daunorrubicina. Os dados representam a média e o desvio padrão para N = 6 repetições técnicas por tratamento; os dados não foram normalizados para o tempo 0 h no painel C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tratamento # de poços Volume de mídia Anexina Cytotox 100 μM
Diluição Volume Diluição Volume
Multiplex 60 6,6 mL 1:400 16,5 μL 200 nM 13,2 μL

Tabela 1: Exemplo de experimento de multiplexação. A anexina V vermelha liga-se à serina fosfatidil exposta no folheto externo das membranas celulares apoptóticas. O Cytotox Green integra-se em células com integridade da membrana comprometida e liga-se ao ADN.

Figura suplementar 1: Imagem de células vivas multiplexada do ONC-10811. As DOPs foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas nos corantes Vermelho Anexina V (1:400) e Verde Cytotox (200 nM) durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, as DOPs foram tratadas com concentrações crescentes de estaurosporina e foram fotografadas a cada 6 h por 5 dias. (A) Aumento tempo-dependente da citotoxicidade em resposta à estaurosporina. Os dados foram tabulados como Intensidade Média do Objeto no canal GFP. (B) Dose-resposta da estaurosporina em 114 h. Os dados foram tabulados como os valores de Intensidade Média do Objeto no canal GFP no momento de 114 h. (C) Aumento tempo-dependente da apoptose em resposta à estaurosporina. Os dados foram tabulados como Intensidade Média do Objeto no canal TRITC. (D) Dose-resposta da estaurosporina em 114 h. Os dados foram tabulados como os valores de Intensidade Média do Objeto no canal TRITC no tempo de 114 h. Os dados em A e C foram normalizados para o número de DOP no tempo 0 h ao nível do poço. N = 5 repetições técnicas por tratamento em cada modelo. p < 0,0001 vs. controle do veículo por ANOVA de 2 vias. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 suplementar: O tratamento com Anexina V e Cytotox não perturba a viabilidade da DOP. As DOPs foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas com os corantes Vermelho Anexina V (1:400) e Verde Cytotox (200 nM) durante a noite a 37 °C. Após as 24 h de incubação, a viabilidade foi avaliada pelo ensaio CellTiter-Glo 3D de acordo com o protocolo do fabricante. (A) Viabilidade em DOP tratadas com e não tratadas com corantes no momento de 24 horas. São apresentados os valores relativos da unidade luminosa (RLU) e os valores normalizados para a área da soma da DOP. Especificamente, o RLU CellTiter-Glo3D para cada poço foi normalizado para a soma da área de DOP para esse poço no momento do plaqueamento (ou seja, imediatamente após a adição do corante). A área total da DOP foi determinada usando o cálculo da "Área de Soma de Objetos" na Análise Celular. N = 10. (B) Viabilidade em DOP tratadas com e não tratadas com corantes no momento de 114 horas. São apresentados os valores de luminescência bruta e os valores normalizados para a área total de DOP. O RLU CellTiter-Glo3D para cada poço foi normalizado para a soma da área da DOP em 24 h pós-plaqueamento, o que corresponde ao tempo 0 h nos experimentos de cinética de imagem. N = 5. A significância em A e B foi avaliada pelo teste t não pareado; Os valores de p estão listados nos gráficos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura complementar 3: Análise label-free de DOPs usando contraste de fase digital. Esta figura contém imagens representativas (objetiva de 2,5x) representando a análise sem rótulos, conforme descrito no Arquivo Suplementar 1: Configurando parâmetros de imagem para um único plano focal de análise de visão (Bright Field/Digital Phase Contrast Images) e análise Digital Phase Contrast Image no software Gen5. (A) Exemplo de imagem de campo brilhante de um modelo PDXO de câncer de próstata em um único plano focal. (B) A imagem de campo brilhante em A foi convertida em imagem de Contraste de Fase Digital. Objetos escuros na imagem de campo claro aparecem brilhantes na imagem de Contraste de Fase Digital e vice-versa. (C) Exemplo de mascaramento de DOP usando a imagem de contraste Digital Phase. Note que as bordas dos objetos de interesse tornam-se muito mais definidas em comparação com as imagens de campo brilhante. Nesta imagem representativa, os objetos na máscara primária são delineados em amarelo. A subpopulação em (C) (delineada em rosa) é definida com base na circularidade (>0,3), área (>1000), Mean[Dig.Ph.Con] > 2000, StdDev[Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500, e Peak[Dig.Ph.Con] > 12500. Os parâmetros utilizados nesta figura representativa foram aplicados aos dados da Figura 6 para normalizar a contagem de células no dia 0. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 4: Os modelos de DOP podem variar em sua morfologia e consistência de plaqueamento. Painel Superior: Exemplos de dispersão diferencial de DOPs nas cúpulas BME. Painel inferior: Imagens representativas de DOPs discoesas versus circulares. Todas as imagens foram adquiridas com microscópio EVO. Ampliações são anotadas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 5: Exemplo de imagens usando Análise Celular vs. Estatísticas de Imagem para quantificar a fluorescência. Usando a Análise Celular, os usuários podem definir populações específicas dentro de uma imagem e medir a fluorescência nessas regiões. As Estatísticas de Imagem também podem ser usadas para medir a fluorescência em uma imagem, definindo um limite para excluir sinais de fundo. Consulte a Discussão para ver as limitações do uso de Estatísticas de Imagem. As imagens estão em ampliação de 4x. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Componentes dos meios de cultura organoides. Observe que os reagentes foram otimizados para a cultura de DOPs de câncer ginecológico. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 1: Vídeo time-lapse do tratamento com estaurosporina 500 nM com imagens adquiridas a cada 6 h. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 2: Vídeo Time-lapse do tratamento com estaurosporina 100 nM com imagens adquiridas a cada 6 h. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 3: Vídeo Time-lapse do tratamento com estaurosporina 10 nM com imagens adquiridas a cada 6 h. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 4: Vídeo time-lapse do tratamento com estaurosporina 1 nM com imagens adquiridas a cada 6 h. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 5: Vídeo time-lapse do tratamento com estaurosporina 0,1 nM com imagens adquiridas a cada 6 h. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 6: Vídeo time-lapse de tratamento com estaurosporina 0,01 nM com imagens adquiridas a cada 6 h. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 7: Vídeo Time-lapse do veículo (0,06% DMSO) com imagens adquiridas a cada 6 h. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Protocolos suplementares. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

As culturas de DOP estão se tornando um sistema modelo in vitro cada vez mais popular devido à sua capacidade de refletir respostas e comportamentos celulares2. Avanços significativos foram feitos nas técnicas de geração, cultura e expansão de DOP, mas os métodos para analisar as respostas terapêuticas ficaram para trás. Os kits de viabilidade 3D disponíveis comercialmente são ensaios de desfecho lítico, perdendo dados de resposta cinética potencialmente valiosos e limitando análises subsequentes por outros métodos8. Estudos emergentes estão aplicando imagens de células vivas para avaliar respostas a drogas em modelos de DOP. Aqui, apresentamos um método para avaliar as respostas terapêuticas da DOP ao longo do tempo utilizando imagens fluorescentes multiplexadas de células vivas. A multiplexação de corantes fluorescentes permite que diferentes respostas celulares sejam quantificadas simultaneamente. Além da apoptose e citotoxicidade, vislumbramos que essa abordagem possa ser expandida em estudos futuros para examinar outros efeitos fenotípicos em DOPs.

O protocolo aqui apresentado é projetado para adquirir imagens cinéticas de campo claro e fluorescentes de DOPs plaqueadas como cúpulas em uma placa de 96 poços. As principais etapas incluem 1) plaqueamento, 2) tratamento com corante e medicamento, 3) definição de parâmetros de imagem, 4) pré-processamento e análise das imagens ao término da aquisição da cinética e 5) exportação dos dados para análise em outros softwares estatísticos (Figura 1). As DOPs intactas são plaqueadas em uma placa de 96 poços como cúpulas de 5 μL de BME compostas por uma proporção predefinida de EMB e Meios de Cultura Organoides (tipicamente 1:1). O protocolo aqui apresentado usa UltiMatrix como BME devido à mínima variabilidade lote a lote e propriedades ópticas superiores para aquisição de imagens. Modificações para a colheita de DOPs cultivadas em outras BMEs, como Matrigel, podem ser necessárias, bem como para modelos que são aglomerados e difíceis de dissociar (ver exemplos da Figura 4 Suplementar). Em seguida, corantes fluorescentes são adicionados ao meio de cultura organoide no momento do plaqueamento (Dia -1) em uma concentração de 2x em um volume de 100 μL e incubados durante a noite para determinar a morte celular basal. No dia seguinte (Dia 0), drogas ou outros tratamentos são adicionados ao Organoid Culture Media em uma concentração de 2x em um volume de 100 μL, e então adicionados a cada poço para um volume final de 200 μL. O volume final de 200 μL reduz o efeito menisco com exames de imagem. As imagens cinéticas são adquiridas usando o leitor de placas Cytation 5 em parceria com a incubadora de mesa BioSpa. A incubadora BioSpa permite a incubação de placas experimentais a uma temperatura fixa de 37 °C e ambiente de 5% CO2 . Até 8 placas podem ser armazenadas no BioSpa e, assim, 8 experimentos podem ser realizados simultaneamente. Os parâmetros de imagem para cada placa são configurados no software Gen5 usando o "Modo Manual do Imager" e salvos como um protocolo. O protocolo é então carregado no software de agendamento (BioSpa OnDemand). O software BioSpa OnDemand automatiza o fluxo de trabalho para aquisição de imagens cinéticas, incluindo a transferência física da placa da incubadora BioSpa para o Cytation 5 e ditando qual protocolo executar no Gen5 para coleta de dados. As imagens são analisadas utilizando a função Análise Celular do software Gen5 (Figura 2). Descrevemos métodos específicos para analisar projeções Z de imagens fluorescentes e de campo claro. Métodos específicos para analisar planos Z únicos e/ou apenas imagens de campo brilhante são fornecidos no Arquivo Suplementar 1. Finalmente, os usuários podem definir características específicas dos dados, como área DOP, número e intensidade média de fluorescência, para exportar como uma planilha Excel para posterior análise estatística dos efeitos das drogas.

Dado que os modelos de DOP são um sistema modelo relativamente novo para interrogar os efeitos de drogas, métodos para acomodar as condições de cultura, em particular o crescimento da EMB, ainda estão surgindo16. A maior parte dos estudos que avaliam a resposta da DOP ao tratamento medicamentoso baseia-se em ensaios de desfecho baseados em ATP como substituto para a saúde celular (CellTiter-Glo 3D). Este método requer lise celular, impedindo assim análises subsequentes a jusante. Ensaios de desfechos alternativos, como coloração fluorescente, imagem de ponto de tempo único e rastreamento morfológico, forneceram outras métricas para caracterizar a resposta a drogas, permitindo o uso da amostra para fins adicionais. Por exemplo, protocolos de fixação em placa têm sido aplicados para análise em alto rendimento dos efeitos de drogas17,18. Uma vantagem desse método é que ele contorna o extenso processamento necessário em imagens típicas de imunohistoquímica e imunofluorescência19 e é particularmente útil quando a amostra é limitada, como é o caso dos modelos de DOP. Também é passível de imagens de alta resolução com microscopia confocal. Outro ensaio de desfecho que não requer lise celular é a imagem de células vivas com reagentes como iodeto de propídio ou laranja de acridina. Nossa análise comparativa do CellTiter-Glo 3D e da AOPI, esta última sem necessidade de lise celular, para avaliação da viabilidade e morte celular (Figura 6C), destaca as vantagens do uso de corantes de imagem de células vivas em modelos de DOP. Esse método tem sido aplicado por vários grupos, inclusive o nosso, para avaliar os efeitos fenotípicos ao final de um experimento 18,19,20. No entanto, a aquisição de dados cinéticos usando os métodos de fixação no poço ou de imagem de células vivas requer amostra significativa. A avaliação morfológica livre de marcadores das DOPs ao longo do tempo supera em parte essa limitação e pode ser avaliada usando uma ampla gama de modalidades de imagem 8,10,17,18, mas mudanças na morfologia podem não ser representativas do espectro de potenciais efeitos da droga, como apoptose e alterações na viabilidade celular. Observamos variabilidade significativa modelo a modelo nas mudanças morfológicas em resposta a drogas. Por exemplo, algumas DOPs aumentarão de área à medida que forem sofrendo apoptose, enquanto outros modelos podem diminuir. Avaliações morfológicas cinéticas têm sido multibatórias com ensaios de desfechos fluorescentes fixos ou de células vivas em um número limitado de estudos18,20. Os métodos aqui apresentados estão entre os primeiros a multiplexar diferentes corantes fluorescentes para avaliar simultaneamente múltiplos efeitos celulares em um sistema de alto rendimento.

Uma das maiores melhorias proporcionadas pela imagem cinética de células vivas é que ela supera as principais limitações associadas aos ensaios de endpoint. Por exemplo, chapear um número igual de PDOs por poço é tecnicamente difícil porque a maioria dos contadores de células automatizados são fechados para objetos menores que 60 μm. A imagem de células vivas permite a normalização para o número ou área de DOP no tempo 0 h em cada poço, que pode então ser usado para ajustar a variação no revestimento entre poços. O ensaio de desfecho padrão-ouro para PDOs é o kit CellTiter-Glo 3D, que mede o ATP como substituto para a viabilidade celular. Temos utilizado extensivamente este ensaio em nossos estudos sobre DOPs ginecológicas e de câncer de próstata 13,21,22,23,24. Além de necessitar de lise celular para medidas de ATP, drogas e outras modalidades terapêuticas podem alterar os níveis de ATP, potencialmente fornecendo uma avaliação imprecisa da resposta terapêutica. A utilização de corantes de imagem de células vivas permite a quantificação de um escopo mais amplo de respostas celulares específicas, como apoptose e citotoxicidade. É importante ressaltar que esses reagentes não perturbam a viabilidade celular ou induzem danos ao DNA, como é o caso do iodeto de propídio; isso permite uma avaliação repetida da resposta da DOP ao longo do tempo. Embora não tenhamos explorado o uso de laranja de acridina (AO) para medidas cinéticas, o mecanismo de ação para AO não deve impedir tal aplicação no futuro.

Os tumores consistem em várias populações celulares distintas com perfis genômicos e morfologias variadas. Devido à complexa heterogeneidade dos modelos de DOP, as respostas individuais da DOP podem variar, e rastrear essas respostas é um desafio. Nosso protocolo fornece um método para avaliar várias métricas de resposta PDO em uma base poço-a-poço. No entanto, algumas considerações técnicas ainda se aplicam à imagem de células vivas. O número de poços de uma placa de 24 poços necessários para semear uma placa de 96 poços dependerá da densidade e da taxa de crescimento de cada modelo de DOP. Como a aglomeração pode confundir a análise de imagens (Figura 4 Suplementar), os modelos de DOP podem precisar de etapas adicionais de processamento antes do plaqueamento. Se necessário, as DOP podem ser cortadas mecanicamente durante o processamento através de pipetagem vigorosa com uma ponta p200 de furo não largo. A digestão enzimática usando TrypLE Express também pode ser empregada antes do plaqueamento para promover a dissociação da DOP e a diminuição da aglomeração. Em nossa experiência, observamos que o comprimento de incubação do TrypLE é altamente variável dependendo do modelo. Portanto, a incubação do TrypLE deve ser otimizada para cada modelo, particularmente se os pesquisadores desejarem obter suspensões unicelulares. O tempo de recuperação antes do início do tratamento pode ser necessário para modelos de DOP que são particularmente sensíveis à digestão enzimática.

Apresentamos métodos para reagentes específicos de imagem de células vivas. Uma limitação na ampla aplicabilidade dos métodos aqui apresentados é a escassez de reagentes compatíveis com a EMB. Para outros corantes/reagentes que ainda não foram otimizados para uso em DOPs, a solução de problemas adicional pode ser necessária para determinar a concentração ideal e minimizar os efeitos do solvente. Dependendo da leitura de interesse (por exemplo, apoptose ou citotoxicidade), o tratamento com um composto conhecido por induzir morte celular, como estaurosporina ou daunorrubicina13 , deve ser usado para otimizar as condições de reagente. Uma consideração adicional é o momento ideal para a integração do corante na cúpula BME. Em nossos experimentos, realizamos uma incubação noturna antes do tratamento para permitir a absorção completa do corante nas cúpulas, bem como determinar a saúde celular basal. Como a intensidade do sinal aumentará com o tempo, os pesquisadores devem realizar estudos piloto com os corantes para determinar o tempo ideal de exposição ao final do experimento para evitar imagens superexpostas. Finalmente, os reagentes não devem interferir nos processos celulares. Por exemplo, corantes que se intercalam no DNA não são compatíveis com imagens cinéticas. No entanto, imagens de células vivas podem ser usadas para normalização de dados em ensaios de endpoint. De fato, apresentamos um método suplementar para quantificar a viabilidade celular e a razão célula morta viável usando AOPI. Neste experimento, o sinal fluorescente é normalizado para o número de DOP para cada poço, conforme determinado por imagem de células vivas no dia 0 (dia de tratamento, Figura 6).

Outra limitação deste trabalho de métodos é a dependência da pipetagem manual para experimentos, o que pode levar a uma maior variância nas réplicas técnicas. Melhorias adicionais na reprodutibilidade dos dados podem ser alcançadas com a adição da automação a outras etapas do processo experimental, como o uso de manipulador automático de líquidos para plaqueamento e dispensação de medicamentos, como demonstrado por outros 8,10. No entanto, essa adição requer um investimento adicional em infraestrutura de pesquisa que pode não estar disponível para todos os pesquisadores. Dada a heterogeneidade na área de DOP para cada modelo, normalizar os resultados para o número inicial de DOP ou área no tempo 0 h ainda é uma abordagem útil com semeadura automatizada.

Uma das principais vantagens do Cytation 5 em relação a outras plataformas de imagem de células vivas é a capacidade de personalizar recursos de imagem e análise. No entanto, o software Cytation 5/Gen5 tem uma curva de aprendizado íngreme e assume que os usuários têm um conhecimento básico de imagem. Um dos objetivos deste artigo de métodos é fornecer instruções passo a passo para diminuir a barreira para que outros pesquisadores incorporem técnicas sofisticadas de imagem de células vivas em seus programas de pesquisa em DOP. Embora as etapas de análise específicas aqui apresentadas sejam para um sistema, os usuários podem aplicar os princípios de multiplexação a outras plataformas, com o entendimento de que a análise downstream pode exigir o uso de software de terceiros, como o NIH ImageJ.

As métricas de análise devem ser escolhidas com base em objetivos experimentais e condições de plaqueamento. Por exemplo, se o experimento for conduzido usando um corante fluorescente para quantificar a morte celular, a intensidade da fluorescência é uma leitura eficaz. A métrica de fluorescência mais efetiva (Fluorescência Total vs. Intensidade Média do Objeto) dependerá das condições de revestimento (Figura 4 Suplementar). Se as DOPs estiverem uniformemente dispersas e tiverem uma morfologia mais circular e coesa, a fluorescência pode ser determinada em uma subpopulação definida de DOP. A função específica no software Gen5 é Análise Celular, e a saída é Intensidade Média do Objeto. No entanto, se o modelo de DOP for aglomerado ou tiver uma morfologia discoesa, recomendamos quantificar o sinal de fluorescência no nível da imagem; esta função pode ser encontrada em Estatísticas de Imagem, e a saída é Intensidade Total de Fluorescência. Embora esse método seja útil para observar mudanças no nível do poço individual, essa métrica não é específica para objetos de interesse e pode mudar erroneamente se as DOPs se moverem para fora do plugue designado durante a duração do experimento. Em cenários em que há detritos significativos ou células únicas mortas, o uso da Análise Celular é sugerido para eliminar qualquer sinal fluorescente que não esteja especificamente associado a uma DOP. Um exemplo de resultados diferenciais usando Análise Celular vs. Estatística de Imagem é apresentado na Figura Suplementar 5.

Para determinar o limiar ideal para a função Estatística de Imagem, a ferramenta de linha pode ser utilizada. Usando a ferramenta de linha, os usuários podem determinar o intervalo de intensidade de fluorescência dentro de uma imagem. Definimos o limite inferior como o valor de 25% do pico de intensidade dentro da imagem. Para exibir as áreas fluorescentes incluídas no limite designado, marque a caixa "Limites atípicos". Pode ser necessário um ajustamento adicional do valor limite inferior.

Um desafio significativo na geração de imagens de células vivas é armazenar a enorme quantidade de dados gerados com cada experimento. Isso é particularmente relevante no caso de culturas DOP, onde Z-Stacks são usados para criar imagens em vários planos focais e gerar uma projeção Z. Existem vários métodos para superar esse problema. Primeiro, garanta a capacidade de armazenamento adequada. Instalamos três discos rígidos de estado sólido com um total de 17 TB. Outras opções incluem a transferência de arquivos experimentais para discos rígidos externos ou armazenamento em rede. Não é recomendável gravar arquivos diretamente no armazenamento baseado em nuvem. Para analisar dados que foram armazenados em uma unidade externa, basta transferir o experimento e os arquivos de imagem para um computador equipado com o software Gen5 (NOTA: arquivos grandes podem levar longos períodos de tempo para transferir). Antes da análise, as imagens devem ser religadas ao experimento. Abra o arquivo de experimento, clique em Protocolo na barra de ferramentas, selecione Opções de Protocolo. Clique em Opções de Salvamento de Imagem e clique em Selecionar nova pasta de imagem. Localize o arquivo de imagem e clique em Selecionar pasta para vincular novamente.

Dependendo dos objetivos do experimento, também pode ser adequado usar o recurso binning dentro do Gen5. A associação diminui o tamanho do arquivo diminuindo o número de pixels, o que leva a uma resolução de imagem mais baixa (consulte a etapa 3.5.3.2). Portanto, o binning não é recomendado se imagens de alta resolução forem necessárias. Ao usar o recurso binning, as configurações de exposição precisarão ser ajustadas. Uma vez que o arquivo experimental tenha sido criado, clique duas vezes na seção Imagem e clique no ícone do microscópio para reabrir o Modo Manual do Imager. Use a função Exposição automática ou ajuste manualmente a exposição conforme necessário.

Em resumo, apresentamos métodos para avaliar a apoptose e a saúde celular de DOPs em resposta a agentes citotóxicos. Estudos futuros são necessários para otimizar métodos e desenvolver estratégias adicionais de análise cinética de DOPs, como outros fenótipos e efeitos de drogas citostáticas em vez de citotóxicas. Um grande obstáculo é a disponibilidade comercial de corantes e reagentes compatíveis com a EMB. Ainda há mais trabalho necessário para entender melhor como a imagem cinética de células vivas pode ser totalmente utilizada para extrair o máximo de dados desses modelos.

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Disclosures

A KWT é coproprietária da Immortagen Inc., CJD é funcionária da Agilent. JSdB atuou em conselhos consultivos e recebeu honorários da Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo e Vertex Pharmaceuticals; é um funcionário do Instituto de Pesquisa do Câncer (ICR), que recebeu financiamento ou outro apoio para seu trabalho de pesquisa da AZ, Astellas, Bayer, Cellcentric, Daiichi, Genentech, Genmab, GSK, Janssen, Merck Serono, MSD, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Pfizer e Vertex, e que tem um interesse comercial em abiraterona, inibição PARP em cânceres defeituosos de reparo de DNA, e inibidores da via PI3K/AKT (sem renda pessoal); foi nomeado como inventor, sem juros financeiros, da patente 8 822 438, apresentada pela Janssen, que abrange o uso de acetato de abiraterona com corticosteroides; tem sido o IC/PI de muitos ensaios clínicos patrocinados pela indústria; e é Investigador Sênior do National Institute for Health Research (NIHR). Nenhum outro autor tem qualquer potencial conflito de interesses a declarar.

Acknowledgments

Somos gratos ao Tissue Procurement Core e à Dra. Kristen Coleman da Universidade de Iowa por fornecer amostras de tumores de pacientes e à Dra. Sofia Gabrilovich no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia por ajudar na geração do modelo DOP. Agradecemos também à Dra. Valerie Salvatico (Agilent, EUA) pela análise crítica do manuscrito. Reconhecemos as seguintes fontes de financiamento: NIH/NCI CA263783 e DOD CDMRP CA220729P1 para KWT; Cancer Research UK, Prostate Cancer UK, Prostate Cancer Foundation e Medical Research Council para JSdB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho ou análise de experimentos ou decisão de publicar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrfuge tube Dot Scientific Inc 1008113
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62.554.100
554 NM LED Cube Agilent 1225012
96-well plate Corning Costar 3596 Prewarmed to 37 °C
96-well plate Agilent 204626-100 Prewarmed to 37 °C
A83-01 Tocris 2939 Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12 Gibco 12634-010 component of organoid culture media
B27 Supplement Gibco 17504044 Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator Agilent BIOSPAG-SN Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader Agilent CYT5PW-SN Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract R&D Systems BME001-10
Daunorubicin HCl Sigma-Aldrich S3035 Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2438
EDTA (0.5 M) Thermo Fisher AM9260G
Forskolin Tocris 1099 Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax Gibco 35050-061 Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES Gibco 15630-080 Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein Gibco AF-100-15-1MG Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein Gibco 100-26-1MG Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein Gibco 120-38-5UG Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution StemCell Technologies 7926 Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP Agilent 1225101
Imaging Filter Cube- TRITC Agilent 1225125
Imaging LED GFP/CFP Agilent 1225001
Incucyte Annexin V Red Dye Sartorius 4641 Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye Sartorius 4633 DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A7250 Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution Fisher-Scientific 13366169 Add 1:50 volume
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636 Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin R&D Systems 6057-NG Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x) Gibco 14190-144
Primocin InvivoGen ant-pm-05 Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1 Pepro Tech 100-03 Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich S6942
TrypLE Express Life Technologies 12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7 Sigma-Aldrich 688000 Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2758 Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)

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References

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