Herstellung und Aufreinigung von Suspensionskulturen von Adeno-assoziierten Viren durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation für In-vivo-Anwendungen
Summary
Adeno-assoziiertes Virus wird in Suspensionszellkultur hergestellt und durch doppelte Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Es sind Schritte enthalten, um die Gesamtvirusausbeute zu erhöhen, das Risiko von Virusausfällungen zu verringern und das endgültige Virusprodukt weiter zu konzentrieren. Die erwarteten Endtiter erreichen 10bis 12 Viruspartikel/ml und sind für die präklinische In-vivo-Anwendung geeignet.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Aufreinigung rekombinanter Adeno-assoziierter Viren (rAAV) durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation, eine serotypagnostische Methode zur Aufreinigung von AAV, die erstmals 1999 beschrieben wurde. rAAV-Vektoren werden häufig in Gentherapieanwendungen verwendet, um Transgene an verschiedene menschliche Zelltypen zu liefern. In dieser Arbeit wird das rekombinante Virus durch Transfektion von Expi293-Zellen in Suspensionskultur mit Plasmiden hergestellt, die für das Transgen, das Vektorkapsid und die adenoviralen Helfergene kodieren. Die Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation reinigt vollständige AAV-Partikel basierend auf der Partikeldichte. Darüber hinaus sind drei Schritte in dieser inzwischen allgegenwärtigen Methodik enthalten, um die Gesamtvirusausbeute zu erhöhen, das Risiko von Ausfällungen aufgrund kontaminierender Proteine zu verringern bzw. das Endprodukt des Virus weiter zu konzentrieren: Ausfällung von Viruspartikeln aus Zellmedien unter Verwendung einer Lösung aus Polyethylenglykol (PEG) und Natriumchlorid, Einführung einer zweiten Runde der Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation, und Pufferaustausch über einen Zentrifugalfilter. Mit dieser Methode ist es möglich, konsistent Titer im Bereich von 10bis 12 Viruspartikeln/ml von außergewöhnlicher Reinheit für die In-vivo-Anwendung zu erreichen.
Introduction
Rekombinante adeno-assoziierte virale (rAAV) Vektoren sind weit verbreitete Instrumente zur Behandlung genetischer Erkrankungen, einschließlich spinaler Muskelatrophie, Netzhautdystrophie und Hämophilie A 1,2,3. rAAV-Vektoren sind so konstruiert, dass ihnen virale Gene fehlen, die in Wildtyp-AAV4 vorhanden sind, einem kleinen, nicht umhüllenden Ikosaedervirus mit einem linearen einzelsträngigen 4,7 kb DNA-Genom. AAV wurde erstmals in den 1960er Jahren als Kontaminante von Adenovirus-Präparaten entdeckt5. Trotz seiner kleinen Kapsidgröße, die die Größe des Transgens, das ohne ITRs verpackt werden kann, auf maximal 4,9 kb begrenzt6, ist AAV für die Transgenabgabe nützlich, da es beim Menschen nicht pathogen ist, die Expression des Transgens in vielen sich teilenden und nicht teilenden Zelltypen ermöglicht und begrenzte immunogene Wirkungen hat7.
Als Mitglieder der Gattung Dependoparvovirus hängt die Produktion von rAAVs von der Expression von Helfergenen ab, die im Adenovirus oder Herpes-simplex-Virusvorhanden sind 8. Es wurden mehrere Strategien zur Herstellung von rAAV entwickelt, aber die Produktion in HEK293-Zellen, die mit den adenoviralen E1A/E1B-Helfergenen transformiert wurden, ist die etablierteste Methode, die heute verwendet wird9. Der allgemeine Ansatz der rAAV-Produktion beginnt mit der Transfektion von HEK293-Zellen mit drei Plasmiden, die das Transgen in invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs), AAV-Rep- und Cap-Genen bzw. zusätzlichen adenoviralen Helfergenen enthalten. Zweiundsiebzig Stunden nach der Transfektion werden die Zellen geerntet und verarbeitet, um rAAV zu reinigen, das das Transgen enthält.
Bei der Entwicklung neuer rAAV-Vektoren für therapeutische Zwecke ist ein wesentliches Ziel die Herstellung von Vektoren mit erhöhter Transduktionseffizienz. Eine Erhöhung der Transduktionseffizienz von Zielzellen würde eine Verringerung der erforderlichen klinischen Dosis von rAAV bedeuten und somit die Wahrscheinlichkeit unerwünschter immunogener Wirkungen verringern, die von Antikörper-vermittelter Neutralisation bis hin zu akuten Toxizitäten reichen10,11. Um die Transduktionseffizienz von rAAV-Vektoren zu verbessern, können Änderungen am verpackten Genom oder am Kapsid vorgenommen werden. Praktikable Methoden zur Abstimmung der Transduktionswirksamkeit über das Design des verpackten Genoms umfassen den Einbau starker und gewebespezifischer Promotoren, die sorgfältige Auswahl von mRNA-Verarbeitungselementen und die Optimierung der Kodierungssequenz zur Verbesserung der Translationseffizienz12. Veränderungen am Kapsid werden mit dem Ziel vorgenommen, den Tropismus für menschliche Zielzelltypen zu erhöhen. Die Bemühungen zur Entwicklung neuer rAAV-Transgen-Verabreichungsvektor-Kapside sind im Allgemeinen gekennzeichnet durch einen Fokus entweder auf das rationale Design von AAV-Kapsiden mit spezifischen Mutationen, die auf spezifische Zellrezeptoren abzielen, oder auf die gerichtete Evolution zur Identifizierung von Kapsiden mit Tropismus für bestimmte Zelltypen aus hochkomplexen kombinatorischen Kapsidbibliotheken, ohne auf einen bestimmten Rezeptor abzuzielen (obwohl einige Gruppen diese Ansätze kombinieren)13, 14,15. Beim gerichteten Evolutionsansatz werden kombinatorische Kapsidbibliotheken unter Verwendung eines bestimmten Serotyp-Rückgrats mit mutierten variablen Regionen an der Kapsidaußenseitekonstruiert 16. Kombinatorische Kapsidbibliotheken werden häufig aus AAV-Serotypen konstruiert, die nicht vom Menschen stammen, wodurch das Risiko einer bereits bestehenden Immunität während der klinischen Anwendung verringertwird 10. Daher sind Aufreinigungsmethoden, die auf jeden Serotyp angewendet werden können, ideal, um die Notwendigkeit einer serotypspezifischen Optimierung für die weniger häufig verwendeten Serotypen, die als Rückgrat für diese Bibliotheken dienen, zu eliminieren.
Die Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation wird verwendet, um hohe Titer von rAAV mit hoher Infektiositätzu reinigen 17. In diesem Protokoll wird rAAV in Suspensionszellkultur hergestellt, um den Arbeitsaufwand für die Herstellung großer AAV-Titer zu verringern. Ein Zentrifugationsschritt ist ebenfalls enthalten, um Zelllysat zu reinigen, um das Vorhandensein kontaminierender Proteine zu reduzieren und das Risiko einer Virusausfällung zu verringern. Dieses Protokoll ist eine kostengünstige Methode zur Herstellung von Präparaten aus hochreinem rAAV, die für den präklinischen Einsatz geeignet sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll zur doppelten Iodixanol-Dichtegradientenreinigung ist die universelle Methode, da es auf alle AAV-Mutantenvarianten anwendbar ist, unabhängig von ihrer Rezeptorspezifität. Frühe Methoden der AAV-Reinigung beruhten auf der Partikeldichte und umfassten die isopyknische Zentrifugation in CsCl und die kontinuierliche Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation19. Später wurden Serotyp-spezifische Ansätze entwickelt, bei denen monoklonale Antikörper verwendet wurden, die an Sepharoses…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nichts.
Materials
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
References
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