Summary
Præsenteret her er en protokol til at fremkalde diffus traumatisk hjerneskade ved hjælp af en lateral Fluid percussion enhed efterfulgt af indsamlingen af coecum indhold for Gut mikrobiome analyse.
Abstract
Stigende beviser viser, at mikrobiota-Gut-hjerne aksen spiller en vigtig rolle i patogenesen af hjernesygdomme. Flere undersøgelser viser også, at traumatiske hjerneskader forårsage ændringer i tarm mikrobiota. Mekanismerne bag den tovejs regulering af hjerne-tarm-aksen er dog stadig ukendte. I øjeblikket, få modeller findes for at studere ændringer i Gut mikrobiota efter traumatisk hjerneskade. Derfor, den præsenterede undersøgelse kombinerer protokoller for inducerende traumatisk hjerneskade ved hjælp af en lateral Fluid percussion enhed og analyse af coecum prøver efter skade for at undersøge ændringer i tarm mikrobiome. Ændringer af tarm mikrobiota sammensætning efter traumatisk hjerneskade bestemmes ved hjælp af 16S-rDNA sekventering. Denne protokol giver en effektiv metode til at studere forholdet mellem enteriske mikroorganismer og traumatisk hjerneskade.
Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI) er et globalt folkesundhedsproblem og den førende årsag til død og invaliditet hos unge voksne1,2. TBI forårsager mange dødsfald hvert år, og overlevende oplever en række fysiske, psykiatriske, følelsesmæssige og kognitive handicap. Derfor er TBI en tung byrde for en patients familie og samfundsmæssige ressourcer. TBI involverer både den primære hjerneskade, der opstår på tidspunktet for traumer og eventuelle sekundære hjerneskader, der udvikler timer til måneder efter første skade. Sekundær hjerneskade er medieret af flere biokemiske kaskader, som ikke kun er skadelige for hjernen, men også har betydelige negative virkninger på forskellige organ systemer, herunder mave-tarmsystemet3.
I øjeblikket er der tre modeller til at inducere TBI i dyreforsøg: Fluid percussion skade, kontrol kortikale virkning (CCI), og vægt dråbe acceleration. Lateral Fluid percussion skade (LFPI) er den mest almindeligt anvendte model til at etablere diffus hjerneskade (DAI)4. Enheden producerer hjerneskade gennem en kraniektomi ved at anvende en kort væsketryk puls til intakt Dura. Denne puls er skabt af strejken af pendulet. LFPI er en reproducerbar og kontrollerbar modelleringsmetode til TBI Research.
Mikrobiomet defineres som de kollektive genomer af alle mikroorganismer, der bor i den menneskelige krop. Intestinal mikrober i særdeleshed ikke kun spille en vigtig rolle i intestinal homøostase og funktion, men også regulere mange aspekter af værts fysiologi og driften af andre organer5. I de seneste år, der er stigende beviser, der indikerer, at Gut mikrobiota regulere hjernens udvikling og funktion via hjernen-Gut akser6. Afbrydelse af tarmen mikrobiota har været forbundet med flere hjernefunktion lidelser, herunder Parkinsons sygdom, humørsvingninger, og autisme7. For nylig, prækliniske undersøgelser har også rapporteret, at akut hjerneskade kan fremkalde ændringer i Gut mikrobiota8,9.
En undersøgelse foretaget af Treangen et al.10 fandt betydelige fald i tre mikrobielle arter og stigninger i to mikrobielle arter efter CCI-induceret TBI. Dette tyder på, at graduering af Gut mikrobiota kan være en terapeutisk metode i TBI Management. Men, de mekanismer underliggende hjerneskade-induceret Gut mikrobiota ændringer forbliver ukendt. Af denne grund er en forholdsvis enkel og effektiv model for at studere ændringerne i Gut mikrobiota efter TBI er påkrævet. Derfor præsenterer denne undersøgelse en protokol til at undersøge ændringer i Gut mikrobiota efter TBI i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle udførte procedurer blev godkendt af den eksperimentelle dyreetiske komité på Zhejiang Universitet. Alle instrumenter og materialer, der anvendes i kirurgi er sterile. TBI proceudre tager ca. 20 minutter.
1. dyrepasning
- Brug 5-til 6-ugers gamle mandlige C57BL/6J mus (20-25 g vægt) i dette eksperiment.
- Vedligehold mus på en 12 timer/12 timer lys/mørk cyklus, og sørg for at de modtager mad og vand ad libitum. Giv de samme mængder mad og vand til både Sham-og TBI-grupperne i hele studiet.
- Gør alle bestræbelser på at minimere dyrenes smerte og ubehag.
2. induktion af traumatisk hjerneskade
- Injicer ketamin (80-100 mg/kg)/xylazin (10 mg/kg) IP for anæstesi. Test dybden af anæstesi ved hjælp af en øjen refleks eller smerte refleks. Brug kunstige tårer eller smøremiddel øjensalve til at holde øjnene fra tørring.
- Efter anæstesi, sætte musen i tilbøjelig position. Brug en temperaturkontrolleret varmepude til at holde temperaturen ved 37 °C under operationen og i 30 minutter efter TBI.
- Barbere håret af incisionområdet.
- Desinficer hovedbunden med 70% ethanol ved hjælp af tre vekslende scrubs, og incise hovedbunden i et sagittale plan.
- Brug pincet til at trække indsnit på begge sider og adskille periosteum lidt.
- Brug en markør til at tegne en cirkel (3 mm diameter) på højre parietal område af kraniet, 2 mm væk fra midterlinjen.
- Bore kraniet med en elektrisk boremaskine. Sørg for, at dette trin betjenes omhyggeligt for at beskytte Dura mod at blive beskadiget.
- Fjern knogle klap og Udsæt et lille knogle vindue (3 mm i diameter).
- Placer en plastik skade kanyle (indvendig diameter = 2,5 mm, længde = 8 mm) over kraniotomi og cementere kanylen til kraniet ved hjælp af en dental akryl.
- Fyld kanylen med steril 0,9% NaCl (normal saltvand) ved hjælp af en sprøjte (5 mL) for at sikre, at der ikke er bobler i kanylen.
- Tænd oscilloskop og forstærker, og sørg for, at højtryks røret på den laterale Fluid percussion-enhed (LFPI) er fri for luftbobler. Test enheden ved at levere ca. 10 impulser, indtil den giver et stabilt signal. Justér vinklen på pendulets startposition for at nå en pulsintensitet på ca. 2,0 ATM.
- skadens kanyle til LFPI-enheden. Fremkald hjerneskade ved at trække i udløseren og slippe pendulet. Derefter kan du få en puls og sende den til Dura gennem hele det lukkede væskefyldte slangesystem.
- Betjen musene i Sham-gruppen med samme kirurgiske indgreb. Udfør ikke LFPI.
3. behandling efter operationen
- Efter inducerende hjerneskade, fjerne plastik kanyle og sutur snittet. Under operationen administreres buprenorphin (2mg/kg) SQ eller IP og derefter hver 6-12 h i tre dage.
- Læg musen på en varmepude, indtil det er ambulatorisk. Indstil temperaturen på varmepuden til 37 °C for at fremskynde bedøvelsesmidlet.
- Sæt musen tilbage i buret og administrere mad og vand ad libitum.
4. laparotomi og prøveopsamling fra coecum
- Euthanize musene ved CO2 efterfulgt af livmoderhals dislokation på de tilsvarende tidspunkter.
Bemærk: i dette eksperiment, de valgte tidspunkter var 1 h, 6 h, 1 d, 3 d, og 7 d post-traumatisk hjerneskade til at analysere den dynamiske udvikling af Gut microbiota. - Fjern håret fra overfladen af maven. Desinficer maven med 70% ethanol.
- Placer en steril drapere over musen. Lav et snit fra den nedre mave midtlinje, lige over forhud i de mandlige mus.
- Efter tarmene er eksponeret, lokalisere cecum og forsigtigt adskilt det fra andre tarm skrifter. Undgå at gribe det cecum med tandede eller skarpe pincet. Brug atraumatisk tang, såsom Adson tang med serrationer.
- Skær coecum med skarp saks.
- Udpak indholdet af coecum manuelt på steril dressing og opbevar indholdet i 1,5 ml mikrocentrifuge glas.
- Indholdet af coecum opbevares ved-80 °c indtil mikrobiome analyse.
5. DNA-ekstraktion og 16S-rDNA-sekvensering og dataanalyse
-
Isolering af DNA fra fæser
Bemærk: der blev anvendt et kommercielt tilgængeligt DNA-isolations sæt (tabel over materialer) til dette eksperiment.- Brug en skalpel til at skrabe 300 mg afføring i et 2 mL mikrocentrifuge glas, og Anbring røret på is.
- Tilsæt 1 mL inhiberende buffer til hver prøve. Vortex kontinuerligt i 1 min eller indtil fæser prøven er grundigt homogeniseret.
- Centrifuger prøven ved den maksimale hastighed i 1 min for at pille afføring partikler.
- Der afpipetteres 2 μL proteinase K i et nyt 2 mL mikrocentrifuge glas. Pipet 600 μL af supernatanten fra trin 5.1.3 ind i det 2 mL mikrocentrifuge glas, der indeholder proteinase K. Tilsæt derefter 600 μL buffer 1 og vortex til 15 s.
- Prøven inkubates ved 70 °C i 10 min.
- Tilsæt 600 μL 100% ethanol til lysatet (1:1 ratio) og bland med vortexing. Centrifugeres ved den maksimale hastighed kortvarigt for at fjerne dråber fra indersiden af rørlåget.
- Påfør 600 μL af lysbilledet til spin søjlen. Centrifugeres ved den maksimale hastighed i 1 min. kassér gennemstrømningshastigheden. Gentag dette trin en gang til. Overfør derefter kolonnen til et nyt 2 mL opsamlings glas.
- Åbn spin kolonnen, og tilsæt 500 μL buffer 2. Centrifugeres ved den maksimale hastighed i 1 min. Fjern kolonnen, og anbring den i et nyt 2 mL opsamlings glas.
- Tilsæt 500 μL buffer 3 i kolonnen. Centrifugeres ved den maksimale hastighed i 3 min. kassér gennemstrømningshastigheden. Centrifugerings processen gentages én gang for at sikre, at buffer 3 er helt elueret.
- Placer spin søjlen i et nyt rør 2 mL opsamlings slange og pipetten 200 μL buffer 4 direkte på membranen. Inkuber i 1 min ved stuetemperatur (RT), og centrifuger derefter ved den maksimale hastighed i 1 min for at elueres DNA.
-
16S-rDNA-sekvensering og dataanalyse
- Brug 20-30 ng af DNA til at generere amplicons.
- Brug kommercielt tilgængelige primere designet til de relativt bevaret regioner, der grænser op til v3 og v4 hypervariable regioner af bakterier 16s rDNA. De fremad primere, der indeholder sekvensen "cctacggrrbgcascagkvrvgaat" og omvendte primere, der indeholder sekvensen "ggactacnvgggtwtctaatcc", blev anvendt i nærværende undersøgelse.
- Foretag PCR-reaktioner blandingen ved at tilføje 2,5 μL buffer 1, 2 μL dNTPs, 1 μL af hver primer, 0,5 μL DNA-Polymerase og 20 ng af skabelon-DNA i et rør. Brug ddH2O til at justere reaktionssystemet til 25 μl.
- Angiv PCR-reaktionsparametrene på følgende måde: prædenaturering ved 94 °C i 3 minutter én gang. Udfør denaturering ved 94 °C i 5 s, anneal ved 57 °C for 90 s, Forlæng ved 72 °C i 10 s, og Gentag dette 24x.
- Udfør PE250/300 parrings slutnings sekvens i henhold til producentens instruktion, og brug QIIME-dataanalyse pakke til 16S rRNA-dataanalyse.
Bemærk: i dette eksperiment blev DNA-sekvensering og dataanalyse primært udført af et professionelt sekvensering selskab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oprettelse af TBI er vist i figur 1. Efter anæstesi og desinfektion blev hovedbunden skåret sagittally (figur 1a). En kraniotomi (3 mm i diameter) var trephined i kraniet over den rigtige parietal cortex med en elektrisk boremaskine, Dura blev holdt intakt (figur 1b, C). En plastik skade kanyle blev placeret over knogle vinduet og cementeret til kraniet ved hjælp af dental akryl (figur 1d).
Proceduren for lateral væske percussion er vist i figur 2. Før du starter enheden blev testet ved at levere omkring 10 impulser, indtil det giver et stabilt signal. Pendulets vinkel blev justeret til startpositionen for at nå en pulsintensitet på ca. 2,0 ATM (figur 2a). Kanylen blev fyldt med det sterile normale saltvand. Derefter blev kanylen forbundet med LFPI-anordningen (figur 2b). Hjerneskade blev induceret ved at skabe en impuls i det lukkede kranie hulrum (figur 2c).
Laparotomi og coecum fækal prøve samling er vist i figur 3. Laparotomi blev udført på underlivet og langs midterlinjen (figur 3a). Coecum blev identificeret og forsigtigt separeret (figur 3b, C). Den coecum er normalt placeret i nederste højre del af maven. Det blev derefter indskåret med skarp saks (figur 3D). Indholdet af coecum (figur 3e) blev ekstraheret og opbevaret i 1,5 ml rør (figur 3F). Fækale prøver blev straks opbevaret ved-80 °C før yderligere brug.
16s-rDNA-sekvensering viste reduceret diversitet af coecum mikrobiota i mus 3 dage efter TBI, den mest rigelige taxa i coecum indhold af Sham og TBI grupper blev vist i figur 4. Den Wilcoxon Rank sum test blev udført for at evaluere mikrobiota forskelle mellem TBI og Sham grupper i 16S sekvensering analyse, og p -værdien var mindre end 0,05. Den ikke-metriske flerdimensionelle skalering (nmds) viste også ændret sammensætning af coecum mikrobiota efter TBI (figur 5).
Figur 1 : Etablering af TBI. (A) efter anæstesi og desinfektion blev hovedbunden indskåret. (B) operere en circinat kraniotomi på kraniet over den rigtige parietal cortex. C) holde Dura intakt. D) cementere plastik skade kanylen til kraniet ved hjælp af dental akryl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Proceduren for lateral væske slagtøj. (A) justering af pendulets start positions vinkel. B) påfyldning af kanyle med sterilt, normalt saltvand, derefter tilkobling af kanylen til LFPI-anordningen. C) hjerneskade induktion ved frigivelse af pendulet og skabelse af en impuls i det lukkede kraniehulen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Laparotomi og coecum fækal prøve samling. (A) begyndelsen af laparotomi fra nedre abdomen og langs midterlinjen. (B, C) Identifikation af coecum og efterfølgende (skånsom) fjernelse. D) skæring af coecum med skarp saks. E) ekstraktion af indholdet af Caecum. F) opbevaring af indholdet af coecum-indholds prøverne i 1,5 ml Eppendorf-rør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Sammenligningen af coecum mikrobiota diversitet. De fleste rigelige taxa i coecum-indholdet i Sham-og TBI-grupperne udviste reduceret diversitet af coecum mikrobiota i mus 3 dage efter TBI. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : NMDS analyse. Ikke-metrisk multi-dimensionel skalering (nmds) viste ændret sammensætning af coecum mikrobiota efter TBI. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Præsenteret her er en enkel og effektiv protokol til at bestemme ændringer i cecal mikrobiota efter TBI i mus. Induktion af hjerneskade og indsamling af coecum indholds prøver er kritiske dele af protokollen.
Trods forskere, der har studeret ændringerne af Gut mikrobiota følgende TBI, hjerneskade, der anvendes i disse undersøgelser var CCI-8 og vægt dråbe/effekt-induceret modeller9. Men CCI-modellen replikater for det meste hjernens kontusion, og vægt dråbe modellen kan lide under nogle unøjagtigheder. Blandt alle eksisterende hjerneskade modeller, er LFPI den mest almindeligt anvendte model, som omfatter fokal og diffus hjerneskade11,12 og replikater mange vigtige funktioner observeret i kliniske TBI patienter. Vigtige trin i hele processen omfatter beskyttelse af dura og holde kanyle lufttæt. Men både kraniotomi og konglutination kræver, at en faglært performer fungerer, hvilket kan være en begrænsning af denne protokol. Men, LFPI er stadig en enkel, stabil og præcis metode. Derfor blev TBI i mus induceret ved hjælp af LFPI i dette studie, hvilket gør protokollen mere repræsentativ og værdifuld i hjerneskade forskning.
For Gut mikrobiota analyse, fækale prøver blev brugt til sin ikke-invasivitet og bekvemmelighed. Ikke desto mindre, der er nogle begrænsninger af fækal prøvetagning. For det første er mængden af afføring indsamlet i hver mus på et bestemt tidspunkt lille, og mængden af afføring kan være utilstrækkelig til at udføre 16S-rDNA-analyse. For det andet, på grund af post-traumatisk gastrointestinal dysfunktion, fæser prøver er svære at indsamle i den akutte fase efter hjerneskade (1 h efter skade i denne undersøgelse). Desuden har beviser vist, at fækal mikrobiota sammensætning er forskellig fra mikrobiota i andre intestinale segmenter13. Derfor blev der indsamlet coecum-indhold til Gut mikrobiota-analyse i dette studie. Udtagning af Caecum-indhold kræver, at mus ofres, og denne metode giver mulighed for prøvetagning af tarmkanalen til histologiske og immunologiske undersøgelser, som er vigtige forskningsaspekter i undersøgelser af hjerneskade-induceret tarm dysfunktion. Desuden, denne metode kan bruges til at undersøge mikrobiota ændringer i andre gastrointestinale skrifter herunder jejunum, ileum, og kolon. Afslutningsvis, denne protokol er en ideel metode til at studere TBI-induceret ændringer i Gut microbiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oprigtigt tak Baohong Wang for hendes tekniske vejledning.
Acknowledgments
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA isolation kit | QIAGEN | 51604 | For fast purification of genomic DNA from stool samples |
| Gene analysis service | GENEWIZ | Gene analyse service | |
| Heating pad | Shanghai SAFE Biotech Co. | TR-200 | heating pad |
| Injector | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | injector | |
| LFPI device | Virginia Commonwealth University |
FP302 | LFPI device |
| Micro cranial drill | RWD Life Science | 78061 | Micro cranial drill |
| Povidone Iodine | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | Povidone Iodine |
References
- Cheng, P., et al. Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study. 14, e1002332 (2017).
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S.
- Kabadi, S. V., et al. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease. Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).
- Collins, S. M., Surette, M., Bercik, P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nature Reviews Microbiology. 10, 735-742 (2012).
- Cryan, J. F., Dinan, T. G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).
- Nicholson, S. E., et al. Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent. Shock. , (2018).
- Houlden, A., et al. Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production. Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).
- Treangen, T. J., et al. Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome. Frontiers in Immunology. 9, 2757 (2018).
- Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
- Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way. Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).
