Summary
Microhardheid is een mechanische eigenschap en een informatieve parameter voor het evalueren van de pathofysiologie van hard weefsel. Hier demonstreren we een gestandaardiseerd protocol (monstervoorbereiding, polijsten, plat oppervlak en indrukplaatsen) voor microhardheidsanalyse in tand- en alveolair bot in mondziektemodellen van knaagdieren, namelijk tandfluorose en ligatuur-geïnduceerde parodontale botresorptie.
Abstract
De mechanische eigenschap, microhardheid, wordt geëvalueerd in tandglazuur, dentine en bot in modellen voor mondziekten, waaronder tandfluorose en parodontitis. Micro-CT (μCT) biedt 3D-beeldvormingsinformatie (volume en mineraaldichtheid) en scanning-elektronenmicroscopie (SEM) produceert microstructuurbeelden (glazuurprisma en botlacune-canaliculair). Als aanvulling op structurele analyse door μCT en SEM is microhardheid een van de informatieve parameters om te evalueren hoe structurele veranderingen mechanische eigenschappen veranderen. Ondanks dat het een nuttige parameter is, zijn onderzoeken naar microhardheid van alveolair bot bij mondziekten beperkt. Tot op heden zijn er uiteenlopende meetmethoden voor microhardheid gerapporteerd. Aangezien de waarden van de microhardheid variëren afhankelijk van de monstervoorbereiding (polijsten en vlak oppervlak) en de indrukplaatsen, kunnen diverse protocollen discrepanties tussen onderzoeken veroorzaken. Standaardisatie van het microhardheidsprotocol is essentieel voor een consistente en nauwkeurige evaluatie in orale ziektemodellen. In de huidige studie demonstreren we een gestandaardiseerd protocol voor microhardheidsanalyse in tand en alveolair bot. De gebruikte monsters zijn als volgt: voor het tandfluorosemodel werden snijtanden verzameld van muizen die gedurende 6 weken waren behandeld met/zonder fluoridehoudend water; voor het ligatuur-geïnduceerde parodontale botresorptie (L-PBR)-model werden alveolaire botten met parodontale botresorptie verzameld van muizen die waren geligeerd op de maxillaire 2ekies. 2 weken na de ligatie werd de bovenkaak verzameld. De Vickers-hardheid werd in deze monsters geanalyseerd volgens het gestandaardiseerde protocol. Het protocol biedt gedetailleerde materialen en methoden voor het inbedden van hars, serieel polijsten en inkepingen voor snijtanden en alveolair. Voor zover wij weten, is dit het eerste gestandaardiseerde microhardheidsprotocol dat de mechanische eigenschappen van tand- en alveolair bot in modellen voor mondziekten bij knaagdieren evalueert.
Introduction
Hardheid is een van de mechanische eigenschappen (bijv. elasticiteit, hardheid, visco-elasticiteit en breukgedrag) en wordt vaak gebruikt om het vermogen om compressievervorming en breuk van een lokaal gebied van een materiaal te weerstaan te karakteriseren. De statische indrukhardheidstest is de meest gebruikte methode, inclusief Vickers-hardheid en Knoop-hardheid1. De Vickers-hardheidstest wordt uitgevoerd door een diamantindruklichaam onder een vaste testbelasting in het oppervlak te drukken. Het indruklichaam is piramidevormig, met een vierkante basis en een hoek van 136° tussen tegenoverliggende vlakken. De lengte van beide diagonalen die op het testoppervlak worden gevormd, wordt gemeten en het gemiddelde wordt gebruikt om de hardheid te berekenen, die wordt bepaald door de verhouding F/A (waarbij F de kracht is en A de oppervlakte van de indrukking). Het Vickers-microhardheidsgetal (HV=F/A) wordt meestal uitgedrukt in kilogramkracht (kgf) per mm2 indrukking, met 1 HV ≈ 0,1891 F/d2 (N/mm2). De Knoop-hardheid bestaat ook uit een diamanten vierkante piramide-indrukpost gevormd door twee ongelijke tegenoverliggende hoeken. Het hardheidsgetal van Knoop (HK) is gelijk aan de verhouding tussen de uitgeoefende belasting en het geprojecteerde contactoppervlak. Hardheidstests worden ingedeeld in micro-indruktests (microhardheidstests) en macro-indruktests, afhankelijk van de kracht die op het testmateriaal wordt uitgeoefend. Micro-indentatietests gebruiken doorgaans belastingen in het bereik van 0,01-2 N (ongeveer 1-203 gf); ondertussen gebruiken macro-inspringingstests meer dan 10 N (10119 gf)1.
Om kenmerken van harde tandweefsels bij mondziekten, waaronder tand- en alveolair bot, te evalueren, worden micro-CT (μCT) en scanning-elektronenmicroscopie (SEM) gebruikt voor structurele analyse. μCT levert 3D-beeldvormingsinformatie (volume en mineraaldichtheid)2 en SEM produceert microstructuurbeelden (glazuurprisma en botlacune-canaliculair)3. Als aanvulling op structurele analyse door μCT en SEM is microhardheid een van de informatieve parameters om te evalueren hoe structurele veranderingen de mechanische eigenschappen van tand en alveolair bot veranderen bij mondziekten, bijv. misvorming van het glazuur en parodontale botresorptie. De Vickers-microhardheidswaarde van menselijk glazuur (HV = 283-374) is ongeveer 4 tot 5 keer hoger dan die van dentine (HV = 53-63)4,5. In tandfluorosemodellen bij knaagdieren neemt de microhardheid van het glazuur significant af in met fluoride behandelde snijtanden van muizen (HV = 136) in vergelijking met controle-glazuur (HV = 334)6,7. Dit suggereert dat gefluoroseerd glazuur zachter en zwakker is met een lager mineraalgehalte en een hoger eiwitgehalte dan in niet-gefluoroseerd glazuur. Microhardheid wordt gebruikt om de mechanische eigenschappen van het bot te evalueren. Verschillende eerdere studies hebben het mechanische gedrag van menselijk bot van verschillende anatomische plaatsen onderzocht, waaronder microhardheid van lang bot 8,9,10. De gemiddelde microhardheid van menselijke gefluoroseerde dijbenen vertoonde een significante afname (HV = 222,4) in vergelijking met niet-gefluoreerde dijbenen (HV = 294,4)11. Ondanks dat het een nuttige parameter is, is er een schaarste aan literatuur die de microhardheid (Vickers12 of Knoop13,14) van alveolair bot bij mondziekten beschrijft.
Tot op heden zijn er uiteenlopende meetmethoden voor microhardheid gerapporteerd. Aangezien de microhardheidswaardenvariëren met 15 afhankelijk van de monstervoorbereiding (polijsten en vlak oppervlak) en de indrukplaats, kunnen diverse protocollen discrepanties tussen onderzoeken veroorzaken. Standaardisatie van het testprotocol voor microhardheid is essentieel voor een consistente en nauwkeurige evaluatie in orale ziektemodellen. In de huidige studie demonstreren we een gestandaardiseerd protocol voor microhardheidsanalyse in tand en alveolair bot in het tandfluorosemodel van muizen en het parodontale botresorptiemodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften voor het gebruik van gewervelde dieren die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care Use Committee (IACUC) van Augusta University en Nova Southeastern University, die is geaccrediteerd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Merk op dat Dr. Suzuki in dienst was van de Augusta University, waar de experimenten met tandfluorose bij muizen werden voltooid.
1. Extractie van mandibulaire snijtanden in een tandfluorosemodel van muizen
- Geef fluoridevrije diëten aan C57BL/6-muizen (5 weken oud, mannetje) vanaf 1 week voorafgaand aan fluoride tot beëindiging van de fluoridebehandeling.
- Bereid fluoridewater voor door NaF toe te voegen aan gedestilleerd water, gevolgd door vacuümfiltratie met behulp van een filter van 0,2 μm. Geef dieren fluoridewater als NaF (0 ppm en 125 ppm; N=5/groep) ad libitum gedurende 6 weken. Vervang fluoridewater om de 2 dagen door een vers bereide batch.
- Na 6 weken fluoridewaterbehandeling dieren euthanaseren met CO2 gevolgd door onthoofding.
- Haal de hemi mandibulaire met snijtand uit elke muis. Om de hemi mandibulaire met snijtand te verzamelen, snijdt u de spieren rond de onderkaak zonder overmatige kracht uit te oefenen.
- Plaats de hemi mandibular in PBS en houd deze op 4 °C tot μ-CT-analyse (optioneel). Scheid de snijtand van de onderkaak met behulp van een scalpel (#15) en een schaar zonder het monster te beschadigen of te breken.
- Was de geïsoleerde snijtand met PBS en voer dehydratatie uit door deze gedurende 2-3 uur onder te dompelen in een toenemende alcoholsterkte (70% en 100% ethanol).
OPMERKING: Als het weefsel (bijv. pulpa) niet voldoende is uitgedroogd, zal harsimpregnering waarschijnlijk worden geremd en zal de daaropvolgende evaluatie waarschijnlijk ontoereikend zijn. - Na uitdroging met ethanol de snijtand horizontaal in hars inbedden. Ga door naar stap 3.
2. Extractie van maxillaire alveolaire botten in een door ligatuur geïnduceerd parodontaal botresorptie (L-PBR) model van muizen
- Dien 0,8 ml ketamine (100 mg/ml) + 0,1 ml xylazine (100 mg/ml) + 9,1 ml PBS intraperitoneaal (i.p.) toe aan muizen (C57BL/6, 8-12 weken oud, mannen) als verdovingsmiddelen. De dosering is 0,01 ml/g (gewicht). Breng oogzalf aan op beide ogen om uitdroging onder narcose te voorkomen.
- Plaats de verdoofde muis 5-10 minuten op een verwarmingskussen. Beoordeel de reacties op staart-/teenknijpen en de intactheid van de oogreflex. Controleer of de muis niet reageert op de schadelijke prikkels en dat de reflex afwezig is.
- Plaats de muis op de behandeltafel en houd de mond open door middel van een ligatuur 5-0 zijden hechtdraad die aan een magnetische paal op de behandeltafel is vastgemaakt.
- Wikkel onder een chirurgische microscoop de ligatuur (gevlochten zijden hechting 6-0) rond één kant van de maxillaire tweede kies (enkele laag) met behulp van micronaaldhouders. Minimaliseer individuele verschillen in analyse door de ene kant als behandelingskant en de andere kant als controle te gebruiken.
- Bind de ligatuur vast en maak een knoop aan de gehemeltezijde. Knip na het maken van een knoop de resterende ligatuur zo kort mogelijk af, zodat de overmatige ligatuur het kauwen of eten niet hindert. Dit is belangrijk om ervoor te zorgen dat de ligatuur niet losraakt door kauwen tijdens de daaropvolgende observatieperiode.
OPMERKING: Laat het dier niet onbeheerd achter totdat het weer voldoende bij bewustzijn is gekomen om sterns te blijven liggen. Breng het dier dat een operatie heeft ondergaan niet terug naar het gezelschap van andere dieren totdat het volledig hersteld is. Handhaaf steriele omstandigheden tijdens het overleven. - Voer dieet en water aan muizen ad libitum gedurende 2 weken. Na 2 weken ligatie muizen euthanaseren met CO2 gevolgd door onthoofding.
- Extraheer beide zijknobbels (ligatuurzijde en controlezijde) met kiezen uit elke muis. Om bovenkaak met kiezen te verzamelen, knipt u de spieren en het bot rond de kaakkaak met een schaar zonder overmatige kracht uit te oefenen. Plaats elke bovenkaak in PBS en houd deze op 4 °C tot μCT-analyse (optioneel).
- Scheid het alveolaire bot met kiezen (1st tot 3rd) van de bovenkaak met behulp van een scalpel (#15) en een schaar zonder het monster te beschadigen of te breken.
- Was het geïsoleerde alveolaire bot met PBS, dehydrateer en ontvet vervolgens door onderdompeling in toenemende sterkte van alcohol (70% en 100% ethanol) gedurende 2-3 uur.
OPMERKING: Als het weefsel (bijv. pulp en bot) niet voldoende uitgedroogd is, zal harsimpregnering waarschijnlijk worden geremd en zal de daaropvolgende evaluatie waarschijnlijk onvoldoende zijn. - Na uitdroging met ethanol beding u het alveolaire bot horizontaal in hars. Ga door naar stap 3.
- Optioneel: Voer een μCT-evaluatie uit voordat u de microhardheid test.
- Voer vóór het testen van de microhardheid een niet-destructieve structurele analyse uit (bijv. μCT) met behulp van hetzelfde monster voor microhardheidstests als aanvullende evaluatie (Figuur 1). Structurele informatie (3D-beeld, mineraaldichtheid, volume) door μCT kan ondersteuning bieden bij het evalueren van de mechanische eigenschappen en kwaliteit van het monster die van invloed kunnen zijn op de resultaten van de microhardheid.
Figuur 1: Representatieve μCT-beelden van glazuur in controle- en met fluoride behandelde snijtanden van muizen. (A) Representatief μCT sagittaal beeld van de mandibulaire snijtand. (B-D) μCT coronale beelden van controlesnijtand (NaF 0 ppm). (E-G) μCT coronale beelden van snijtand behandeld met NaF (125 ppm). De representatieve dichtheid van emailmineralen (EMD) wordt weergegeven (g/cm3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Inbedding van monsters in hars
- Ga verder vanaf stap 1.7 (tandfluorosemodel) of stap 2.10 (L-PBR-model).
- Smeer de binnenkant van de montagebeker (1 inch) in met een dunne laag vaseline. Meng hars (koudhardende inbeddingshars) volgens de instructies. Giet de hars en verharder in de meegeleverde plastic beker in een volumeverhouding van 15:2 en meng voorzichtig met een houten spatel gedurende minimaal 2 minuten. Vermijd luchtbellen.
- Plaats de gedehydrateerde en ontvette snijtand (Figuur 2A) of het alveolaire bot met de kiezen (Figuur 2B) horizontaal en evenwijdig aan de bodem van de montagecup (1 monster per cup).
- Giet de gemengde hars (net genoeg hars, ongeveer 1,5 ml) in de montagebeker om het preparaat volledig te bedekken. Voeg niet meer hars toe dan nodig is, omdat een teveel aan hars het polijstproces belemmert (Figuur 2C,D). Plaats de montagebeker met het monster gedurende ten minste 8 uur op een hete plaat bij 50 °C om de polymerisatie van hars te bevorderen. Deze procedure draagt bij aan het in een stabiele positie houden van het monster.
OPMERKING: Afhankelijk van de grootte van het monster, past u de hoeveelheid hars aan om het monster volledig te bedekken. Vul niet te veel hars, anders is er meer tijd nodig om overtollige hars te verwijderen. - Verwijder na uitharding de hars met het preparaat van de montagecup. Verwijder bramen en plaats het vlak van het preparaat en het tegenoverliggende zijvlak als evenwijdig en vlak met behulp van een geavanceerde slijpmachine-polijstmachine met ruw, waterbestendig schuurpapier (korrel 60/P60 en 120/P120) onder water. Beperk de hoogte van het monster tot ongeveer 3 mm voor snijtand en alveolair bot (figuur 2E,F).
OPMERKING: Wanneer het monster wordt geanalyseerd door SEM na de microhardheidsmeting, moet de dikte van het monster ongeveer 3 mm zijn, zodat de daaropvolgende SEM-waarneming niet wordt beïnvloed. Kleinere monsters zijn moeilijker te manipuleren met de molen. Voor de monsters die alleen voor microhardheid zijn bestemd, kan de hoogte van het monster toenemen tot ongeveer 10-20 mm. - Snijd de uitwendige vorm bij om een rechthoekig massief harsblok en ronde hoeken te maken (ongeveer 30 mm, lengte 10 mm voor snijtand (figuur 2G) en breedte 10 mm, lengte 5 mm, voor alveolair bot (figuur 2H)) met behulp van een precisiesnijzaag.
- Zodra de correctie van de ruwe vorm is voltooid, verwijdert u vuil en deeltjes uit het harsblok met behulp van een ultrasone reiniger (ongeveer 1 minuut). Ga door naar stap 4.
Figuur 2: Stroom van het proces voor het inbedden en polijsten van hars. (A) Gedehydrateerde en ontvette snijtand. (B) Gedehydrateerd en ontvet alveolair bot in L-PBR. (C, D) Snijtanden en alveolair bot ondergedompeld in hars. (E, F) Door de hars af te snijden, is het gemakkelijker om het oppervlak van het doelweefsel te polijsten. (G, H) Harshoeken afgerond voor het polijstproces. Afkortingen: L-PBR = ligatuur-geïnduceerde parodontale botresorptie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Polijsten van preparaten
OPMERKING: Het polijsten van preparaten gebeurt handmatig met behulp van waterdicht schuurpapier (van ruw naar fijner) op een geavanceerde slijpmachine-polijstmachine onder wateroverstroming.
- Leg een ruw, waterbestendig schuurpapier (korrel 600/P1200) op de molen. Plaats het bijgesneden en gereinigde harsblok (uit stap 3.7) op het ruwe, waterbestendige schuurpapier.
- Terwijl u water giet, houdt u het harsblok vast en polijst u het evaluatieoppervlak van het monster op de slijper-polijstmachine (snelheid 1-10 x g). Zorg er op dit moment voor dat u het harsblok zo vasthoudt dat het evaluatieoppervlak evenwijdig is aan de grond. Om het evaluatieoppervlak intact te houden, controleert u het oppervlak met het blote oog of onder een microscoop.
NOTITIE: Houd er rekening mee dat de molen met de klok mee draait en dat een gelijkmatige druk kan leiden tot een onevenwijdig oppervlak. Om een parallel oppervlak te verkrijgen, houdt u de rotatiesnelheid van het zweefvliegtuig constant en drukt u het preparaat voorzichtig gedurende enkele seconden, en draait u het preparaat vervolgens 180° om gedurende dezelfde tijd te drukken. Ruw schuurpapier kan niet alleen hars, maar ook monster verwijderen. - Vervang het schuurpapier door de Grit 800/P2400 en plaats het harsblok erop. Herhaal stap 4.2.
- Verwijder vuil en deeltjes uit het harsblok met behulp van een ultrasone reiniger (ongeveer 1 minuut).
NOTITIE: Voordat u verder gaat, wordt aanbevolen een ultrasone reiniger te gebruiken om oppervlaktevuil te verwijderen om verstopping te voorkomen. - Voer vervolgens serieel polijsten uit met fijner schuurpapier; De polijstvolgorde is 12 μm, 9 μm, 3 μm, 1 μm en 0,3 μm.
- Leg een lepfolie (12 μm) zonder rotatie op de slijper-polijsttafel en plaats het harsblok op de lepfolie.
OPMERKING: In dit experiment is de slijptafel geschikt om een vlak oppervlak te krijgen onder wateroverstroming. Als alternatief kan ook een grote vlakke spiegel (of iets dergelijks) worden gebruikt die parallellisme biedt. - Polijst onder waterkoeling het evaluatieoppervlak van het monster voorzichtig met de hand op de lepfolie. Verplaats het monster verticaal, horizontaal en diagonaal gedurende hetzelfde aantal seconden onder waterinjectie met slagen van 2 tot 3 cm (1 inch). Wanneer het polijstproces correct is uitgevoerd, blijft het harsmonster aan de lepfilm kleven.
- Verwijder puin en deeltjes zoals in stap 4.4. Verander het schuurpapier in het volgende formaat volgens de seriële polijstvolgorde (van 12 μm tot 0,3 μm) en plaats het harsblok erop.
- Houd tijdens het gieten van water het harsblok vast en polijst het oppervlak van het preparaat voorzichtig met de hand op de lepfolie. Verwijder puin en deeltjes zoals in stap 4.4.
- Herhaal stap 4.5 - 4.8 om het laatste polijsten te voltooien (0,3 μm). Na voltooiing van het laatste polijsten (0,3 μm), moet het preparaat een spiegelend oppervlak hebben (Figuur 3A).
- Reinig het oppervlak van het monster met ethanol (100%) om te ontvetten en te drogen en bewaar harsblokken bij kamertemperatuur tot de microhardheidstest. Vermijd tijdens opslag overmatig vocht en stof. Ga door naar stap 5.
5. Vickers microhardheidstest
OPMERKING: Het indrukken van een spiegelend oppervlaktemonster wordt gedaan met behulp van een microhardheidsmeter. De tests worden uitgevoerd met een belasting van 25 g gedurende 10 s met een Vickers-tip.
- Vickers microhardheidstest voor snijtanden (tandfluorosemodel)
OPMERKING: Glazuur kan worden verdeeld in drie lagen van buiten (mondholtezijde) naar binnenkant (pulpzijde); namelijk de oppervlakkige laag, de middelste laag en de diepe laag (dentine-glazuur overgang, DEJ) (Figuur 3B)16. In dit protocol worden drie emailslagen getest.- Stel de laadkracht in op 25 g en de laadduur op 10 s. Plaats het harsblok op het podium.
- Laat 6 punten inspringen in elke glazuurlaag (oppervlakkig, midden en DEJ) en dentine in elk gebied (cervicaal, midden en punt; Figuur 3B).
- Meet de lengte van de twee diagonalen (d1 en d2; Figuur 3B) om de Vickers-microhardheidswaarde (HV; Figuur 4).
- Vickers microhardheidstest voor alveolair bot (L-PBR-model)
- Stel de laadkracht in op 25 g en de laadduur op 10 s. Plaats het harsblok op het podium.
- Wissel 3-6 punten in in elke mesiale en distale zijde van het alveolaire bot vanaf de alveolaire kam. Indeuken van de alveolaire botten tussen de 1een 2ekies (wit vierkant) en de 2een 3ekies.
OPMERKING: In dit protocol werden 6 punten in elke mesiale en distale zijde (totaal 12 punten) geëvalueerd voor het controlebot (intact) en 3 punten in elke kant (totaal 6 punten) werden geëvalueerd voor L-PBR. Het aantal inkepingspunten is afhankelijk van de toestand van de laesie (bijv. te veel botverlies beperkt het inkepingsgebied).
Figuur 3: Evaluatiegebieden van microhardheid in mandibulaire snijtand. (A) Spiegelend oppervlaktemonster met mandibulaire snijtand. (B) Inkepingen in elke regio; cervicaal, midden en punt (NaF 0 ppm). (C) Drie emaillagen; van DEJ, binnenste, middelste en buitenste email. Afkortingen: D = dentine, E = email, DEJ = dentine enamel junction Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Vickers microhardheid van email behandeld met of zonder NaF. De microhardheid van dentine en drie glazuurlagen werden geëvalueerd in elk gebied, cervicaal, midden- en puntgebied. (A-C) Controle en (D-F) NaF (125 ppm) behandeling. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Significante verschillen werden geëvalueerd door eenrichtings-ANOVA met Tukey's post-hoc-test. P-waarden < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. **p < 0,005, ***p < 0,0005, ****p < 0,0001 Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tandfluorosemodel: Figuur 1 toont representatieve μCT-beelden van snijtanden in controle- en met fluoride behandelde muizen. In de controlegroep (Figuur 1B-D) vertoonde het cervicale gebied een lagere glazuurmineraaldichtheid (EMD) van 1.188 g/cm3 (Figuur 1B) in vergelijking met het middelste (1.924 g/cm3) en de punt (1.819 g/cm3; Figuur 1C,D). In het met fluoride behandelde glazuur (figuur 1E-G) werd slechts één van de vijf monsters geëvalueerd op EMD in het cervicale gebied (0,835 g/cm3; Figuur 1E en aanvullende figuur 1). De EMD nam in alle regio's af in vergelijking met de controlegroep (Figuur 1F,G). De lage EMD-waarden kwamen overeen met de lage microhardheidswaarden van het glazuur. Zoals te zien is in figuur 3, waren zes punten ingesprongen bij dentine en drie lagen glazuur (binnenste, middelste en buitenste) in de cervicale, middelste en puntgebieden. In de controlegroep was de microhardheid van elke glazuurlaag lager dan dentine in het cervicale gebied (figuur 4A). In het midden en de puntgebieden was de microhardheid van het glazuur van elke laag significant hoger dan die van dentine (Figuur 4B,C). Van de drie emailslagen nam de microhardheid toe van het binnenste naar het buitenste glazuur in elk midden- en puntgebied (Figuur 4B,C). Dentine had een microhardheidswaarde van ongeveer 100 HV met kleine variaties in cervicale, middelste en puntgebieden, terwijl de microhardheid van glazuur significant verschilde in regio's en in glazuur drie lagen. Deze resultaten suggereren dat de microhardheid van het glazuur aanzienlijk verschilt, afhankelijk van de indrukkingsplaatsen (regio's en glazuurlagen). In de met fluoride behandelde tand was de microhardheid van het glazuur, in tegenstelling tot de controle, zelfs in het middelste gebied minder dan dentine (figuur 4E). In het puntgebied nam de microhardheid aanzienlijk af van de binnenste naar de buitenste glazuurlaag (Figuur 4F). Deze gradiëntverschillen in microhardheid tussen emaillagen zijn moeilijk te evalueren door middel van μCT-beelden.
L-PBR-model: Figuur 5A toont μCT-beelden van alveolair bot in het ligatuur-geïnduceerde parodontale botresorptie (L-PBR) model. De representatieve botmineraaldichtheid (BMD) (gemiddelde van de mesiale en distale zijden van het alveolaire bot rond de tweede kies) was 0,76 g/cm3 in controlebot en 0,61 g/cm3 in L-PBR. Botresorptieniveaus werden gekwantificeerd door de afstand van de cement-glazuurovergang (CEJ) tot de alveolaire botkam (ABC). De CEJ-ABC-lengte was significant toegenomen in L-PBR in vergelijking met het controlebot (Figuur 5B). Figuur 6 toont de indrukkingsplaatsen van de microhardheid en de bijbehorende μCT-beelden. Vanaf de alveolaire botkam werden vijf inkepingen gemaakt in elke mediale en distale zijde (in totaal 10 plaatsen) in het controlebot tussen 1e en 2emolaar aangegeven door het witte vierkant (figuur 6A). De 3 inkepingen in elke mesiale en distale zijde (in totaal 6 plaatsen) werden gemeten in de L-PBR (Figuur 6B). Vickers-microhardheidswaarden (HV) waren de middelen voor inkepingen van alveolaire botten tussen1 e en 2e molaar (Figuur 6B; Wit vierkant), en tussen de 2een 3ekies (Figuur 6B; Blauw vierkant). Alveolair bot, BMD en HV-waarden vertoonden een lagere tendens in L-PBR (beïnvloed door parodontitis) in vergelijking met controle, (gezond) alveolair bot.
Figuur 5: Representatief μCT-beeld en botverlies in het L-PBR-model. (A) Representatieve μCT-beelden in het L-PBR-model (controle- en L-PBR-groep). De representatieve botmineraaldichtheid (BMD; gemiddelde van de mesiale en distale zijden van het alveolaire bot rond de tweede kies) wordt weergegeven (g/cm3). (B) Afstand van de mesiale en distale CEJ van de maxillaire tweede molaar tot de alveolaire botkam in de apicale richting van de wortel. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Significante verschillen werden geëvalueerd door t-toets. P-waarden < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. p < 0,0001. Afkortingen: L-PBR = ligatuur-geïnduceerde parodontale botresorptie. CEJ = overgang van cementemail, ABC = alveolaire botkam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Representatieve microhardheidsresultaten in het L-PBR-model. Representatieve buccale zijde van indrukkingsplaatsen (links) en het bijbehorende μCT-beeld (rechts) van (A) controle-alveolair bot en (B) L-PBR. Witte vierkanten tonen inkepingen in het alveolaire bot tussen M1 en M2. Blauwe vierkanten tonen inkepingen in het alveolaire bot tussen M2 en M3. Microhardheidswaarden (HV) zijn de middelen voor inkepingen in witte en blauwe vierkante gebieden. M1: 1ekies, M2: 2ekies, M3: 3ekies. Afkortingen: L-PBR = ligatuur-geïnduceerde parodontale botresorptie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: μCT-beeld van glazuur behandeld met NaF (coronale sectie). NaF (125 ppm) veroorzaakte hypomineralisatie van het glazuur, wat significant werd waargenomen in de cervicale en middelste regio's. Slechts één monster (monster nr. 1) van de vijf vertoonde nauwelijks glazuur in de cervicale en middelste regio's. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microhardheid wordt uitgevoerd om mechanische eigenschappen van harde weefsels zoals tand en bot te evalueren. Tot op heden zijn er uiteenlopende meetmethoden voor microhardheid gerapporteerd. De meeste meetinformatie, met name de monstervoorbereidingen en de indrukkingsplaatsen, zijn waarschijnlijk onvoldoende. Deze studie richtte zich op het microhardheidsprotocol voor glazuur en alveolair bot in modellen voor tandfluorose en parodontitis. Om consistente en nauwkeurige resultaten te verkrijgen, zijn de kritieke stappen in dit protocol de oriëntatie van het monster in harsinbedding, het parallel houden van het evaluatieoppervlak aan de grond, het serieel polijsten van het evaluatieoppervlak om een spiegelafwerking te verkrijgen, en de indrukkingsgebieden en -locaties die per referentiepunt zijn ingesteld. Tijdens de procedures voor het inbedden en polijsten van hars is het belangrijk om met het oog of onder een microscoop te controleren of het evaluatieoppervlak consequent evenwijdig aan de grond is en of het oppervlak intact is. Hoewel het optioneel is, wordt μCT-analyse aangemoedigd om indrukkingsplaatsen te bepalen.
In het tandfluorosemodel maakte behandeling met NaF (125 ppm) het moeilijk om de glazuurstructuur van de cervicale tot de middelste regio's te identificeren door middel van μCT. Alleen het glazuur van de punt kon worden onderscheiden van dentine (Figuur 1 en aanvullende Figuur 1). Om de microhardheid van het glazuur in het tandfluorosemodel te evalueren, is daarom de inkeping van het puntgebied geschikt. In overeenstemming hiermee evalueerden eerdere studies het puntgebied van het snijtandglazuur in tandfluorosemodellen 6,7. In het parodontitismodel helpt 3D-observatie door μCT bij het identificeren van de botresorptie aan zowel de buccale als de palatinale zijde (Figuur 5). Dit is van cruciaal belang voor het begrijpen van de hoeveelheid botverlies en de anatomische positie van het alveolaire bot om consistente indrukkingsplaatsen voor microhardheid te bepalen.
Een eerdere studie toonde een positieve correlatie aan tussen microhardheid en mineraaldichtheid17. Onze resultaten van EMD door μCT en glazuur microhardheid (HV; Figuur 1 en Figuur 4) komen overeen met het onderzoek. Deze resultaten suggereren dat de geschatte tendens van microhardheid kan worden geanticipeerd door μCT niet-destructief. De gradiëntverschillen in microhardheid tussen de drie lagen glazuur (figuur 4B, C, F) zijn echter moeilijk te identificeren als EMD-gradiënten door middel van μCT-analyse. In dit opzicht kunnen microhardheidstests worden beschouwd als een hogere resolutie dan μCT om pathologische aandoeningen op te helderen. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere harde tandweefsels, waaronder dentine. Met behulp van hetzelfde monster kan een veelzijdige evaluatie (SEM, SEM-EDX, micro-XRF en Raman-spectroscopie) worden opgenomen in de experimentele stroom voorafgaand aan de inkepingen van de microhardheid18. Aangezien inkepingen monsters beschadigen, begint u met een niet-destructieve test.
Een van de kritische beperkingen van microhardheidsmetingen is dat de waarde de neiging heeft om te worden beïnvloed door verschillende factoren tijdens de voorbereiding en indrukking van het monster. Om subjectieve factoren te minimaliseren, is het noodzakelijk om indrukkingsplaatsen te optimaliseren en meetprotocollen te standaardiseren die geschikt zijn voor elke pathologische aandoening of ziektemodel. In deze studie hebben we een protocol voor microhardheid van glazuur gedemonstreerd voor een tandfluorosemodel. Wijziging en/of optimalisatie van het protocol kan echter nodig zijn voor andere glazuurhypoplasie, bijv. het amelogenesis imperfecta (AI)-model, omdat de pathologie in elk ziektemodel verschilt. In het parodontitismodel is alveolair bot het belangrijkste doelweefsel. L-PBR-modellen zijn zeer toepasbaar voor de toepassing van genetische modificatietechnieken bij muizen. Tot op heden zijn er veel onderzoeken naar L-PBR-modellen gepubliceerd 19,20 . Voor zover wij weten, heeft echter geen van de onderzoeken ooit betrekking gehad op de microhardheid van alveolair bot in parodontitismodellen van muizen. Dit kan worden toegeschreven aan verschillende factoren. De relatie tussen microhardheid van alveolair bot en parodontitis is nog niet duidelijk. De microhardheidstest is technisch moeilijk uit te voeren in het alveolaire bot van muizen, vooral bij botresorptielaesies (vanwege moeilijkheden om inkepingsplaatsen in te stellen als gevolg van botvernietiging). Het is redelijk om aan te nemen dat dit laatste de factor is waarom de microhardheid niet is geëvalueerd in parodontitismodellen, ondanks dat de microhardheidswaarde is gevalideerd als een mechanische parameter in dijbeen en andere botten. Dit gestandaardiseerde protocol kan de mechanische eigenschappen evalueren van alveolair bot dat is aangetast door parodontitis en/of het ziekteherstelmodel.
In dit rapport demonstreren we het gestandaardiseerde protocol om de microhardheid van glazuur en alveolair bot te evalueren in een mondziektemodel bij muizen. Dit opent de deur voor toekomstige evaluatie van glazuur en parodontaal botverlies/regeneratie om nieuwe preventieve en therapeutische strategieën te ontwikkelen voor glazuurmisvorming en parodontitis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Het in deze publicatie gerapporteerde onderzoek werd ondersteund door JSPS KAKENHI JP21K09915 (MO) en het National Institute of General Medical Sciences; T34GM145509 (MM) en het Nationaal Instituut voor Tandheelkundig en Craniofaciaal Onderzoek; R01DE025255 en R21DE032156 (XH); R01DE029709, R21DE028715 en R15DE027851 (TK); R01DE027648 en K02DE029531 (MS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Braided Silk Suture 6-0 | Teleflex | ||
| Canica Small Animal Surgery System | Kent Scientific Corporation | SURGI 5001 | |
| CarbiMet PSA 120/P120 | Buehler | 30080120 | |
| CarbiMet PSA 60/P60 | Buehler | 36080060 | |
| CarbiMet PSA 600/P1200 | Buehler | 36080600 | |
| Castroviejo Micro Needle hilder | F.S.T | 12060-01 | |
| Epofix cold setting embeding Resin | Electron Microscopey Science | CAT-1237 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Brand | FB11201 | |
| Fluoride-free Rodent diet | Bio Serv | F1515 | AIN-76A, 1/2" Pellets |
| in-vivo microCT Skyscan 1176 | Bruker | ||
| Isomet 1000 Precison saw | Buehler | MA112180 | |
| Lapping film 0.3µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4203 | Alternative A3-0.3 SHT, 3M USA |
| Lapping film 1µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4206 | Alternative A3-1 SHT, 3M USA |
| Lapping film 12µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4211 | Alternative A3-12 SHT, 3M USA |
| Lapping film 3µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4204 | Alternative A3-3 SHT, 3M USA |
| Lapping film 9µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4201 | Alternative A3-9 SHT, 3M USA |
| Leica wild microscope | Leica | LEIC M690 | |
| Metaserv 2000 Variable speed Grinder polisher | Buehler | No: 557-MG1-1160 | |
| MicroCut PSA 1200/P2500 | Buehler | 36081200 | |
| MicroCut PSA P4000 | Buehler | 36084000 | |
| Microhardness tester, ALPHA-MHT-1000Z | PACE Technologies | ||
| SamplKups 1 inch | Buehler | No: 209178 | |
| Sodium Fluoride | Fisher Scientific | S299-100 | |
| West cott Stitch Scissor | JEDMED | Cat. #25-1180 | |
| ZooMed Repti Thern Undertank heater (U.T.H) | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
References
- Broitman, E. Indentation hardness measurements at macro-, micro-, and nanoscale: A critical overview. Tribol Lett. 65 (1), 23 (2017).
- Lee, M. J., et al. Sirt6 activation ameliorates inflammatory bone loss in ligature-induced periodontitis in mice. Int J Mol Sci. 24 (13), 10714 (2023).
- Min, J., et al. Investigation on the gradient nanomechanical behavior of dental fluorosis enamel. Nanoscale Res Lett. 13 (1), 347 (2018).
- Craig, R. G., Peyton, F. A. The micro-hardness of enamel and dentin. J Dent Res. 37 (4), 661-668 (1958).
- Chun, K., Choi, H., Lee, J. Comparison of mechanical property and role between enamel and dentin in the human teeth. J Dent Biomech. 5, (2014).
- Suzuki, M., Everett, E. T., Whitford, G. M., Bartlett, J. D. 4-phenylbutyrate mitigates fluoride-induced cytotoxicity in alc cells. Front Physiol. 8, 302 (2017).
- Sharma, R., et al. Assessment of dental fluorosis in mmp20 +/- mice. J Dent Res. 90 (6), 788-792 (2011).
- Wu, W. W., et al. Bone hardness of different anatomical regions of human radius and its impact on the pullout strength of screws. Orthop Surg. 11 (2), 270-276 (2019).
- Li, S., et al. Atlas of human skeleton hardness obtained using the micro-indentation technique. Orthop Surg. 13 (4), 1417-1422 (2021).
- Ibrahim, A., et al. Hardness an important indicator of bone quality, and the role of collagen in bone hardness. J Funct Biomater. 11 (4), 85 (2020).
- Vandana, K. L., Srishti Raj, B., Desai, R. Dental fluorosis and periodontium: An original research report of in vitro and in vivo institutional studies. Biol Trace Elem Res. 199 (10), 3579-3592 (2021).
- Xia, P. F., et al. Microcarriers containing "hypoxia-engine" for simultaneous enhanced osteogenesis and angiogenesis. Chemical Engineering Journal. 456, 141014 (2023).
- Chiu, R., et al. Effects of biglycan on physico-chemical properties of ligament-mineralized tissue attachment sites. Arch Oral Biol. 57 (2), 177-187 (2012).
- Leong, N. L., et al. Age-related adaptation of bone-pdl-tooth complex: Rattus-norvegicus as a model system. PLoS One. 7 (4), e35980 (2012).
- Johnson, W. M., Rapoff, A. J. Microindentation in bone: Hardness variation with five independent variables. J Mater Sci Mater Med. 18 (4), 591-597 (2007).
- Kweon, Y. S., et al. Effects of fam83h overexpression on enamel and dentine formation. Arch Oral Biol. 58 (9), 1148-1154 (2013).
- Boivin, G., et al. The role of mineralization and organic matrix in the microhardness of bone tissue from controls and osteoporotic patients. Bone. 43 (3), 532-538 (2008).
- Okamoto, M., et al. Microstructural evaluation of the mineralized apical barrier induced by a calcium hydroxide paste containing iodoform: A case report. J Endod. 2 (2), 243-251 (2024).
- Wang, Y., et al. B10 cells alleviate periodontal bone loss in experimental periodontitis. Infect Immun. 85 (9), e00335 (2017).
- Chen, Y., et al. Nlrp3 regulates alveolar bone loss in ligature-induced periodontitis by promoting osteoclastic differentiation. Cell Prolif. 54 (2), e12973 (2021).
- Robinson, J. W., et al. Male mice with elevated c-type natriuretic peptide-dependent guanylyl cyclase-b activity have increased osteoblasts, bone mass and bone strength. Bone. 135, 115320 (2020).
