Summary
Burada sunulan bir protokol bağırsak mikrobiyom analizi için caecum içeriğinin toplanması takip bir lateral sıvı perküsyon cihazı kullanarak diffüz travmatik beyin hasarı neden olur.
Abstract
Artan kanıtlar mikrobiyota-bağırsak-beyin ekseninin beyin hastalıklarının patogenezinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Çeşitli çalışmalar da travmatik beyin yaralanmaları bağırsak mikrobiyota değişikliklere neden olduğunu göstermektedir. Ancak beyin-bağırsak ekseninin çift yönlü düzenlenmesinin altında yatan mekanizmalar bilinmemektedir. Şu anda, birkaç model travmatik beyin hasarı sonrası bağırsak mikrobiyota değişiklikleri incelemek için var. Bu nedenle, sunulan çalışma, bir lateral sıvı perküsyon cihazı ve bağırsak mikrobiyom değişiklikleri araştırmak için yaralanma aşağıdaki kaecum örneklerinin analizi kullanarak travmatik beyin hasarı indükleyen protokolleri birleştirir. Travmatik beyin hasarı sonrası bağırsak mikrobiyota bileşiminde yapılan değişiklikler 16S-rDNA dizilimi kullanılarak belirlenir. Bu protokol enterik mikroorganizmalar ve travmatik beyin hasarı arasındaki ilişkileri incelemek için etkili bir yöntem sağlar.
Introduction
Travmatik beyin hasarı (TBI) küresel bir halk sağlığı sorunu ve genç erişkinlerde ölüm ve sakatlık önde gelen nedeni1,2. TBI her yıl birçok ölüme neden olur ve hayatta kalanlar çeşitli fiziksel, psikiyatrik, duygusal ve bilişsel engellerle karşılaşır. Bu nedenle, TBI bir hastanın aile ve toplumsal kaynaklar için ağır bir yüktür. TBI travma sırasında meydana gelen birincil beyin hasarı ve ilk yaralanma dan sonra ay saat geliştirmek herhangi bir ikincil beyin yaralanmaları içerir. İkincil beyin hasarı birkaç biyokimyasal basamaklar tarafından aracılık edilir, hangi sadece beyne zararlı değil, aynı zamanda çeşitli organ sistemleri üzerinde önemli olumsuz etkileri vardır, gastrointestinal sistem de dahil olmak üzere3.
Şu anda, hayvan deneylerinde TBI ikna etmek için üç model vardır: sıvı perküsyon yaralanması, kontrol kortikal etkisi (CCI), ve ağırlık düşme ivme. Lateral sıvı perküsyon hasarı (LFPI) yaygın beyin hasarı kurmak için en sık kullanılan modeldir (DAI)4. Cihaz bozulmamış dura kısa bir sıvı basıncı darbe uygulayarak bir kraniektomi yoluyla beyin hasarı üretir. Bu nabız sarkaç darbe tarafından oluşturulur. LFPI, TBI araştırmaları için tekrarlanabilir ve kontrol edilebilir bir modelleme yöntemidir.
Mikrobiyom, insan vücudunda bulunan tüm mikroorganizmaların kolektif genomları olarak tanımlanır. Özellikle bağırsak mikropları sadece bağırsak homeostazve fonksiyonu önemli bir rol oynamak değil, aynı zamanda konak fizyolojisi ve diğer organların işleyişi birçok yönünü düzenleyen5. Son yıllarda, bağırsak mikrobiyota beyin-bağırsakeksenleri6 ile beyin gelişimi ve fonksiyonu düzenleyen gösteren kanıtlar artmaktadır. Bağırsak mikrobiyota bozulması Parkinson hastalığı, duygudurum bozuklukları da dahil olmak üzere çeşitli beyin fonksiyon bozuklukları ile bağlantılı olmuştur, ve otizm7. Son zamanlarda, preklinik çalışmalar da akut beyin hasarı bağırsak mikrobiyota değişiklikleri neden olabilir bildirdin8,9.
Treangen ve ark.10 tarafından yapılan bir çalışmada, CCI'ye bağlı TBI'den sonra üç mikrobiyal türde önemli azalmalar ve iki mikrobiyal türde artış saptandı. Bu kanıt bağırsak mikrobiyota modülasyonu TBI yönetiminde tedavi yöntemi olabileceğini göstermektedir. Ancak, beyin hasarına bağlı bağırsak mikrobiyota değişiklikleri altında yatan mekanizmalar bilinmemektedir. Bu nedenle, TBI sonra bağırsak mikrobiyota değişiklikleri çalışma nispeten basit ve verimli bir model gereklidir. Bu nedenle, bu çalışma farelerde TBI sonra bağırsak mikrobiyota değişiklikleri incelemek için bir protokol sunuyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yapılan tüm işlemler Zhejiang Üniversitesi Deneysel Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Cerrahide kullanılan tüm alet ve malzemeler sterildir. TBI proceudre yaklaşık 20 dakika sürer.
1. Hayvan bakımı
- Bu deneyde 5-6 haftalık erkek C57BL/6J fareler (20-25 g ağırlık) kullanın.
- Fareleri 12 saat açık/karanlık bir döngüde koruyun ve yiyecek ve su reklamı libitum aldıklarından emin olun. Çalışma boyunca hem sham hem de TBI gruplarına aynı miktarda yiyecek ve su sağlayın.
- Hayvan ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için tüm çabayı gösterin.
2. Travmatik beyin hasarıin indüksiyonu
- Anestezi için Ketamin (80-100 mg/kg)/Xylazine (10 mg/kg) IP enjekte edin. Bir göz refleksi veya ağrı refleksi kullanarak anestezi derinliğini test edin. Gözlerin kurumasını engellemek için yapay gözyaşı veya yağlayıcı göz merhemi kullanın.
- Anesteziden sonra fareyi yatkın bir konuma getirin. Ameliyat sırasında ve TBI'den sonra 30 dakika boyunca sıcaklığı 37 °C'de tutmak için sıcaklık kontrollü bir ısıtma yastığı kullanın.
- Kesi bölgesinin saçını tıraş edin.
- Üç alternatif scrubs kullanarak% 70 etanol ile kafa derisi dezenfekte, sonra bir sagital düzlemde kafa derisi eğim.
- Her iki taraftaki kesiği geri çekmek ve periostu biraz ayırmak için forseps kullanın.
- Kafatasının sağ parietal bölgesinde, orta hattan 2 mm uzaklıkta bir daire (3 mm çapında) çizmek için bir işaretleyici kullanın.
- Kafatasını elektrikli matkapla delin. Durayı hasar görmemesi için bu adımın dikkatle çalıştırıldığından emin olun.
- Kemik kapağını çıkarın ve küçük bir kemik penceresini (3 mm çapında) ortaya çıkarın.
- Kraniyotomi üzerine plastik bir yaralanma kanül (iç çap = 2,5 mm, uzunluk = 8 mm) yerleştirin ve bir diş akrilik kullanarak kafatasına kanül çimento.
- Kanülde kabarcık olmadığından emin olmak için bir şırınga (5 mL) kullanarak kanülünü steril %0,9 NaCl (normal tuzlu) ile doldurun.
- Osiloskopve amplifikatör açın ve yanal sıvı perküsyon yaralanması (LFPI) cihazın yüksek basınç tüpü hava kabarcıkları ücretsiz olduğundan emin olun. Sabit bir sinyal verene kadar yaklaşık 10 darbe vererek cihazı test edin. Yaklaşık 2,0 atm darbe yoğunluğuna ulaşmak için sarkaç başlangıç konumunun açısını ayarlayın.
- Yaralanma kanülünü LFPI cihazına bağlayın. Tetiği çekerek ve sarkaç bırakarak beyin hasarına neden olur. Daha sonra, bir darbe almak ve tüm kapalı sıvı dolu tüp sistemi ile dura iletin.
- Aynı cerrahi işlem ile sahte grupta fareler çalıştırın. LFPI'yi gerçekleştirmeyin.
3. Ameliyat sonrası tedavi
- Beyin hasarı na neden olduktan sonra, plastik kanül kaldırmak ve kesi dikiş. Ameliyat sırasında buprenorfin (2mg/kg) SQ veya IP ve bundan sonra her 6-12 saat üç gün boyunca uygulayın.
- Fareyi bir ısıtma yastığının üzerine ambulatuar olana kadar yerleştirin. Anestezik resüsitasyonu hızlandırmak için ısıtma yastığının sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
- Fareyi kafese geri koyun ve yiyecek ve su reklamı libitumuygulayın.
4. Laparotomi ve caecum dan örnek toplama
- Fareleri CO2 ile ötenazi ve ardından ilgili zaman noktalarında servikal çıkış.
NOT: Bu deneyde, seçilen zaman noktaları bağırsak mikrobiyotasının dinamik evrimini analiz etmek için 1 saat, 6 saat, 1 d, 3 d ve 7 d travma sonrası beyin hasarıidi. - Karın yüzeyinden saç çıkarın. Karın bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin.
- Farenin üzerine steril bir perde yerleştirin. Alt karın orta hattından bir kesi yapın, erkek farelerde prepuce hemen üzerinde.
- Bağırsaklar maruz kaldıktan sonra, çekum bulmak ve yavaşça diğer bağırsak yollarından ayırdı. Dişli veya keskin forceps ile çekum kavramakaçının. Serasyonlu Adson forceps gibi atravmatik forceps kullanın.
- Keskin makas ile caecum kesin.
- Caecum içeriğini steril pansuman üzerine elle ayıklayın ve içindekileri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte saklayın.
- Mikrobiyom analizine kadar caecum içeriğini -80 °C'de saklayın.
5. DNA çıkarma ve 16S-rDNA dizilemesi ve veri analizi
-
DNA'nın dışkıdan izolasyonu
NOT: Bu deney için ticari olarak kullanılabilen BIR DNA izolasyon kiti(Malzeme Tablosu)kullanılmıştır.- 2 mL mikrosantrifüj tüp içinde dışkı 300 mg kazımak ve buz üzerinde tüp yerleştirmek için bir neşter kullanın.
- Her numuneye 1 mL inhibe arabelleği ekleyin. Girdap sürekli olarak 1 dk veya dışkı numunesi iyice homojenleşene kadar.
- Dışkı parçacıklarını peletlemek için numuneyi maksimum hızda 1 dakika santrifüj edin.
- Yeni bir 2 mL mikrosantrifüj tüp içine proteinaz K Pipet 2 μL. 5.1.3 adımdan proteinaz K içeren 2 mL mikrosantrifüj tüpüne süpernatantın 600 μL'si. Daha sonra, 15 s için Tampon 1 ve girdap 600 μL ekleyin.
- Numuneyi 70 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın.
- Lysate'ye %100 etanol (1:1 oran) ekleyin ve girdap ile karıştırın. Tüp kapağının içinden damlaları çıkarmak için kısa bir süre maksimum hızda santrifüj.
- Spin sütununa 600 μL lysate uygulayın. 1 dk. Maksimum hızda santrifüj. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Ardından, sütunu yeni bir 2 mL toplama tüpüne aktarın.
- Dönüş sütununa açın ve 500 μL Arabellek 2 ekleyin. 1 dk. Maksimum hızda santrifüj sütunu çıkarın ve yeni bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirin.
- Sütuna 500 μL Arabellek 3 ekleyin. 3 dk. Akış-through atın maksimum hızda santrifüj. Arabellek 3'ün tamamen eluted olduğundan emin olmak için santrifüj işlemini bir kez tekrarlayın.
- Spin kolonu yeni bir tüp 2 mL toplama tüpüne ve pipet 200 μL Tampon 4'ü doğrudan membrana yerleştirin. Oda sıcaklığında 1 dakika (RT) için kuluçka, sonra DNA'yı ejeketmek için 1 dakika maksimum hızda santrifüj.
-
16S-rDNA dizilimi ve veri analizi
- Amplikonoluşturmak için 20-30 ng DNA kullanın.
- Bakteri 16S rDNA V3 ve V4 hiperdeğişken bölgeleri sınırsınırları nispeten korunmuş bölgeler için tasarlanmış ticari olarak kullanılabilir astar kullanın. Bu çalışmada "CCTACGGRRBGBGCACaGKVRVGAAT" dizisini içeren ileri astarlar ve "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC" dizisini içeren ters astarlar kullanılmıştır.
- Bir tüpe 2,5 μL Tampon 1, 2 μL dNTPs, her astar1 μL, 0,5 μL DNA polimeraz ve 20 ng şablon DNA ekleyerek PCR reaksiyonları karışımını yapın. Reaksiyon sistemini 25 μL'ye ayarlamak için ddH2O'yu kullanın.
- PCR reaksiyon parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: 94 °C'de ön denatürasyonu bir kez 3 dk gerçekleştirin. Denatürasyon 5 s için 94 °C'de, 57 °C'de 90 s için anneal yapın, 72°C'de 10 s'de uzatın ve bu 24x'i tekrarlayın.
- Pe250/300 eşleştirilmiş uçlu sıralamayı üreticinin talimatına göre gerçekleştirin ve 16S rRNA veri analizi için QIIME veri analizi paketini kullanın.
NOT: Bu deneyde DNA dizilimi ve veri analizi öncelikle profesyonel bir sıralama şirketi tarafından yapılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TBI'nin kuruluşu Şekil 1'degösterilmiştir. Anestezi ve dezenfeksiyondan sonra kafa derisi sagittally kesilirdi (Şekil 1A). Bir kraniotomi (3 mm çapında) bir elektrikli matkap ile sağ parietal korteks üzerinde kafatası içine trephined, dura bozulmadan tutuldu(Şekil 1B,C). Plastik bir yaralanma kanül kemik penceresi üzerine yerleştirildi ve diş akrilik kullanılarak kafatası çimentolanmış(Şekil 1D).
Yanal sıvı perküsyon prosedürü Şekil 2'degösterilmiştir. Cihaz başlamadan önce sabit bir sinyal verene kadar yaklaşık 10 darbe ile test edildi. Sarkaç açısı başlangıç pozisyonuna göre ayarlanırken yaklaşık 2.0 atm darbe yoğunluğuna ulaşıldı (Şekil 2A). Kanül steril normal salinle doluydu. Sonra kanül LFPI cihazına bağlandı (Şekil 2B). Beyin hasarı kapalı kranial kaviteye bir impuls oluşturarak indüklendi (Şekil 2C).
Laparotomi ve kaecum dışkı örnek toplama Şekil 3'tegösterilmiştir. Laparotomi alt karın da ve orta hat boyunca yapıldı (Şekil 3A). Caecum tespit edildi ve yavaşça ayrıldı (Şekil 3B,C). Caecum genellikle karın sağ alt kısmında yer alır. Daha sonra keskin makas(Şekil 3D)ile inşifa edildi. Caecum(Şekil 3E)içeriği ayıklanmış ve 1.5 mL tüplerde saklanmış(Şekil 3F). Dışkı örnekleri daha fazla kullanılmadan önce -80 °C'de hemen saklandı.
16S-rDNA dizilimi farelerde kaecum mikrobiyotasının TBI'den 3 gün sonra azaldığını gösterdi, şem ve TBI gruplarının caecum içeriğinde en bol takson Şekil 4'tegösterilmiştir. Wilcoxon sıralama toplamı testi, 16S sıralama analizinde TBI ve sahte gruplar arasındaki mikrobiyota farklarını değerlendirmek için yapıldı ve p değeri 0.05'in üzerindeydi. Metrik olmayan çok boyutlu ölçekleme (NMDS) da TBI sonra caecum mikrobiyota nın bileşiminin değiştiğini göstermiştir(Şekil 5).
Şekil 1 : TBI'nin kurulması. (A) Anestezi ve dezenfeksiyondan sonra kafa derisi kesilir. (B) Sağ parietal korteks üzerinde kafatası üzerinde bir sirkatal kraniyotomi çalıştırın. (C) Durayı sağlam tutun. (D) Diş akrilik kullanarak kafatasına plastik yaralanma kanül çimento. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 : Lateral sıvı perküsyon prosedürü. (A) Sarkaç başlangıç açısının ayarlandırılması. (B) Kanülün steril normal salinle doldurulması, ardından kanülün LFPI cihazına bağlanması. (C) Sarkaç serbest bırakılması ve kapalı kranial kavite içine bir dürtü oluşturulması ile beyin hasarı indüksiyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3 : Laparotomi ve kaecum dışkı örnek toplama. (A) Alt karın dan laparotomi başlangıcı ve orta hat boyunca. (B,C) Caecum'un tanımlanması ve sonraki (nazik) kaldırma. (D) Keskin makas ile caecum kesme. (E) Caecum içeriğinin çıkarılması. (F) Kaecum içeriği örneklerinin 1,5 mL Eppendorf tüplerinde saklanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4 : Caecum mikrobiyota çeşitliliğinin karşılaştırılması. Sham ve TBI gruplarının caecum içeriğinde en bol takson, TBI'den 3 gün sonra farelerde kaecum mikrobiyotasının çeşitliliğinin azaldığını göstermiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5 : NMDS analizi. Metrik olmayan çok boyutlu ölçekleme (NMDS) TBI sonra caecum mikrobiyota nın bileşiminin değiştiğini gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan farelerde TBI sonra cekal mikrobiyota değişiklikleri belirlemek için basit ve verimli bir protokoldür. Beyin hasarının indüksiyonu ve caecum içerik örneklerinin toplanması protokolün kritik parçalarıdır.
Araştırmacılar TBI aşağıdaki bağırsak mikrobiyota değişiklikleri incelediolmasına rağmen, Bu çalışmalarda kullanılan beyin hasarı CCI-8 ve kilo damla / darbe kaynaklı modeller9. Ancak, CCI modeli çoğunlukla beyin kontüzyonu çoğaltır, ve ağırlık bırakma modeli bazı yanlışlıklar muzdarip olabilir. Tüm mevcut beyin hasarı modelleri arasında, LFPI en sık kullanılan modeldir, hangi fokal ve diffüz beyin hasarı içerir11,12 ve klinik TBI hastalarında gözlenen birçok önemli özellikleri çoğaltır. Süreç boyunca önemli adımlar dura korunması ve kanül hava geçirmez tutmak içerir. Ancak, hem kraniyotomi hem de konlüskop, bu protokolün bir sınırlaması olabilir yetenekli bir sanatçının çalışmasını gerektirir. Ancak, LFPI hala basit, kararlı ve doğru bir yöntemdir. Bu nedenle, farelerde TBI bu çalışmada LFPI kullanılarak indüklenen, hangi protokol daha temsili ve beyin hasarı araştırma değerli hale getirir.
Bağırsak mikrobiyota analizi için, dışkı örnekleri non-invazivlik ve kolaylık için kullanılmıştır. Yine de, dışkı örnekleme bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, belirli bir zaman noktasında her faretoplanan dışkı miktarı küçüktür ve dışkı miktarı 16S-rDNA analizi gerçekleştirmek için yetersiz olabilir. İkinci olarak, travma sonrası gastrointestinal disfonksiyon nedeniyle, dışkı örnekleri beyin hasarı sonrası akut faz sırasında toplamak zordur (Bu çalışmada 1 saat sonrası yaralanma). Buna ek olarak, kanıtlar dışkı mikrobiyota bileşimi diğer bağırsak segmentlerinde mikrobiyota farklı olduğunu göstermiştir13. Bu nedenle bu çalışmada bağırsak mikrobiyota analizi için caecum içeriği toplanmıştır. Caecum içerik örnekleme fareler kurban gerektirir, ve bu yöntem histolojik ve immünolojik incelemeler için bağırsak örnekleme sağlar, hangi beyin hasarına bağlı bağırsak disfonksiyonu çalışmalarında önemli araştırma yönleri olan. Ayrıca, Bu yöntem jejunum da dahil olmak üzere diğer gastrointestinal yollarmikrobiyota değişiklikleri araştırmak için kullanılabilir, ileum, ve kolon. Sonuç olarak, bu protokol bağırsak mikrobiyotasında TBI kaynaklı değişiklikleri incelemek için ideal bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar içtenlikle onun teknik rehberlik için Baohong Wang teşekkür ederim.
Acknowledgments
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA isolation kit | QIAGEN | 51604 | For fast purification of genomic DNA from stool samples |
| Gene analysis service | GENEWIZ | Gene analyse service | |
| Heating pad | Shanghai SAFE Biotech Co. | TR-200 | heating pad |
| Injector | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | injector | |
| LFPI device | Virginia Commonwealth University |
FP302 | LFPI device |
| Micro cranial drill | RWD Life Science | 78061 | Micro cranial drill |
| Povidone Iodine | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | Povidone Iodine |
References
- Cheng, P., et al. Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study. 14, e1002332 (2017).
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S.
- Kabadi, S. V., et al. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease. Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).
- Collins, S. M., Surette, M., Bercik, P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nature Reviews Microbiology. 10, 735-742 (2012).
- Cryan, J. F., Dinan, T. G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).
- Nicholson, S. E., et al. Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent. Shock. , (2018).
- Houlden, A., et al. Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production. Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).
- Treangen, T. J., et al. Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome. Frontiers in Immunology. 9, 2757 (2018).
- Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
- Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way. Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).
