תרבית תרחיף ייצור וטיהור של וירוס הקשור לאדנו על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול עבור יישומי in vivo
Summary
וירוס הקשור באדנו מיוצר בתרבית תאי השעיה ומטוהר על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות יודיקסנול כפולה. צעדים כלולים כדי להגדיל את התפוקה הכוללת של הנגיף, להקטין את הסיכון של משקעים וירוס, ועוד לרכז את המוצר הסופי של הנגיף. הטיטרים הסופיים הצפויים להגיע ל-1012 חלקיקים נגיפיים / מ”ל ומתאימים לשימוש פרה-קליני in vivo .
Abstract
פרוטוקול זה מתאר ייצור וטיהור רקומביננטי של וירוס הקשור באדנו (rAAV) על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול, שיטה אגנוסטית לסרוטיפ לטיהור AAV שתוארה לראשונה בשנת 1999. וקטורי rAAV נמצאים בשימוש נרחב ביישומי ריפוי גנטי כדי להעביר טרנסגנים לסוגי תאים אנושיים שונים. בעבודה זו, הנגיף הרקומביננטי מיוצר על ידי טרנספקציה של תאי Expi293 בתרבית תרחיף עם פלסמידים המקודדים את הגנים הטרנסגנים, קפסיד וקטורי ועוזר אדנו-ויראלי. צנטריפוגת צפיפות יודיקסנול מטהרת חלקיקי AAV מלאים בהתבסס על צפיפות החלקיקים. בנוסף, שלושה שלבים כלולים במתודולוגיה זו הנפוצה כיום על מנת להגדיל את תפוקת הנגיף הכוללת, להפחית את הסיכון למשקעים עקב חלבונים מזהמים, ולרכז עוד יותר את תוצר הנגיף הסופי, בהתאמה: משקעים של חלקיקים נגיפיים ממדיה תאית באמצעות תמיסה של פוליאתילן גליקול (PEG) ונתרן כלורי, הכנסת סבב שני של צנטריפוגה הדרגתית צפיפות יודיקסנול, והחלפת חיץ באמצעות מסנן צנטריפוגלי. באמצעות שיטה זו, ניתן להשיג באופן עקבי טיטרים בטווח של 1012 חלקיקים נגיפיים / מ”ל של טוהר יוצא דופן לשימוש in vivo .
Introduction
וקטורים נגיפיים רקומביננטיים הקשורים באדנו (rAAV) הם כלים בשימוש נרחב לטיפול במחלות גנטיות, כולל ניוון שרירים בעמוד השדרה, ניוון רשתית והמופיליה A 1,2,3. וקטורי rAAV מהונדסים כך שיחסרו גנים נגיפיים הנמצאים ב-AAV4 מסוג פראי, נגיף איקוסהדרלי קטן שאינו מעטפה עם גנום DNA ליניארי חד-גדילי של 4.7 קילו-בתים. AAV התגלה לראשונה בשנות ה-60 של המאה ה-20 כמזהם של תכשירי אדנו-וירוס5. למרות גודל הקפסיד הקטן שלו, המגביל את גודל הטרנסגן שניתן לארוז למקסימום של 4.9 קילו-בתים למעט ITRs6, AAV שימושי להעברת טרנסגנים מכיוון שהוא אינו פתוגני בבני אדם, מאפשר ביטוי של טרנסגן בסוגי תאים מתחלקים ולא מתחלקים רבים, ויש לו השפעות אימונוגניות מוגבלות7.
כחברים בסוג dependoparvovirus, הייצור של rAAVs מסתמך על ביטוי של גנים מסייעים נוכח אדנווירוס או וירוס הרפס סימפלקס8. פותחו מספר אסטרטגיות לייצור rAAV, אך ייצור בתאי HEK293 שעברו טרנספורמציה באמצעות הגנים המסייעים E1A/E1B אדנו-ויראליים הוא השיטה המבוססת ביותר המשמשת כיום9. הגישה הכללית של ייצור rAAV מתחילה עם טרנספקציה של תאי HEK293 עם שלושה פלסמידים המכילים את הטרנסגן בתוך חזרות מסוף הפוך (ITR), AAV rep ו cap גנים, וגנים מסייעים אדנו-ויראליים נוספים, בהתאמה. שבעים ושתיים שעות לאחר הטרנספקציה, תאים נקצרים ומעובדים כדי לטהר rAAV המכיל את הטרנסגן.
בפיתוח וקטורי rAAV חדשים למטרות טיפוליות, מטרה עיקרית היא לייצר וקטורים בעלי יעילות התמרה מוגברת. עלייה ביעילות ההתמרה של תאי המטרה פירושה ירידה במינון הקליני הדרוש של rAAV, ובכך להקטין את הסבירות להשפעות אימונוגניות שליליות החל מנטרול בתיווך נוגדנים ועד רעילות חריפה10,11. כדי לשפר את יעילות הטרנסדוקציה של וקטורי rAAV, ניתן לבצע שינויים בגנום הארוז או בקפסיד. שיטות מעשיות לכוונון יעילות הטרנסדוקציה באמצעות תכנון גנום ארוז כוללות שילוב של מקדמים חזקים וספציפיים לרקמות, בחירה מתחשבת של רכיבי עיבוד mRNA, ואופטימיזציה של רצף קידוד לשיפור יעילות התרגום12. שינויים בקפסיד נעשים במטרה להגדיל את הטרופיזם עבור סוגי תאים אנושיים מטרה. מאמצים לפיתוח קפסידים וקטוריים חדשים של העברת טרנסגנים rAAV מאופיינים בדרך כלל בהתמקדות בתכנון רציונלי של קפסידים AAV עם מוטציות ספציפיות המכוונות לקולטני תאים ספציפיים או באבולוציה מכוונת לזיהוי קפסידים עם טרופיזם עבור סוגי תאים ספציפיים מספריות קפסיד קומבינטוריות בעלות מורכבות גבוהה מבלי להתמקד בקולטן ספציפי אחד (אם כי קבוצות מסוימות משלבות גישות אלה)13, 14,15. בגישת האבולוציה המכוונת, ספריות קפסיד קומבינטוריות נבנות באמצעות עמוד שדרה סרוטיפי מסוים עם אזורים משתנים מוטנטים בצד החיצוני של הקפסיד16. ספריות קפסיד קומבינטוריות בנויות לעתים קרובות מסרוטיפים AAV שאינם מקורם בבני אדם, מה שמקטין את הסיכון לחסינות קיימת במהלך השימוש הקליני10. לכן, שיטות טיהור שניתן ליישם על כל סרוטיפ הן אידיאליות כדי לבטל את הצורך אופטימיזציה ספציפית לסרוטיפ עבור הסרוטיפים הפחות נפוצים המשמשים עמוד שדרה עבור ספריות אלה.
צנטריפוגת צפיפות יודיקסנול משמשת לטיהור טיטרים גבוהים של rAAV עם זיהומיות גבוהה17. בפרוטוקול זה, rAAV מיוצר בתרבית תאי תרחיף כדי להפחית את כמות העבודה הדרושה לייצור טיטרים גדולים של AAV. שלב צנטריפוגה נכלל גם כדי לנקות את התא lysate כדי להפחית את נוכחותם של חלבונים מזהמים ולהפחית את הסיכון של משקעים וירוס. פרוטוקול זה הוא שיטה חסכונית לייצור תכשירים של rAAV ברמת טוהר גבוהה המתאימים לשימוש פרה-קליני.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול טיהור שיפוע צפיפות יודיקסנול כפול הוא השיטה האוניברסלית מכיוון שהוא ישים לכל וריאנטים מוטנטיים AAV, ללא קשר לספציפיות הקולטן שלהם. שיטות מוקדמות לטיהור AAV הסתמכו על צפיפות חלקיקים וכללו צנטריפוגה איזופיקנית ב-CsCl וצנטריפוגה הדרגתית רציפה של צפיפות סוכרוז19. מאוחר יותר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ללא.
Materials
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
References
- Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
- Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S. Focused update on AAV-based gene therapy clinical trials for inherited retinal degeneration. BioDrugs. 34 (6), 763-781 (2020).
- George, L. A., et al. Multiyear factor VIII expression after AAV gene transfer for hemophilia A. N Engl J Med. 385 (21), 1961-1973 (2021).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a vector for gene therapy. Biodrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. c. D. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).
- Zolotukhin, S. Production of recombinant adeno-associated virus vectors. Hum Gene Ther. 16 (5), 551-557 (2005).
- Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N., Ayuso, E. Pharmacology of recombinant adeno-associated virus production. Mol Ther – Methods Clin Dev. 8, 166-180 (2018).
- Costa-Verdera, H., et al. Understanding and Tackling immune responses to adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 836-852 (2023).
- Ertl, H. C. J. Mitigating serious adverse events in gene therapy with AAV Vectors: Vector dose and immunosuppression. Drugs. 83 (4), 287-298 (2023).
- Pupo, A., et al. AAV vectors: The Rubik’s cube of human gene therapy. Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).
- Marsic, D., et al. Vector design tour de force: Integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants. Mol Ther. 22 (11), 1900-1909 (2014).
- Grimm, D., Zolotukhin, S. E Pluribus Unum: 50 Years of research, millions of viruses, and one goal-tailored acceleration of AAV evolution. Mol Ther. 23 (12), 1819-1831 (2015).
- Biswas, M., et al. Engineering and in vitro selection of a novel AAV3B variant with high hepatocyte tropism and reduced seroreactivity. Mol Ther – Methods Clin Dev. 19, 347-361 (2020).
- Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol Ther. 8 (1), 151-157 (2003).
- Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free production of laboratory grade AAV and purification by iodixanol density gradient centrifugation. Mol Ther – Methods Clin Dev. 10, 1-7 (2018).
- Chan, C., Harris, K. K., Zolotukhin, S., Keeler, G. D. Rational design of AAV-rh74, AAV3B, and AAV8 with limited liver targeting. Viruses. 15 (11), 2168 (2023).
- Schmidt, O. W., Cooney, M. K., Foy, H. M. Adeno-associated virus in adenovirus type 3 conjunctivitis. Infect Immun. 11 (6), 1362-1370 (1975).
- Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).
- Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
- Clark, K. R., Liu, X., Mcgrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
- Debelak, D., et al. Cation-exchange high-performance liquid chromatography of recombinant adeno-associated virus type 2. J Chromatogr B Biomed Sci App. 740 (2), 195-202 (2000).
- Burova, E., Ioffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Ther. 12 (1), S5-S17 (2005).
- Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnol Bioeng. 117 (10), 3199-3211 (2020).
- Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).
- Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2022).
- Chamberlain, K., Riyad, J. M., Weber, T. Expressing transgenes that exceed the packaging capacity of adeno-associated virus capsids. Hum Gene Ther Methods. 27 (1), 1-12 (2016).
- Green, E. A., Hamaker, N. K., Lee, K. H. Comparison of vector elements and process conditions in transient and stable suspension HEK293 platforms using SARS-CoV-2 receptor binding domain as a model protein. BMC Biotechnol. 23 (1), 7 (2023).
- Erbacher, P., Zou, S., Bettinger, T., Steffan, A. M., Remy, J. S. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: Biophysical characteristics and transfection ability. Pharm Res. 15 (9), 1332-1339 (1998).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Hum Gene Ther. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).
- Wright, J. F., et al. Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation. Mol Ther. 12 (1), 171-178 (2005).
- Gruntman, A. M., et al. Stability and compatibility of recombinant adeno-associated virus under conditions commonly encountered in human gene therapy trials. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 71-76 (2015).
- Srivastava, A. Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized AAV vectors for human gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).
- Mullard, A. FDA approves first gene therapy for Duchenne muscular dystrophy, despite internal objections. Nat Rev Drug Discov. 22 (8), 610-610 (2023).
- Center for Biologics Evaluation and Research. Approved Cellular and Gene Therapy Products. US Food Drug Adm. , (2023).
- Kang, L., et al. AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges. J Control Release Off J Control Release Soc. 355, 458-473 (2023).
- De Wolf, D., Singh, K., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Hemophilia gene therapy: The end of the beginning. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 782-792 (2023).
- Simons, E. J., Trapani, I. The opportunities and challenges of gene therapy for treatment of inherited forms of vision and hearing loss. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 808-820 (2023).
