सस्पेंशन कल्चर प्रोडक्शन एंड प्यूरीफिकेशन ऑफ एडेनो-एसोसिएटेड वायरस बाय Iodixanol डेंसिटी ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन इन विवो एप्लीकेशंस
Summary
एडेनो-जुड़े वायरस निलंबन सेल संस्कृति में उत्पन्न होते हैं और डबल आयोडिक्सानोल घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शुद्ध होते हैं। कुल वायरस उपज बढ़ाने, वायरस वर्षा के जोखिम को कम करने और अंतिम वायरस उत्पाद को और अधिक केंद्रित करने के लिए कदम शामिल किए गए हैं। अपेक्षित अंतिम टाइटर्स 1012 वायरल कणों/एमएल तक पहुंचते हैं और विवो उपयोग में पूर्व-नैदानिक के लिए उपयुक्त होते हैं।
Abstract
यह प्रोटोकॉल पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस (आरएएवी) उत्पादन और आयोडिक्सानॉल घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शुद्धिकरण का वर्णन करता है, जो पहली बार 1999 में वर्णित एएवी को शुद्ध करने की एक सीरोटाइप-अज्ञेयवादी विधि है। आरएएवी वैक्टर का व्यापक रूप से जीन थेरेपी अनुप्रयोगों में विभिन्न मानव कोशिका प्रकारों में ट्रांसजीन देने के लिए उपयोग किया जाता है। इस काम में, पुनः संयोजक वायरस ट्रांसजीन, वेक्टर कैप्सिड और एडेनोवायरल हेल्पर जीन को एन्कोडिंग करने वाले प्लास्मिड के साथ निलंबन संस्कृति में Expi293 कोशिकाओं के अभिकर्मक द्वारा निर्मित होता है। Iodixanol घनत्व ढाल centrifugation कण घनत्व के आधार पर पूर्ण AAV कणों को शुद्ध करता है। इसके अतिरिक्त, कुल वायरस उपज बढ़ाने के लिए इस अब-सर्वव्यापी पद्धति में तीन चरण शामिल हैं, दूषित प्रोटीन के कारण वर्षा के जोखिम को कम करते हैं, और क्रमशः अंतिम वायरस उत्पाद को और अधिक केंद्रित करते हैं: पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी) और सोडियम क्लोराइड के समाधान का उपयोग करके सेल मीडिया से वायरल कणों की वर्षा, आयोडिक्सानॉल घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के दूसरे दौर की शुरूआत, और एक केन्द्रापसारक फिल्टर के माध्यम से बफर विनिमय। इस पद्धति का उपयोग करके, विवो उपयोग के लिए असाधारण शुद्धता के 1012 वायरल कणों/एमएल की सीमा में टाइटर्स को लगातार प्राप्त करना संभव है।
Introduction
पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरल (आरएएवी) वैक्टर व्यापक रूप से आनुवंशिक रोगों के उपचार के लिए उपकरण का उपयोग किया जाता है, जिसमें रीढ़ की हड्डी पेशी शोष, रेटिना डिस्ट्रोफी, और हीमोफिलिया ए 1,2,3 शामिल हैं। आरएएवी वैक्टर को जंगली-प्रकार एएवी4 में मौजूद वायरल जीन की कमी के लिए इंजीनियर किया जाता है, जो एक रैखिक एकल-फंसे 4.7 केबी डीएनए जीनोम के साथ एक छोटा, गैर-लिफाफा इकोसाहेड्रल वायरस है। एएवी को पहली बार 1960 के दशक में एडेनोवायरसतैयारी 5 के संदूषक के रूप में खोजा गया था। अपने छोटे कैप्सिड आकार के बावजूद, जो ट्रांसजीन के आकार को सीमित करता है जिसे आईटीआर6 को छोड़कर अधिकतम 4.9 केबी तक पैक किया जा सकता है, एएवी ट्रांसजीन डिलीवरी के लिए उपयोगी है क्योंकि यह मनुष्यों में गैर-रोगजनक है, कई विभाजित और गैर-विभाजित सेल प्रकारों में ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है, और सीमित इम्युनोजेनिक प्रभाव7.
जीनस डिपेंडोपार्वोवायरस के सदस्यों के रूप में, आरएएवी का उत्पादन एडेनोवायरस या हर्पीज सिम्प्लेक्स वायरस8 में मौजूद सहायक जीन की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। आरएएवी का उत्पादन करने के लिए कई रणनीतियों का विकास किया गया है, लेकिन एडेनोवायरल ई 1 ए / ई 1 बी हेल्पर जीन के साथ परिवर्तित एचईके 293 कोशिकाओं में उत्पादन आज इस्तेमाल की जाने वाली सबसे स्थापित विधि है9. आरएएवी उत्पादन का सामान्य दृष्टिकोण क्रमशः उल्टे टर्मिनल रिपीट (आईटीआर), एएवी प्रतिनिधि और कैप जीन, और अतिरिक्त एडेनोवायरल हेल्पर जीन के भीतर ट्रांसजीन युक्त तीन प्लास्मिड के साथ HEK293 कोशिकाओं के अभिकर्मक के साथ शुरू होता है। अभिकर्मक के बहत्तर घंटे बाद, कोशिकाओं को काटा जाता है और ट्रांसजीन युक्त आरएएवी को शुद्ध करने के लिए संसाधित किया जाता है।
चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए नए आरएएवी वैक्टर के विकास में, एक प्रमुख लक्ष्य बढ़ी हुई पारगमन दक्षता के साथ वैक्टर का उत्पादन कर रहा है। लक्ष्य कोशिकाओं के पारगमन दक्षता में वृद्धि आरएएवी के आवश्यक नैदानिक खुराक में कमी का मतलब होगा, इस प्रकार तीव्र विषाक्तता10,11 के लिए एंटीबॉडी मध्यस्थता तटस्थता से लेकर प्रतिकूल इम्युनोजेनिक प्रभाव की संभावना कम हो रही है. आरएएवी वैक्टर की पारगमन प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए, पैक किए गए जीनोम या कैप्सिड में परिवर्तन किए जा सकते हैं। पैक जीनोम डिजाइन के माध्यम से पारगमन प्रभावकारिता धुन करने के लिए व्यवहार्य तरीकों मजबूत और ऊतक विशिष्ट प्रमोटरों, एमआरएनए प्रसंस्करण तत्वों के विचारशील चयन, और अनुवाद दक्षता12 में सुधार करने के लिए कोडिंग अनुक्रम अनुकूलन के समावेश शामिल हैं. कैप्सिड में परिवर्तन लक्ष्य मानव कोशिका प्रकारों के लिए ट्रोपिज्म बढ़ाने के लक्ष्य के साथ किए जाते हैं। नए आरएएवी ट्रांसजीन डिलीवरी वेक्टर कैप्सिड विकसित करने के प्रयासों को आम तौर पर विशिष्ट सेल रिसेप्टर्स को लक्षित करने वाले विशिष्ट उत्परिवर्तन के साथ एएवी कैप्सिड के तर्कसंगत डिजाइन पर ध्यान केंद्रित करने की विशेषता होती है या एक विशिष्ट रिसेप्टर को लक्षित किए बिना उच्च जटिलता कॉम्बिनेटरियल कैप्सिड पुस्तकालयों से विशिष्ट सेल प्रकारों के लिए ट्रोपिज्म के साथ कैप्सिड की पहचान करने के लिए निर्देशित विकास (हालांकि कुछ समूह इन दृष्टिकोणों को जोड़ते हैं)13, 14,15. निर्देशित विकास दृष्टिकोण में, combinatorial capsid पुस्तकालयों capsid बाहरी16 पर उत्परिवर्तित चर क्षेत्रों के साथ एक विशेष सीरोटाइप रीढ़ का उपयोग कर निर्माण कर रहे हैं. कॉम्बिनेटरियल कैप्सिड पुस्तकालयों का निर्माण अक्सर एएवी सीरोटाइप से किया जाता है जो मनुष्यों में उत्पन्न नहीं होते हैं, नैदानिक उपयोग10 के दौरान पूर्ववर्ती प्रतिरक्षा के जोखिम को कम करते हैं। इसलिए, शुद्धि विधियां जिन्हें किसी भी सीरोटाइप पर लागू किया जा सकता है, इन पुस्तकालयों के लिए रीढ़ के रूप में सेवा करने वाले कम सामान्यतः उपयोग किए जाने वाले सीरोटाइप के लिए सीरोटाइप-विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता को समाप्त करने के लिए आदर्श हैं।
Iodixanol घनत्व ढाल centrifugation उच्च संक्रामकता17 के साथ rAAV के उच्च टाइटर्स शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस प्रोटोकॉल में, आरएएवी के बड़े टाइटर्स का उत्पादन करने के लिए आवश्यक श्रम की मात्रा को कम करने के लिए निलंबन सेल संस्कृति में आरएएवी का उत्पादन किया जाता है। दूषित प्रोटीन की उपस्थिति को कम करने और वायरस वर्षा के जोखिम को कम करने के लिए सेल लाइसेट को साफ करने के लिए एक सेंट्रीफ्यूजेशन कदम भी शामिल है। यह प्रोटोकॉल पूर्व-नैदानिक उपयोग के लिए उपयुक्त उच्च शुद्धता आरएएवी की तैयारी का उत्पादन करने के लिए एक लागत प्रभावी तरीका है।
Protocol
Representative Results
Discussion
डबल आयोडिक्सानॉल घनत्व ढाल शुद्धि प्रोटोकॉल सार्वभौमिक विधि है क्योंकि यह किसी भी एएवी उत्परिवर्ती वेरिएंट पर लागू होता है, चाहे उनकी रिसेप्टर विशिष्टता कुछ भी हो। एएवी शुद्धि के प्रारंभिक तरीकों क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई नहीं।
Materials
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
References
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