Adeno-associeret virus fremstilles i suspensionscellekultur og renses ved centrifugering med dobbelt iodixanoldensitetsgradient. Trin er inkluderet for at øge det samlede virusudbytte, mindske risikoen for virusudfældning og yderligere koncentrere det endelige virusprodukt. Forventede sluttitre når op på 1012 virale partikler/ml og er egnede til præklinisk in vivo-brug .
Denne protokol beskriver rekombinant adeno-associeret virus (rAAV) produktion og oprensning ved iodixanol densitetsgradientcentrifugering, en serotype-agnostisk metode til rensning af AAV først beskrevet i 1999. rAAV-vektorer anvendes i vid udstrækning i genterapiapplikationer til at levere transgener til forskellige humane celletyper. I dette arbejde produceres den rekombinante virus ved transfektion af Expi293-celler i suspensionskultur med plasmider, der koder for transgen-, vektorkapsid- og adenovirale hjælpergener. Iodixanol densitetsgradientcentrifugering renser fulde AAV-partikler baseret på partikeldensitet. Derudover er tre trin inkluderet i denne nu allestedsnærværende metode for at øge det samlede virusudbytte, mindske risikoen for udfældning på grund af forurenende proteiner og yderligere koncentrere det endelige virusprodukt, henholdsvis: udfældning af virale partikler fra cellemedier ved anvendelse af en opløsning af polyethylenglycol (PEG) og natriumchlorid, indførelsen af en anden runde af iodixanol densitetsgradientcentrifugering, og bufferudskiftning via et centrifugalfilter. Ved hjælp af denne metode er det muligt konsekvent at opnå titere i området 1012 virale partikler/ml af exceptionel renhed til in vivo-brug .
Rekombinante adeno-associerede virale (rAAV) vektorer er almindeligt anvendte værktøjer til behandling af genetiske sygdomme, herunder spinal muskelatrofi, retinal dystrofi og hæmofili A 1,2,3. rAAV-vektorer er konstrueret til at mangle virale gener, der er til stede i vildtype AAV4, en lille, ikke-konvolut icosahedral virus med et lineært enkeltstrenget 4,7 kb DNA-genom. AAV blev først opdaget i 1960’erne som en forurening af adenoviruspræparater5. På trods af sin lille kapsidstørrelse, som begrænser størrelsen af transgenet, der kan pakkes til maksimalt 4,9 kb eksklusive ITR6, er AAV nyttig til transgenlevering, fordi den er ikke-patogen hos mennesker, tillader ekspression af transgen i mange delende og ikke-delende celletyper og har begrænsede immunogene virkninger7.
Som medlemmer af slægten dependoparvovirus er produktionen af rAAV’er afhængig af ekspressionen af hjælpergener, der er til stede i adenovirus eller herpes simplex virus8. Flere strategier til produktion af rAAV er blevet udviklet, men produktion i HEK293-celler transformeret med adenovirale E1A/E1B-hjælpegener er den mest etablerede metode, der anvendes i dag9. Den generelle tilgang til rAAV-produktion begynder med transfektion af HEK293-celler med tre plasmider indeholdende transgenet inden for henholdsvis inverterede terminale gentagelser (ITR’er), AAV-rep – og cap-gener og yderligere adenovirale hjælpergener. Tooghalvfjerds timer efter transfektion høstes og behandles celler for at rense rAAV indeholdende transgenet.
I udviklingen af nye rAAV-vektorer til terapeutiske formål er et vigtigt mål at producere vektorer med øget transduktionseffektivitet. En forøgelse af målcellernes transduktionseffektivitet ville betyde et fald i den nødvendige kliniske dosis rAAV, hvilket ville mindske sandsynligheden for negative immunogene virkninger, der spænder fra antistofmedieret neutralisering til akut toksicitet10,11. For at forbedre transduktionseffektiviteten af rAAV-vektorer kan der foretages ændringer i det pakkede genom eller kapsiden. Levedygtige metoder til at indstille transduktionseffektiviteten via pakket genomdesign omfatter inkorporering af stærke og vævsspecifikke promotorer, tankevækkende udvælgelse af mRNA-behandlingselementer og kodningssekvensoptimering for at forbedre oversættelseseffektiviteten12. Ændringer i kapsiden foretages med det formål at øge tropismen for målhumane celletyper. Bestræbelser på at udvikle nye rAAV-transgenleveringsvektorkapsider er generelt kendetegnet ved fokus på enten rationelt design af AAV-kapsider med specifikke mutationer rettet mod specifikke cellereceptorer eller rettet evolution for at identificere kapsider med tropisme for specifikke celletyper fra kombinatoriske capsidbiblioteker med høj kompleksitet uden at målrette mod en bestemt receptor (selvom nogle grupper kombinerer disse tilgange)13, 14,15. I den rettede evolutionstilgang konstrueres kombinatoriske capsidbiblioteker ved hjælp af en bestemt serotype-rygrad med muterede variable regioner på kapsidet ydre16. Kombinatoriske capsidbiblioteker er ofte konstrueret af AAV-serotyper, der ikke stammer fra mennesker, hvilket reducerer risikoen for allerede eksisterende immunitet under klinisk brug10. Derfor er rensningsmetoder, der kan anvendes på enhver serotype, ideelle til at eliminere behovet for serotypespecifik optimering for de mindre almindeligt anvendte serotyper, der tjener som rygrad for disse biblioteker.
Iodixanol densitetsgradientcentrifugering anvendes til at rense høje titere af rAAV med høj infektivitet17. I denne protokol produceres rAAV i suspensionscellekultur for at reducere mængden af arbejdskraft, der er nødvendig for at producere store titere af AAV. Et centrifugeringstrin er også inkluderet for at rydde cellelysat for at reducere tilstedeværelsen af forurenende proteiner og mindske risikoen for virusudfældning. Denne protokol er en omkostningseffektiv metode til fremstilling af præparater af rAAV med høj renhed, der er egnet til præklinisk brug.
Den dobbelte iodixanol densitetsgradient oprensningsprotokol er den universelle metode, fordi den gælder for alle AAV-mutantvarianter, uanset deres receptorspecificitet. Tidlige metoder til AAV-oprensning var afhængige af partikeldensitet og omfattede isopycnic centrifugering i CsCl og kontinuerlig saccharosedensitetsgradientcentrifugering19. Senere blev serotypespecifikke tilgange udviklet, som gjorde brug af monoklonale antistoffer bundet til Sepharose kolonne20. En ny …
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
Needle nose pliers | |||
Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
Water bath | Set at 37 °C |