Culture en suspension, production et purification de virus adéno-associés par centrifugation par gradient de densité d’iodixanol pour des applications in vivo
Summary
Le virus adéno-associé est produit en culture cellulaire en suspension et purifié par centrifugation à double gradient de densité d’iodixanol. Des étapes sont incluses pour augmenter le rendement total du virus, réduire le risque de précipitation du virus et concentrer davantage le produit viral final. Les titres finaux attendus atteignent 10à 12 particules virales/mL et conviennent à une utilisation préclinique in vivo .
Abstract
Ce protocole décrit la production et la purification de virus adéno-associés recombinants (rAAV) par centrifugation par gradient de densité d’iodixanol, une méthode de purification de l’AAV indépendante du sérotype décrite pour la première fois en 1999. Les vecteurs rAAV sont largement utilisés dans les applications de thérapie génique pour délivrer des transgènes à divers types de cellules humaines. Dans ce travail, le virus recombinant est produit par transfection de cellules Expi293 en culture en suspension avec des plasmides codant pour les gènes auxiliaires du transgène, de la capside vectorielle et de l’adénoviral. La centrifugation par gradient de densité d’iodixanol purifie les particules AAV complètes en fonction de la densité des particules. De plus, trois étapes sont incluses dans cette méthodologie désormais omniprésente afin d’augmenter le rendement total du virus, de diminuer le risque de précipitation due aux protéines contaminantes et de concentrer davantage le produit viral final, respectivement : précipitation des particules virales à partir de milieux cellulaires à l’aide d’une solution de polyéthylène glycol (PEG) et de chlorure de sodium, introduction d’un deuxième cycle de centrifugation par gradient de densité d’iodixanol, et échange de tampon via un filtre centrifuge. En utilisant cette méthode, il est possible d’obtenir des titres constants de l’ordre de 10à 12 particules virales/mL d’une pureté exceptionnelle pour une utilisation in vivo .
Introduction
Les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV) sont des outils largement utilisés pour le traitement des maladies génétiques, notamment l’amyotrophie spinale, la dystrophie rétinienne et l’hémophilie A 1,2,3. Les vecteurs rAAV sont conçus pour ne pas contenir de gènes viraux présents dans l’AAV4 de type sauvage, un petit virus icosaédrique sans enveloppe avec un génome linéaire monocaténaire de 4,7 kb. L’AAV a été découvert pour la première fois dans les années 1960 en tant que contaminant des préparations d’adénovirus5. Malgré sa petite taille de capside, qui limite la taille du transgène pouvant être emballé à un maximum de 4,9 kb hors RTI6, l’AAV est utile pour l’administration de transgènes car il est non pathogène chez l’homme, permet l’expression du transgène dans de nombreux types de cellules divisées et non divisées et a des effets immunogènes limités7.
En tant que membres du genre dependoparvovirus, la production de rAAV repose sur l’expression de gènes auxiliaires présents dans l’adénovirus ou le virus de l’herpès simplex8. Plusieurs stratégies de production de rAAV ont été développées, mais la production dans les cellules HEK293 transformées avec les gènes auxiliaires adénoviraux E1A/E1B est la méthode la plus établie utilisée aujourd’hui9. L’approche générale de la production de rAAV commence par la transfection de cellules HEK293 avec trois plasmides contenant le transgène dans des répétitions terminales inversées (ITR), des gènes AAV rep et cap , et des gènes adénoviraux auxiliaires supplémentaires, respectivement. Soixante-douze heures après la transfection, les cellules sont récoltées et traitées pour purifier le rAAV contenant le transgène.
Dans le développement de nouveaux vecteurs rAAV à des fins thérapeutiques, l’un des principaux objectifs est de produire des vecteurs avec une efficacité de transduction accrue. Une augmentation de l’efficacité de transduction des cellules cibles signifierait une diminution de la dose clinique nécessaire de rAAV, diminuant ainsi la probabilité d’effets immunogènes indésirables allant de la neutralisation médiée par les anticorps aux toxicités aiguës10,11. Pour améliorer l’efficacité de la transduction des vecteurs rAAV, des modifications peuvent être apportées au génome emballé ou à la capside. Les méthodes viables pour ajuster l’efficacité de la transduction via la conception de génomes emballés comprennent l’incorporation de promoteurs forts et spécifiques aux tissus, la sélection réfléchie des éléments de traitement de l’ARNm et l’optimisation de la séquence codante pour améliorer l’efficacité de la traduction12. Les modifications de la capside sont effectuées dans le but d’augmenter le tropisme pour les types de cellules humaines cibles. Les efforts visant à développer de nouvelles capsides vectorielles de livraison de transgènes rAAV sont généralement caractérisés par une focalisation sur la conception rationnelle de capsides AAV avec des mutations spécifiques ciblant des récepteurs cellulaires spécifiques ou sur l’évolution dirigée pour identifier des capsides avec tropisme pour des types cellulaires spécifiques à partir de bibliothèques de capsides combinatoires de haute complexité sans cibler un récepteur spécifique (bien que certains groupes combinent ces approches)13, 14,15. Dans l’approche d’évolution dirigée, les banques de capsides combinatoires sont construites à l’aide d’un squelette de sérotype particulier avec des régions variables mutées sur la capside extérieure16. Les banques de capsides combinatoires sont souvent construites à partir de sérotypes AAV non originaires de l’homme, ce qui diminue le risque d’immunité préexistante lors de l’utilisation clinique10. Par conséquent, les méthodes de purification qui peuvent être appliquées à n’importe quel sérotype sont idéales pour éliminer le besoin d’optimisation spécifique au sérotype pour les sérotypes les moins couramment utilisés servant de squelette à ces bibliothèques.
La centrifugation par gradient de densité d’iodixanol est utilisée pour purifier des titres élevés de rAAV à forte infectiosité17. Dans ce protocole, le rAAV est produit en culture cellulaire en suspension pour réduire la quantité de travail nécessaire pour produire de gros titres d’AAV. Une étape de centrifugation est également incluse pour éliminer le lysat cellulaire afin de réduire la présence de protéines contaminantes et de diminuer le risque de précipitation virale. Ce protocole est une méthode rentable pour produire des préparations de rAAV de haute pureté adaptées à un usage préclinique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole de purification à double gradient de densité d’iodixanol est la méthode universelle car il est applicable à tous les variants mutants AAV, quelle que soit leur spécificité de récepteur. Les premières méthodes de purification des AAV reposaient sur la densité des particules et comprenaient la centrifugation isopycnique dans le CsCl et la centrifugation continue par gradient de densité du saccharose19. Plus tard, des approches spécifiques au sérotype ont été développé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aucun.
Materials
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
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