Produção e purificação de vírus adenoassociados em cultura de suspensão por centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol para aplicações in vivo
Summary
O vírus adenoassociado é produzido em cultura de células de suspensão e purificado por centrifugação com duplo gradiente de densidade de iodixanol. Etapas são incluídas para aumentar o rendimento total do vírus, diminuir o risco de precipitação do vírus e concentrar ainda mais o produto final do vírus. Os títulos finais esperados atingem 10a 12 partículas virais/mL e são adequados para uso pré-clínico in vivo .
Abstract
Este protocolo descreve a produção e purificação de vírus adenoassociados recombinantes (rAAV) por centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol, um método agnóstico de sorotipo para purificação de AAV descrito pela primeira vez em 1999. Os vetores rAAV são amplamente utilizados em aplicações de terapia gênica para entregar transgenes a vários tipos de células humanas. Neste trabalho, o vírus recombinante é produzido pela transfecção de células Expi293 em cultura de suspensão com plasmídeos que codificam os genes transgene, capsídeo vetorial e adenoviral auxiliar. A centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol purifica partículas completas de AAV com base na densidade de partículas. Além disso, três etapas são incluídas nesta metodologia agora onipresente para aumentar o rendimento total do vírus, diminuir o risco de precipitação devido a proteínas contaminantes e concentrar ainda mais o produto final do vírus, respectivamente: precipitação de partículas virais do meio celular usando uma solução de polietilenoglicol (PEG) e cloreto de sódio, a introdução de uma segunda rodada de centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol, e troca de buffer através de filtro centrífugo. Usando este método, é possível obter consistentemente títulos na faixa de 10a 12 partículas virais/mL de pureza excepcional para uso in vivo .
Introduction
Os vetores virais adenoassociados recombinantes (rAAV) são ferramentas amplamente utilizadas para o tratamento de doenças genéticas, incluindo atrofia muscular espinhal, distrofia retiniana e hemofilia A 1,2,3. Os vetores rAAV são projetados para não ter genes virais presentes no AAV4 selvagem, um vírus icosaédrico pequeno e não envelope com um genoma linear de DNA de fita simples de 4,7 kb. O AAV foi descoberto na década de 1960 como contaminante de preparações de adenovírus5. Apesar de seu pequeno tamanho do capsídeo, que limita o tamanho do transgene que pode ser empacotado a um máximo de 4,9 kb excluindo ITRs6, o AAV é útil para a liberação de transgênicos porque não é patogênico em humanos, permite a expressão de transgênicos em muitos tipos celulares em divisão e não em divisão e tem efeitos imunogênicos limitados7.
Como membros do gênero dependoparvovirus, a produção de rAAVs depende da expressão de genes auxiliares presentes no adenovírus ou herpes simplexvírus 8. Várias estratégias para produzir o rAAV têm sido desenvolvidas, mas a produção em células HEK293 transformadas com os genes auxiliares adenovirais E1A/E1B é o método mais utilizadoatualmente9. A abordagem geral da produção de rAAV começa com a transfecção de células HEK293 com três plasmídeos contendo o transgene dentro de repetições terminais invertidas (ITRs), genes de AAV rep e cap e genes auxiliares adenovirais adicionais, respectivamente. Setenta e duas horas após a transfecção, as células são colhidas e processadas para purificar o rAAV contendo o transgene.
No desenvolvimento de novos vetores de rAAV para fins terapêuticos, um dos principais objetivos é a produção de vetores com maior eficiência de transdução. Um aumento na eficiência de transdução das células-alvo significaria uma diminuição na dose clínica necessária de rAAV, diminuindo, assim, a probabilidade de efeitos imunogênicos adversos que vão desde a neutralização mediada por anticorpos até toxicidades agudas10,11. Para melhorar a eficácia da transdução de vetores rAAV, alterações podem ser feitas no genoma empacotado ou no capsídeo. Métodos viáveis para ajustar a eficácia da transdução via projeto de genoma empacotado incluem a incorporação de promotores fortes e tecido-específicos, seleção cuidadosa de elementos de processamento de mRNA e otimização de sequência de codificação para melhorar a eficiência da tradução12. Alterações no capsídeo são feitas com o objetivo de aumentar o tropismo por tipos celulares humanos alvo. Os esforços para o desenvolvimento de novos capsídeos do vetor de entrega de transgenes rAAV são geralmente caracterizados por um foco no planejamento racional de capsídeos de AAV com mutações específicas visando receptores celulares específicos ou evolução direcionada para identificar capsídeos com tropismo para tipos celulares específicos de bibliotecas combinatórias de capsídeos de alta complexidade sem ter como alvo um receptor específico (embora alguns grupos combinem essas abordagens)13, 14,15. Na abordagem de evolução dirigida, bibliotecas combinatórias do capsídeo são construídas usando uma espinha dorsal do sorotipo particular com regiões variáveis mutadas no exterior do capsídeo16. Bibliotecas combinatórias de capsídeos são frequentemente construídas a partir de sorotipos de AAV não originários de humanos, diminuindo o risco de imunidade preexistente durante o uso clínico10. Portanto, métodos de purificação que podem ser aplicados a qualquer sorotipo são ideais para eliminar a necessidade de otimização sorotipo-específica para os sorotipos menos comumente usados servindo como espinhas dorsais para essas bibliotecas.
A centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol é utilizada para purificar altos títulos de VAr com alta infectividade17. Nesse protocolo, o rAAV é produzido em cultura de células de suspensão para diminuir a quantidade de trabalho necessário para produzir grandes títulos de AAV. Uma etapa de centrifugação também está incluída para limpar o lisado celular para reduzir a presença de proteínas contaminantes e diminuir o risco de precipitação do vírus. Este protocolo é um método custo-efetivo para produzir preparações de rAAV de alta pureza, adequadas para uso pré-clínico.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo de purificação com gradiente de densidade de iodixanol duplo é o método universal, pois é aplicável a qualquer variante mutante do AAV, independentemente de sua especificidade receptora. Os primeiros métodos de purificação de AAV baseavam-se na densidade de partículas e incluíam centrifugação isopicnica em CsCl e centrifugação contínua por gradiente de densidade de sacarose19. Posteriormente, foram desenvolvidas abordagens sorotipo-específicas, que utilizaram anticorpo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum.
Materials
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
References
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