Produzione e purificazione in coltura in sospensione di virus adeno-associati mediante centrifugazione a gradiente di densità di iodixanolo per applicazioni in vivo
Summary
Il virus adeno-associato viene prodotto in coltura cellulare in sospensione e purificato mediante centrifugazione a gradiente di densità a doppio iodixanolo. Sono incluse misure per aumentare la resa totale del virus, diminuire il rischio di precipitazione del virus e concentrare ulteriormente il prodotto finale del virus. I titoli finali attesi raggiungono10-12 particelle virali/mL e sono adatti per l’uso preclinico in vivo .
Abstract
Questo protocollo descrive la produzione e la purificazione di virus adeno-associati ricombinanti (rAAV) mediante centrifugazione a gradiente di densità dello iodio, un metodo sierotipo-agnostico di purificazione dell’AAV descritto per la prima volta nel 1999. I vettori rAAV sono ampiamente utilizzati nelle applicazioni di terapia genica per veicolare transgeni a vari tipi di cellule umane. In questo lavoro, il virus ricombinante è prodotto dalla trasfezione di cellule Expi293 in coltura in sospensione con plasmidi che codificano per il transgene, il capside vettore e i geni helper adenovirali. La centrifugazione a gradiente di densità dello iodixanolo purifica le particelle AAV complete in base alla densità delle particelle. Inoltre, in questa metodologia ormai onnipresente sono incluse tre fasi al fine di aumentare la resa totale del virus, diminuire il rischio di precipitazione a causa della contaminazione delle proteine e concentrare ulteriormente il prodotto virale finale, rispettivamente: precipitazione di particelle virali da terreni cellulari utilizzando una soluzione di polietilenglicole (PEG) e cloruro di sodio, l’introduzione di un secondo ciclo di centrifugazione a gradiente di densità dello iodixanolo, e lo scambio di tamponi tramite un filtro centrifugo. Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere costantemente titoli nell’intervallo di10-12 particelle virali/mL di eccezionale purezza per l’uso in vivo .
Introduction
I vettori virali adeno-associati ricombinanti (rAAV) sono strumenti ampiamente utilizzati per il trattamento di malattie genetiche, tra cui l’atrofia muscolare spinale, la distrofia retinica e l’emofilia A 1,2,3. I vettori rAAV sono ingegnerizzati per mancare dei geni virali presenti nell’AAV4 wild-type, un piccolo virus icosaedrico senza involucro con un genoma lineare di DNA a singolo filamento di 4,7 kb. L’AAV è stato scoperto per la prima volta negli anni ’60 come contaminante dei preparati di adenovirus5. Nonostante le sue piccole dimensioni del capside, che limitano la dimensione del transgene che può essere impacchettato a un massimo di 4,9 kb escludendo ITRs6, l’AAV è utile per il rilascio del transgene perché non è patogeno nell’uomo, consente l’espressione del transgene in molti tipi di cellule in divisione e non in divisione e ha effetti immunogenici limitati7.
Come membri del genere dependoparvovirus, la produzione di rAAV si basa sull’espressione di geni helper presenti nell’adenovirus o nel virus dell’herpes simplex8. Sono state sviluppate diverse strategie per produrre rAAV, ma la produzione in cellule HEK293 trasformate con i geni adenovirali E1A/E1B helper è il metodo più consolidato utilizzato oggi9. L’approccio generale alla produzione di rAAV inizia con la trasfezione di cellule HEK293 con tre plasmidi contenenti il transgene all’interno di ripetizioni terminali invertite (ITR), geni AAV rep e cap e geni helper adenovirali aggiuntivi, rispettivamente. Settantadue ore dopo la trasfezione, le cellule vengono raccolte e processate per purificare rAAV contenente il transgene.
Nello sviluppo di nuovi vettori rAAV per scopi terapeutici, un obiettivo importante è la produzione di vettori con una maggiore efficienza di trasduzione. Un aumento dell’efficienza di trasduzione delle cellule bersaglio significherebbe una diminuzione della dose clinica necessaria di rAAV, diminuendo così la probabilità di effetti immunogenici avversi che vanno dalla neutralizzazione mediata da anticorpi a tossicità acute10,11. Per migliorare l’efficacia di trasduzione dei vettori rAAV, è possibile apportare modifiche al genoma impacchettato o al capside. I metodi praticabili per regolare l’efficacia della trasduzione attraverso la progettazione del genoma impacchettato includono l’incorporazione di promotori forti e tessuto-specifici, una selezione ponderata degli elementi di elaborazione dell’mRNA e l’ottimizzazione della sequenza codificante per migliorare l’efficienza della traduzione12. Le alterazioni del capside vengono effettuate con l’obiettivo di aumentare il tropismo per i tipi di cellule umane bersaglio. Gli sforzi verso lo sviluppo di nuovi capsidi vettoriali di trasporto del transgene rAAV sono generalmente caratterizzati da un focus sulla progettazione razionale di capsidi AAV con mutazioni specifiche che hanno come bersaglio specifici recettori cellulari o sull’evoluzione diretta per identificare capsidi con tropismo per specifici tipi di cellule da librerie di capsidi combinatori ad alta complessità senza mirare a un recettore specifico (sebbene alcuni gruppi combinino questi approcci)13, 14,15. Nell’approccio dell’evoluzione diretta, le librerie combinatorie del capside sono costruite utilizzando una particolare spina dorsale del sierotipo con regioni variabili mutate all’esterno del capside16. Le librerie combinatorie di capsidi sono spesso costruite a partire da sierotipi AAV non originati nell’uomo, riducendo il rischio di immunità preesistente durante l’uso clinico10. Pertanto, i metodi di purificazione che possono essere applicati a qualsiasi sierotipo sono ideali per eliminare la necessità di un’ottimizzazione sierotipo-specifica per i sierotipi meno comunemente usati che fungono da spina dorsale per queste librerie.
La centrifugazione a gradiente di densità dello iodixanolo viene utilizzata per purificare titoli elevati di rAAV con elevata infettività17. In questo protocollo, l’rAAV viene prodotto in coltura cellulare in sospensione per ridurre la quantità di lavoro necessaria per produrre grandi titoli di AAV. È inclusa anche una fase di centrifugazione per eliminare il lisato cellulare per ridurre la presenza di proteine contaminanti e diminuire il rischio di precipitazione del virus. Questo protocollo è un metodo economico per produrre preparati di rAAV ad alta purezza adatti all’uso preclinico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di purificazione a gradiente di densità a doppio iodixanolo è il metodo universale perché è applicabile a qualsiasi variante mutante AAV, indipendentemente dalla loro specificità recettoriale. I primi metodi di purificazione dell’AAV si basavano sulla densità delle particelle e includevano la centrifugazione isopicnica in CsCl e la centrifugazione continua a gradiente di densità del saccarosio19. Successivamente, sono stati sviluppati approcci sierotipo-specifici, che hanno fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno.
Materials
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
References
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