Summary
Presenteras här är ett protokoll för att inducera diffusa traumatisk hjärnskada med hjälp av en lateral vätska slagverk enhet följt av insamling av blindtarmen innehåll för Gut mikrobiomet analys.
Abstract
Ökande bevis visar att bakterieflora-Gut-Brain-axeln spelar en viktig roll i patogenesen av hjärnsjukdomar. Flera studier visar också att traumatiska hjärnskador orsaka förändringar i tarmen bakterieflora. Mekanismerna bakom den dubbelriktade regleringen av hjärn-tarmaxeln är dock fortfarande okända. För närvarande finns det få modeller för att studera förändringarna i Gut bakterieflora efter traumatisk hjärnskada. Därför, den presenterade studien kombinerar protokoll för att inducera traumatisk hjärnskada med hjälp av en lateral vätska slagverk enhet och analys av blindtarmen prover efter skada för att utreda förändringar i tarmen microbiome. Förändringar av tarmfloran sammansättning efter traumatisk hjärnskada bestäms med hjälp av 16S-rDNA sekvensering. Detta protokoll ger en effektiv metod för att studera relationerna mellan enteriska mikroorganismer och traumatisk hjärnskada.
Introduction
Traumatisk hjärnskada (TBI) är ett globalt folkhälsoproblem och den vanligaste dödsorsaken och handikapp hos unga vuxna1,2. TBI orsakar många dödsfall varje år, och överlevande upplever en mängd olika fysiska, psykiatriska, emotionella och kognitiva funktionsnedsättningar. Därför är TBI en tung börda för patientens familje-och samhällsresurser. TBI involverar både den primära hjärnskada som uppstår vid tiden för trauma och eventuella sekundära hjärnskador som utvecklar timmar till månader efter initial skada. Sekundär hjärnskada medieras av flera biokemiska kaskader, som inte bara är skadliga för hjärnan utan också har betydande negativa effekter på olika organsystem, inklusive det gastrointestinala systemet3.
För närvarande finns det tre modeller för att inducera TBI i djurförsök: Fluid slag verks skada, kontroll kortikal påverkan (CCI), och vikt droppe acceleration. Lateral Fluid slag verks skada (LFPI) är den mest använda modellen för att etablera diffus hjärnskada (DAI)4. Enheten producerar hjärnskada genom en kraniektomi genom att tillämpa en kort vätsketryck puls till intakt Dura. Denna puls skapas av strejken av pendeln. LFPI är en reproducerbar och kontrollerbar modelleringsmetod för TBI Research.
Mikrobiomen definieras som de kollektiva genomerna av alla mikroorganismer som vistas i människokroppen. Intestinal mikrober i synnerhet inte bara spela en viktig roll i intestinal homeostas och funktion, men också reglera många aspekter av värdfysiologi och funktionen av andra organ5. Under de senaste åren, det finns ökande bevis som tyder på att Gut bakterieflora reglera hjärnans utveckling och funktion via Brain-Gut axlar6. Störningar i tarmfloran har kopplats till flera störningar i hjärnans funktion inklusive Parkinsons sjukdom, humörsvängningar, och autism7. Nyligen, prekliniska studier har också rapporterat att akut hjärnskada kan framkalla förändringar i Gut bakterieflora8,9.
En studie av Treangen et al.10 fann signifikanta minskningar i tre mikrobiella arter och ökningar av två mikrobiella arter efter CCI-inducerad TBI. Detta tyder på att modulering av tarmfloran kan vara en terapeutisk metod i TBI Management. Emellertid, mekanismerna bakom hjärnskada-inducerad Gut bakterieflora förändringar förblir okända. Av denna anledning, en relativt enkel och effektiv modell för att studera förändringarna i Gut bakterieflora efter TBI krävs. Därför presenterar den aktuella studien ett protokoll för att undersöka förändringar i tarmfloran efter TBI hos möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla utförda procedurer godkändes av den experimentella djur etikkommittén vid Zhejiang-universitetet. Alla instrument och material som används i kirurgi är sterila. TBI proceudre tar ca 20 minuter.
1. djuromsorg
- Använd 5-till 6-veckors-gamla manliga C57BL/6J möss (20-25 g vikt) i detta experiment.
- Behåll möss på en 12 h/12 h ljus/mörk cykel, och se till att de får mat och vatten AD libitum. Ge samma mängder av mat och vatten till både bluff och TBI grupper under hela studien.
- Gör alla ansträngningar för att minimera djurens smärta och obehag.
2. induktion av traumatisk hjärnskada
- Injicera ketamin (80-100 mg/kg)/xylazin (10 mg/kg) IP för anestesi. Testa djupet av anestesi med hjälp av en ögon reflex eller smärt reflex. Använd konstgjorda tårar eller smörjmedel ögonsalva för att hålla ögonen från torkning.
- Efter anestesi, sätta musen i liggande läge. Använd en temperaturkontrollerad värmedyna för att bibehålla temperaturen vid 37 ° c under operationen och för 30 min efter TBI.
- Raka håret i snitt området.
- Desinficera hårbotten med 70% etanol med hjälp av tre alternerande Scrubs, sedan incisionsfilm hårbotten i ett sagittal plan.
- Använd pinkoppar för att dra in snittet på båda sidor och separera periostet något.
- Använd en markör för att rita en cirkel (3 mm diameter) på den högra parietala området av skallen, 2 mm bort från mittlinjen.
- Borra skallen med en elektrisk borr. Se till att detta steg manövreras försiktigt för att skydda Dura från att skadas.
- Ta bort ben luckan och exponera ett litet ben fönster (3 mm i diameter).
- Placera en plast skada kanyl (inre diameter = 2,5 mm, längd = 8 mm) över kraniotomi och cement kanyl till skallen med hjälp av en Dental akryl.
- Fyll kanyl med steril 0,9% NaCl (normal saltlösning) med hjälp av en spruta (5 mL) för att säkerställa att det inte finns några bubblor i kanyl.
- Slå på oscilloskopet och förstärkaren och se till att högtrycks röret av den laterala vätska slag verks skada (LFPI) enheten är fri från luftbubblor. Testa enheten genom att leverera cirka 10 pulser tills den ger en stadig signal. Justera vinkeln på pendelns startposition för att nå en pulsintensitet på cirka 2,0 ATM.
- Anslut skadan kanyl till lfpi enheten. Inducera hjärnskada genom att dra avtryckaren och släppa pendeln. Sedan, få en puls och överföra den till Dura genom hela slutna vätskefyllda slangsystem.
- Manövrera möss i simulerad grupp med samma kirurgiska ingrepp. Utför inte LFPI.
3. behandling efter operationen
- Efter att inducera hjärnskada, ta bort plasten kanyl och sutur snittet. Under operationen administrera buprenorfin (2mg/kg) SQ eller IP och därefter varje 6-12 h i tre dagar.
- Lägg musen på en värmedyna tills den är ambulatorisk. Ställ in temperaturen på värmeplattan till 37 ° c för att påskynda bedövningsmedel återupplivning.
- Sätt tillbaka musen i buren och administrera mat och vatten AD libitum.
4. laparotomi och provinsamling från blindtarmen
- Euthanize möss genom CO2 följt av cervikal dislokation vid motsvarande tidpunkter.
Anmärkning: i detta experiment, den valda tiden punkter var 1 h, 6 h, 1 d, 3 d, och 7 d posttraumatisk hjärnskada för att analysera den dynamiska utvecklingen av Gut Microbiota. - Ta bort håret från ytan av buken. Desinficera buken med 70% etanol.
- Placera en steril drapera över musen. Gör ett snitt från nedre delen av buken mittlinjen, strax ovanför förhuden i hanmöss.
- Efter tarmen är utsatta, lokalisera blindtarmen och försiktigt separerade den från andra tarm skrifter. Undvik att greppa blindtarmen med tandade eller vassa pinprut. Använd in atraumatiska pincett, såsom Adson pinps med serrations.
- Skär blindtarmen med vassa saxar.
- Extrahera blindtarmen innehållet manuellt på steril dressing och förvara innehållet i 1,5 ml microcentrifug rör.
- Förvara innehållet i blindtarmen vid-80 ° c tills mikrobiomet-analys.
5. DNA-extraktion och 16S-rDNA sekvensering och dataanalys
-
Isolering av DNA från avföring
Anmärkning: en kommersiellt tillgänglig DNA-isoleringssats (tabell över material) användes för detta experiment.- Använd en skalpell att skrapa 300 mg avföring i en 2 mL microcentrifug röret och placera röret på is.
- Tillsätt 1 mL inhiberningsbuffert till varje prov. Vortex kontinuerligt under 1 min eller tills avföringen provet grundligt homogeniseras.
- Centrifugera provet med maximal hastighet för 1 min till pellets avföring partiklarna.
- Pipettera över 2 μl proteinas K till ett nytt 2 ml microcentrifugerör. Pipet 600 μL av supernatanten från steg 5.1.3 till 2 mL microcentrifug tub innehållande proteinas K. Tillsätt sedan 600 μL buffert 1 och Vortex för 15 s.
- Inkubera provet vid 70 ° c i 10 min.
- Tillsätt 600 μL 100% etanol till lysate (1:1 ratio) och blanda med vortexing. Centrifugera vid den maximala hastigheten kort för att ta bort droppar från insidan av röret locket.
- Applicera 600 μL av lysatet till spinkolonnen. Centrifugera vid maxhastigheten i 1 min. Kassera genomflödet. Upprepa detta steg en gång till. Överför sedan kolonnen till ett nytt uppsamlings rör med 2 mL.
- Öppna rotations kolumnen och tillsätt 500 μL buffert 2. Centrifugera med maximal hastighet i 1 min. ta bort kolonnen och placera den i ett nytt uppsamlings rör med 2 mL.
- Tillsätt 500 μL buffert 3 i kolonnen. Centrifugera vid maxhastigheten i 3 min. Kassera genomflödet. Upprepa centrifugeringsprocessen en gång för att säkerställa att bufferten 3 är helt eluerad.
- Placera spinkolonnen i ett nytt tub 2 mL samlingsrör och Pipettera 200 μL buffert 4 direkt på membranet. Inkubera i 1 min vid rumstemperatur (RT), Centrifugera sedan med maximal hastighet i 1 min till eluera-DNA.
-
16S-rDNA sekvensering och dataanalys
- Använd 20-30 ng av DNA för att generera amplicons.
- Använd kommersiellt tillgängliga primers avsedda för de relativt bevarade regioner som gränsar till v3 och v4 hypervariabla regioner av bakterier 16S rDNA. De främre primrar som innehåller sekvensen "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT" och omvänd primers som innehåller sekvensen "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC" användes i den aktuella studien.
- Gör PCR-reaktionsblandningen genom att tillsätta 2,5 μL buffert 1, 2 μL dNTPs, 1 μL av varje primer, 0,5 μL DNA-polymeras och 20 ng av mallDNA i ett rör. Använd ddH2O för att justera Reaktionssystemet till 25 μl.
- Ställ in parametrarna för PCR-reaktionen på följande sätt: utför före denatureringen vid 94 ° c i 3 min en gång. Utför denaturering vid 94 ° c i 5 s, glöden vid 57 ° c för 90 s, Förläng vid 72 ° c i 10 s och upprepa detta 24x.
- Utför PE250/300 Parade-end sekvensering enligt tillverkarens instruktion och använda QIIME dataanalyspaket för 16S rRNA dataanalys.
Anmärkning: i detta experiment utfördes DNA-sekvensering och dataanalys främst av ett professionellt sekvenserings företag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering av TBI visas i figur 1. Efter anestesi och desinfektion, var hårbotten anskurna sagittally (figur 1a). En kraniotomi (3 mm i diameter) var trephined i skallen över den högra parietala cortex med en elektrisk borr, Dura hölls intakt (figur 1b, C). En plast skada kanyl placerades över ben fönstret och cementerade till skallen med hjälp av Dental akryl (figur 1d).
Förfarandet för laterala vätske slagverk visas i figur 2. Innan du startar enheten testades genom att leverera ca 10 pulser tills den ger en stadig signal. Pendelns vinkel justerades till startpositionen för att nå en pulsintensitet på ca 2,0 ATM (figur 2A). Kanylen fylldes med steril normal saltlösning. Då kanyl var ansluten till LFPI enheten (figur 2b). Hjärnskada inducerades genom att skapa en impuls i den slutna kraniala hålighet (figur 2C).
Laparotomi och blindtarmen fekal provinsamling visas i figur 3. Laparotomi utfördes på nedre delen av buken och längs mittlinjen (figur 3a). Den blindtarmen identifierades och försiktigt separerade (figur 3b, C). Den blindtarmen är vanligtvis ligger i nedre högra delen av buken. Det var sedan anskäras med vassa saxar (figur 3D). Innehållet i blindtarmen (figur 3e) har extraherats och lagrats i 1,5 ml-rör (figur 3F). Fekala prover lagrades omedelbart vid-80 ° c innan de används vidare.
16s-rDNA sekvensering visade minskad mångfald av blindtarmen bakterieflora hos möss 3 dagar efter TBI visades de vanligast förekommande taxa i blindtarmen innehåll av Sham och TBI grupper i figur 4. Den Wilcoxon Rank sum test utfördes för att utvärdera bakterieflora skillnader mellan TBI och simulerade grupper i 16s sekvensering analys, och p -värdet var mindre än 0,05. Den icke-metriska flerdimensionella skalning (nmds) visade också ändrad sammansättning av blindtarmen bakterieflora efter TBI (figur 5).
Figur 1 : Etablering av TBI. (A) efter anestesi och desinfektion, var hårbotten anskurna. (B) driva en circinate kraniotomi på skallen över den högra parietala cortex. (C) Håll Dura intakt. (D) cementera plast skadan kanyl till skallen med hjälp av Dental akryl. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Förfarandet för laterala Fluid slagverk. (A) justering av pendelns start positions vinkel. Bfyllning av kanyl med steril normal saltlösning, därefter anslutning av kanyl till LFPI-anordningen. (C) hjärnskada induktion genom frisättning av pendeln och skapandet av en impuls till den slutna kraniala hålighet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Laparotomi och blindtarmen fekal provsamling. (A) början av laparotomi från nedre delen av buken och längs mittlinjen. (B, C) Identifiering av blindtarmen och efterföljande (skonsam) borttagning. Dkapning av kaecum med vassa saxar. Eextraktion av innehållet i Caecum. Flagring av prover av blindtarmen-innehåll i 1,5 ml Eppendorf-rör. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Jämförelsen av blindtarmen bakterieflora mångfald. De vanligast förekommande taxa i blindtarmen innehåll av Sham och TBI grupper visade minskad mångfald av blindtarmen bakterieflora i möss 3 dagar efter TBI. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Den NMDS-analys. Icke-metriska flerdimensionella skalning (nmds) visade ändrad sammansättning av blindtarmen bakterieflora efter TBI. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Presenteras här är ett enkelt och effektivt protokoll för att fastställa förändringar i cecal bakterieflora efter TBI hos möss. Induktion av hjärnskada och insamling av blindtarmen innehåll prover är kritiska delar av protokollet.
Trots att forskare har studerat förändringarna i tarmfloran efter TBI, var den hjärnskada som användes i dessa studier CCI-8 och vikt fall/Impact-inducerad modeller9. Emellertid, CCI-modellen replikerar mestadels hjärn kontusion, och vikt droppe modellen kan drabbas av vissa felaktigheter. Bland alla befintliga hjärnskada modeller, lfpi är den mest använda modellen, som inkluderar Focal och diffus hjärnskada11,12 och replikerar många viktiga funktioner som observerats i kliniska TBI patienter. Viktiga steg i hela processen inkluderar skydd av Dura och hålla kanyl lufttät. Men både kraniotomi och konglutination kräver driften av en skicklig artist, vilket kan vara en begränsning av detta protokoll. LFPI är dock fortfarande en enkel, stabil och korrekt metod. Därför inducerades TBI hos möss med hjälp av LFPI i denna studie, vilket gör protokollet mer representativt och värdefullt i hjärnskadeforskning.
För Gut bakterieflora analys, fekal prover användes för dess icke-invasivitet och bekvämlighet. Det finns dock vissa begränsningar av fekal provtagning. Först, mängden avföring samlas i varje mus vid en viss tidpunkt är liten, och mängden avföring kan vara otillräcklig för att utföra 16S-rDNA analys. För det andra, på grund av posttraumatisk gastrointestinal dysfunktion, avföring prover är svåra att samla in under den akuta fasen efter hjärnskada (1 h efter skada i denna studie). Dessutom, bevis har visat att fekal bakterieflora sammansättning skiljer sig från bakterieflora i andra tarm segment13. Därför, blindtarmen innehåll samlades in för Gut bakterieflora analys i denna studie. Caecum innehåll provtagning kräver att möss offras, och denna metod möjliggör provtagning av tarmkanalen för histologiska och immunologiska undersökningar, som är viktiga forskningsaspekter i studier av hjärnskada-inducerad tarm dysfunktion. Dessutom, denna metod kan användas för att undersöka bakterieflora förändringar i andra gastrointestinala skrifter inklusive jejunum, ileum, och kolon. Sammanfattningsvis är detta protokoll en idealisk metod för att studera TBI-inducerad förändringar i Gut Microbiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna tackar uppriktigt Baohong Wang för hennes tekniska vägledning.
Acknowledgments
Författarna har inget att avslöja.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA isolation kit | QIAGEN | 51604 | For fast purification of genomic DNA from stool samples |
| Gene analysis service | GENEWIZ | Gene analyse service | |
| Heating pad | Shanghai SAFE Biotech Co. | TR-200 | heating pad |
| Injector | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | injector | |
| LFPI device | Virginia Commonwealth University |
FP302 | LFPI device |
| Micro cranial drill | RWD Life Science | 78061 | Micro cranial drill |
| Povidone Iodine | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | Povidone Iodine |
References
- Cheng, P., et al. Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study. 14, e1002332 (2017).
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S.
- Kabadi, S. V., et al. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease. Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).
- Collins, S. M., Surette, M., Bercik, P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nature Reviews Microbiology. 10, 735-742 (2012).
- Cryan, J. F., Dinan, T. G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).
- Nicholson, S. E., et al. Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent. Shock. , (2018).
- Houlden, A., et al. Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production. Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).
- Treangen, T. J., et al. Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome. Frontiers in Immunology. 9, 2757 (2018).
- Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
- Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way. Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).
