إنتاج ثقافة التعليق وتنقية الفيروسات المرتبطة بالغدين بواسطة الطرد المركزي المتدرج لكثافة اليوديكسانول للتطبيقات في الجسم الحي
Summary
يتم إنتاج الفيروس المرتبط بالغدي في زراعة الخلايا المعلقة ويتم تنقيته عن طريق الطرد المركزي المتدرج لكثافة اليوديكسانول المزدوج. يتم تضمين خطوات لزيادة إجمالي محصول الفيروس ، وتقليل خطر هطول الأمطار ، وزيادة تركيز المنتج النهائي للفيروس. يصل التتر النهائي المتوقع إلى 1012 جسيما فيروسيا / مل وهو مناسب للاستخدام قبل السريري في الجسم الحي .
Abstract
يصف هذا البروتوكول إنتاج الفيروس الغدي المؤتلف وتنقيته بواسطة الطرد المركزي المتدرج لكثافة اليوديكسانول ، وهي طريقة محايدة مصلية لتنقية AAV تم وصفها لأول مرة في عام 1999. تستخدم ناقلات rAAV على نطاق واسع في تطبيقات العلاج الجيني لتوصيل جينات التحوير إلى أنواع مختلفة من الخلايا البشرية. في هذا العمل ، يتم إنتاج الفيروس المؤتلف عن طريق نقل خلايا Expi293 في مزرعة معلقة مع البلازميدات التي تشفر الجينات المحورة ، والقفيصة المتجهة ، والجينات المساعدة للفيروسات الغدية. يعمل الطرد المركزي المتدرج لكثافة اليوديكسانول على تنقية جزيئات AAV الكاملة بناء على كثافة الجسيمات. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تضمين ثلاث خطوات في هذه المنهجية المنتشرة في كل مكان الآن من أجل زيادة إجمالي إنتاج الفيروس ، وتقليل خطر هطول الأمطار بسبب البروتينات الملوثة ، وزيادة تركيز المنتج النهائي للفيروس ، على التوالي: ترسيب الجسيمات الفيروسية من وسائط الخلية باستخدام محلول البولي إيثيلين جلايكول (PEG) وكلوريد الصوديوم ، إدخال جولة ثانية من الطرد المركزي المتدرج لكثافة اليوديكسانول ، وتبادل المخزن المؤقت عبر مرشح الطرد المركزي. باستخدام هذه الطريقة ، من الممكن تحقيق التتر باستمرار في حدود 1012 جسيما فيروسيا / مل من النقاء الاستثنائي للاستخدام في الجسم الحي .
Introduction
النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي المؤتلف (rAAV) هي أدوات تستخدم على نطاق واسع لعلاج الأمراض الوراثية ، بما في ذلك ضمور العضلات الشوكي وضمور الشبكية والهيموفيليا A1،2،3. تم تصميم ناقلات rAAV لتفتقر إلى الجينات الفيروسية الموجودة في AAV4 من النوع البري ، وهو فيروس صغير غير مغلف مع جينوم DNA خطي أحادي الشريط 4.7 كيلو بايت. تم اكتشاف AAV لأول مرة في ستينيات القرن العشرين كملوث لمستحضرات الفيروس الغدي5. وعلى الرغم من صغر حجم قفيصة النسخة، الذي يحد من حجم جين التحوير الذي يمكن تعبئته بحد أقصى قدره 4,9 كيلوبايت باستثناء لوائح الاتصالات الدولية6، فإن AAV مفيد لتوصيل الجينات المحورة لأنه غير ممرض في البشر، ويسمح بالتعبير عن الجينات المحورة في العديد من أنواع الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة، وله تأثيرات مناعية محدودة7.
كأعضاء في جنس الفيروس المعتمد ، يعتمد إنتاج rAAVs على التعبير عن الجينات المساعدة الموجودة في الفيروس الغدي أو فيروس الهربس البسيط8. تم تطوير العديد من الاستراتيجيات لإنتاج rAAV ، ولكن الإنتاج في خلايا HEK293 التي تم تحويلها باستخدام الجينات المساعدة E1A / E1B الفيروسية الغدية هي الطريقة الأكثر رسوخا المستخدمة اليوم9. يبدأ النهج العام لإنتاج rAAV بنقل خلايا HEK293 بثلاثة بلازميدات تحتوي على جين التحوير داخل التكرارات الطرفية المقلوبة (ITRs) ، وجينات AAV rep و cap ، وجينات مساعدة إضافية للفيروسات الغدية ، على التوالي. بعد اثنتين وسبعين ساعة من النقل ، يتم حصاد الخلايا ومعالجتها لتنقية rAAV التي تحتوي على جين التحوير.
في تطوير ناقلات rAAV جديدة للأغراض العلاجية ، يتمثل الهدف الرئيسي في إنتاج نواقل ذات كفاءة نقل متزايدة. إن الزيادة في كفاءة نقل الخلايا المستهدفة تعني انخفاضا في الجرعة السريرية اللازمة من rAAV ، مما يقلل من احتمال حدوث تأثيرات مناعية ضارة تتراوح من التحييد بوساطة الأجسام المضادة إلى السمية الحادة10,11. لتحسين فعالية نقل ناقلات rAAV ، يمكن إجراء تعديلات على الجينوم المعبأ أو على القفيصة. تشمل الطرق القابلة للتطبيق لضبط فعالية النقل عبر تصميم الجينوم المعبأ دمج محفزات قوية ومحددة الأنسجة ، والاختيار المدروس لعناصر معالجة mRNA ، وتحسين تسلسل الترميز لتحسين كفاءة الترجمة12. يتم إجراء تعديلات على القفيصة بهدف زيادة الانتحاء لأنواع الخلايا البشرية المستهدفة. تتميز الجهود المبذولة لتطوير قفيصات ناقلة جديدة لتوصيل الجينات المحورة rAAV بشكل عام بالتركيز إما على التصميم العقلاني لقفيصات AAV مع طفرات محددة تستهدف مستقبلات خلايا معينة أو التطور الموجه لتحديد القفيصات ذات الانتحاء لأنواع معينة من الخلايا من مكتبات قفيصة اندماجية عالية التعقيد دون استهداف مستقبل واحد محدد (على الرغم من أن بعض المجموعات تجمع بين هذه الأساليب)13 ، 14,15. في نهج التطور الموجه ، يتم إنشاء مكتبات القفيصة التوافقية باستخدام عمود فقري مصلي معين مع مناطق متغيرة متحولة على السطح الخارجيللقفيصة 16. غالبا ما يتم إنشاء مكتبات القفيصة التوافقية من الأنماط المصلية AAV التي لا تنشأ في البشر ، مما يقلل من خطر المناعة الموجودة مسبقا أثناء الاستخدام السريري10. لذلك ، تعتبر طرق التنقية التي يمكن تطبيقها على أي نمط مصلي مثالية للتخلص من الحاجة إلى تحسين النمط المصلي الخاص بالأنماط المصلية الأقل استخداما والتي تعمل كأعمدة أساسية لهذه المكتبات.
يستخدم الطرد المركزي المتدرج لكثافة يوديكسانول لتنقية التتر العالي من rAAV مع عدوى عالية17. في هذا البروتوكول ، يتم إنتاج rAAV في زراعة الخلايا المعلقة لتقليل كمية العمالة اللازمة لإنتاج عيارات كبيرة من AAV. يتم أيضا تضمين خطوة الطرد المركزي لمسح تحلل الخلايا لتقليل وجود البروتينات الملوثة وتقليل خطر ترسيب الفيروس. هذا البروتوكول هو طريقة فعالة من حيث التكلفة لإنتاج مستحضرات rAAV عالية النقاء مناسبة للاستخدام قبل السريري.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول تنقية تدرج كثافة اليوديكسانول المزدوج هو الطريقة العالمية لأنه ينطبق على أي متغيرات متحولة AAV ، بغض النظر عن خصوصية مستقبلاتها. اعتمدت الطرق المبكرة لتنقية AAV على كثافة الجسيمات وشملت الطرد المركزي isopycnic في CsCl والطرد المركزي المتدرج المستمر لكثافة السكروز19. في وقت ل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي.
Materials
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
References
- Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
- Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S. Focused update on AAV-based gene therapy clinical trials for inherited retinal degeneration. BioDrugs. 34 (6), 763-781 (2020).
- George, L. A., et al. Multiyear factor VIII expression after AAV gene transfer for hemophilia A. N Engl J Med. 385 (21), 1961-1973 (2021).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a vector for gene therapy. Biodrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. c. D. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).
- Zolotukhin, S. Production of recombinant adeno-associated virus vectors. Hum Gene Ther. 16 (5), 551-557 (2005).
- Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N., Ayuso, E. Pharmacology of recombinant adeno-associated virus production. Mol Ther – Methods Clin Dev. 8, 166-180 (2018).
- Costa-Verdera, H., et al. Understanding and Tackling immune responses to adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 836-852 (2023).
- Ertl, H. C. J. Mitigating serious adverse events in gene therapy with AAV Vectors: Vector dose and immunosuppression. Drugs. 83 (4), 287-298 (2023).
- Pupo, A., et al. AAV vectors: The Rubik’s cube of human gene therapy. Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).
- Marsic, D., et al. Vector design tour de force: Integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants. Mol Ther. 22 (11), 1900-1909 (2014).
- Grimm, D., Zolotukhin, S. E Pluribus Unum: 50 Years of research, millions of viruses, and one goal-tailored acceleration of AAV evolution. Mol Ther. 23 (12), 1819-1831 (2015).
- Biswas, M., et al. Engineering and in vitro selection of a novel AAV3B variant with high hepatocyte tropism and reduced seroreactivity. Mol Ther – Methods Clin Dev. 19, 347-361 (2020).
- Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol Ther. 8 (1), 151-157 (2003).
- Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free production of laboratory grade AAV and purification by iodixanol density gradient centrifugation. Mol Ther – Methods Clin Dev. 10, 1-7 (2018).
- Chan, C., Harris, K. K., Zolotukhin, S., Keeler, G. D. Rational design of AAV-rh74, AAV3B, and AAV8 with limited liver targeting. Viruses. 15 (11), 2168 (2023).
- Schmidt, O. W., Cooney, M. K., Foy, H. M. Adeno-associated virus in adenovirus type 3 conjunctivitis. Infect Immun. 11 (6), 1362-1370 (1975).
- Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).
- Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
- Clark, K. R., Liu, X., Mcgrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
- Debelak, D., et al. Cation-exchange high-performance liquid chromatography of recombinant adeno-associated virus type 2. J Chromatogr B Biomed Sci App. 740 (2), 195-202 (2000).
- Burova, E., Ioffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Ther. 12 (1), S5-S17 (2005).
- Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnol Bioeng. 117 (10), 3199-3211 (2020).
- Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).
- Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2022).
- Chamberlain, K., Riyad, J. M., Weber, T. Expressing transgenes that exceed the packaging capacity of adeno-associated virus capsids. Hum Gene Ther Methods. 27 (1), 1-12 (2016).
- Green, E. A., Hamaker, N. K., Lee, K. H. Comparison of vector elements and process conditions in transient and stable suspension HEK293 platforms using SARS-CoV-2 receptor binding domain as a model protein. BMC Biotechnol. 23 (1), 7 (2023).
- Erbacher, P., Zou, S., Bettinger, T., Steffan, A. M., Remy, J. S. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: Biophysical characteristics and transfection ability. Pharm Res. 15 (9), 1332-1339 (1998).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Hum Gene Ther. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).
- Wright, J. F., et al. Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation. Mol Ther. 12 (1), 171-178 (2005).
- Gruntman, A. M., et al. Stability and compatibility of recombinant adeno-associated virus under conditions commonly encountered in human gene therapy trials. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 71-76 (2015).
- Srivastava, A. Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized AAV vectors for human gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).
- Mullard, A. FDA approves first gene therapy for Duchenne muscular dystrophy, despite internal objections. Nat Rev Drug Discov. 22 (8), 610-610 (2023).
- Center for Biologics Evaluation and Research. Approved Cellular and Gene Therapy Products. US Food Drug Adm. , (2023).
- Kang, L., et al. AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges. J Control Release Off J Control Release Soc. 355, 458-473 (2023).
- De Wolf, D., Singh, K., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Hemophilia gene therapy: The end of the beginning. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 782-792 (2023).
- Simons, E. J., Trapani, I. The opportunities and challenges of gene therapy for treatment of inherited forms of vision and hearing loss. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 808-820 (2023).
