Summary
Présenté ici est un protocole pour induire des lésions cérébrales traumatiques diffuses à l'aide d'un dispositif de percussion de fluide latéral suivi de la collecte de la teneur en caecum pour l'analyse du microbiome intestinal.
Abstract
De plus en plus de preuves montrent que l'axe microbiote-intestin-cerveau joue un rôle important dans la pathogénie des maladies du cerveau. Plusieurs études démontrent également que les lésions cérébrales traumatiques causent des changements au microbiote intestinal. Cependant, les mécanismes sous-jacents à la régulation bidirectionnelle de l'axe cerveau-intestin restent inconnus. Actuellement, peu de modèles existent pour étudier les changements dans le microbiote intestinal après des lésions cérébrales traumatiques. Par conséquent, l'étude présentée combine des protocoles pour induire des lésions cérébrales traumatiques à l'aide d'un dispositif latéral de percussion de fluide et l'analyse des échantillons de caecum après des dommages pour étudier des altérations dans le microbiome d'intestin. Des modifications de la composition de microbiote d'intestin après des dommages traumatiques de cerveau sont déterminées utilisant le séquençage 16S-rDNA. Ce protocole fournit une méthode efficace pour étudier les relations entre les micro-organismes entériques et les lésions cérébrales traumatiques.
Introduction
Les lésions cérébrales traumatiques (ITT) sont un problème de santé publique mondial et la principale cause de décès et d'invalidité chez les jeunes adultes1,2. TBI provoque de nombreux décès chaque année, et les survivants éprouvent une variété de handicaps physiques, psychiatriques, émotionnels et cognitifs. Par conséquent, l'ITC est un lourd fardeau pour la famille et les ressources sociétales d'un patient. TBI implique à la fois les lésions cérébrales primaires qui se produisent au moment du traumatisme et les lésions cérébrales secondaires qui se développent des heures à des mois après les blessures initiales. Les lésions cérébrales secondaires sont médiées par plusieurs cascades biochimiques, qui sont non seulement préjudiciables au cerveau, mais ont également des effets négatifs significatifs sur divers systèmes d'organes, y compris le système gastro-intestinal3.
Actuellement, il existe trois modèles pour induire TBI dans les expériences animales: blessures de percussion fluide, contrôle de l'impact cortical (CCI), et l'accélération de la baisse de poids. Les lésions latérales des percussions de fluide (LFPI) est le modèle le plus couramment utilisé pour établir les lésions cérébrales diffuses (DAI)4. L'appareil produit des lésions cérébrales par une cranictomie en appliquant une brève impulsion de pression liquide à la dura intacte. Cette impulsion est créée par la frappe du pendule. LFPI est une méthode de modélisation reproductible et contrôlable pour la recherche sur l'ITC.
Le microbiome est défini comme les génomes collectifs de tous les micro-organismes qui résident dans le corps humain. Les microbes intestinaux en particulier jouent non seulement un rôle important dans l'homéostasie intestinale et la fonction, mais régulent également de nombreux aspects de la physiologie de l'hôte et le fonctionnement d'autres organes5. Ces dernières années, il y a de plus en plus de preuves qui indiquent que le microbiote intestinal régule le développement et le fonctionnement du cerveau par l'intermédiaire des axes cerveau-intestin6. La perturbation du microbiote intestinal a été liée à plusieurs troubles de la fonction cérébrale, y compris la maladie de Parkinson, les troubles de l'humeur et l'autisme7. Récemment, des études précliniques ont également rapporté que les lésions cérébrales aigues peuvent induire des changements dans le microbiote intestinal8,9.
Une étude menée par Treangen et coll.10 a révélé des diminutions significatives chez trois espèces microbiennes et une augmentation de deux espèces microbiennes après l'ITC induite par l'ICC. Cette évidence indique que la modulation du microbiote d'intestin peut être une méthode thérapeutique dans la gestion de TBI. Cependant, les mécanismes sous-jacents aux changements induits par les lésions cérébrales du microbiote intestinal demeurent inconnus. Pour cette raison, un modèle relativement simple et efficace d'étudier les changements dans le microbiote intestinal après TBI est nécessaire. Par conséquent, la présente étude présente un protocole pour examiner les altérations du microbiote intestinal après TBI chez la souris.
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Protocol
Toutes les procédures effectuées ont été approuvées par le Comité expérimental d'éthique animale de l'Université du Zhejiang. Tous les instruments et matériaux utilisés en chirurgie sont stériles. Le proceudre TBI prend environ 20 minutes.
1. Soins aux animaux
- Utilisez des souris mâles de 5 à 6 semaines C57BL/6J (20-25 g de poids) dans cette expérience.
- Maintenir les souris sur un cycle de 12 h/12 h de lumière/obscurité, et assurez-vous qu'elles reçoivent de la nourriture et de l'eau ad libitum. Fournir les mêmes quantités de nourriture et d'eau aux groupes fictifs et TBI tout au long de l'étude.
- Faites tous les efforts pour minimiser la douleur et l'inconfort des animaux.
2. Induction de lésions cérébrales traumatiques
- Injecter de la kétamine (80-100 mg/kg)/Xylazine (10 mg/kg) IP pour l'anesthésie. Testez la profondeur de l'anesthésie à l'aide d'un réflexe oculaire ou d'un réflexe de douleur. Utilisez des déchirures artificielles ou de la pommade pour les yeux lubrifiants pour empêcher les yeux de sécher.
- Après l'anesthésie, mettre la souris en position couchée. Utilisez un coussin chauffant à température contrôlée pour maintenir la température à 37 oC pendant la chirurgie et pendant 30 min après TBI.
- Raser les cheveux de la zone d'incision.
- Désinfecter le cuir chevelu avec 70% d'éthanol à l'aide de trois gommages en alternance, puis inciser le cuir chevelu dans un plan sagittal.
- Utilisez des forceps pour rétracter l'incision des deux côtés et séparer légèrement le périosteum.
- Utilisez un marqueur pour dessiner un cercle (3 mm de diamètre) sur la zone pariétale droite du crâne, à 2 mm de la ligne médiane.
- Percer le crâne avec une perceuse électrique. Assurez-vous que cette étape est actionnée avec soin pour protéger la dura contre les dommages.
- Retirez le rabat osseux et exposez une petite fenêtre osseuse (3 mm de diamètre).
- Placer une canule de dommages en plastique (diamètre interne de 2,5 mm, longueur de 8 mm) sur la craniotomie et cimenter la canule au crâne à l'aide d'un acrylique dentaire.
- Remplissez la canule de NaCl stérile 0,9 % (salin normal) à l'aide d'une seringue (5 ml) pour s'assurer qu'il n'y a pas de bulles dans la canule.
- Allumez l'oscilloscope et l'amplificateur et assurez-vous que le tube à haute pression du dispositif de percussion latérale (LFPI) est exempt de bulles d'air. Testez l'appareil en livrant environ 10 impulsions jusqu'à ce qu'il donne un signal régulier. Ajustez l'angle de la position de départ du pendule pour atteindre une intensité d'impulsion d'environ 2,0 atm.
- Connectez la canule de blessure à l'appareil LFPI. Induire des lésions cérébrales en appuyant sur la gâchette et en libérant le pendule. Ensuite, obtenir une impulsion et la transmettre à la dura à travers l'ensemble du système fermé de tubes remplis de liquide.
- Opérer les souris dans le groupe de faux avec la même procédure chirurgicale. Ne pas effectuer la LFPI.
3. Traitement post-chirurgical
- Après avoir induié la lésion cérébrale, retirez la canule en plastique et suturez l'incision. Pendant la chirurgie administrer de la buprénorphine (2mg/kg) SQ ou IP et par la suite tous les 6-12 h pendant trois jours.
- Déposer la souris sur un coussin chauffant jusqu'à ce qu'il soit ambulatoire. Fixer la température du coussin chauffant à 37 oC pour accélérer la réanimation anesthésique.
- Remettre la souris dans la cage et administrer de la nourriture et de l'eau ad libitum.
4. Laparotomie et prélèvement d'échantillons du caecum
- Euthanasier les souris par CO2 suivie d'une luxation cervicale aux moments correspondants.
REMARQUE : Dans cette expérience, les points de temps choisis étaient 1 h, 6 h, 1 d, 3 d, et 7 d les dommages de cerveau post-traumatiques pour analyser l'évolution dynamique du microbiote d'intestin. - Enlever les cheveux de la surface de l'abdomen. Désinfecter l'abdomen avec 70% d'éthanol.
- Placer un drapé stérile sur la souris. Faire une incision de la ligne médiane de l'abdomen inférieur, juste au-dessus du prépuce chez les souris mâles.
- Après que les intestins sont exposés, localisez le cecum et séparez-le doucement des autres voies intestinales. Évitez de saisir le cecum avec des forceps dentés ou tranchants. Utilisez des forceps atraumatic, tels que les forceps Adson avec des dentelures.
- Couper le caecum avec des ciseaux pointus.
- Extraire manuellement le contenu du caecum sur un pansement stérile et entreposer le contenu dans des tubes microcentrifugeurs de 1,5 ml.
- Conserver le contenu du caecum à -80 oC jusqu'à ce que le microbiome soit analysé.
5. Extraction d'ADN et séquençage et analyse des données 16S-rDNA
-
Isolement de l'ADN des excréments
REMARQUE : Un kit d'isolement d'ADN disponible dans le commerce(Tableau des matériaux)a été utilisé pour cette expérience.- Utilisez un scalpel pour gratter 300 mg d'excréments dans un tube de microcentrifuge de 2 ml et placez le tube sur la glace.
- Ajouter 1 ml de tampon d'inhibition à chaque échantillon. Vortex en continu pendant 1 min ou jusqu'à ce que l'échantillon d'excréments soit complètement homogénéisé.
- Centrifuger l'échantillon à la vitesse maximale pendant 1 min pour granuler les particules d'excréments.
- Pipette 2 l de protéinase K dans un nouveau tube microcentrifuge de 2 ml. Pipet 600 l du supernatant de l'étape 5.1.3 dans le tube de microcentrifuge de 2 ml contenant la protéase K. Ensuite, ajoutez 600 l de tampon 1 et vortex pour 15 s.
- Incuber l'échantillon à 70 oC pendant 10 min.
- Ajouter 600 l'éthanol à 100 % au lysate (rapport 1:1) et mélanger par vortex. Centrifugeuse à la vitesse maximale brièvement pour enlever les gouttes de l'intérieur du couvercle du tube.
- Appliquer 600 l l de lysate sur la colonne de spin. Centrifugeuse à la vitesse maximale pendant 1 min. Jeter le flux. Répétez cette étape une fois de plus. Ensuite, transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte de 2 ml.
- Ouvrez la colonne de spin et ajoutez 500 l de Buffer 2. Centrifugeuse à la vitesse maximale pendant 1 min. Retirez la colonne et placez-la dans un nouveau tube de collecte de 2 ml.
- Ajouter 500 l de tampon 3 dans la colonne. Centrifugeuse à la vitesse maximale pendant 3 min. Jeter le flux. Répétez le processus de centrifugation une fois pour s'assurer que le tampon 3 est complètement élugé.
- Placez la colonne de spin dans un nouveau tube de collecte de 2 ml et une pipette de 200 l de tampon 4 directement sur la membrane. Incuber 1 min à température ambiante (RT), puis centrifuger à la vitesse maximale pendant 1 min pour élifier l'ADN.
-
16S-rDNA séquençage et analyse des données
- Utilisez 20-30 ng d'ADN pour générer des amplicônes.
- Utilisez des amorces disponibles dans le commerce conçues pour les régions relativement conservées en bordure des régions hypervariables V3 et V4 des bactéries 16S rDNA. Les amorces avant contenant la séquence "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAATAT" et les amorces inversées contenant la séquence "GGACTACNVGGGTWTTTAATCC" ont été utilisées dans la présente étude.
- Faire le mélange de réactions PCR en ajoutant 2,5 L de tampon 1, 2 L de dNTP, 1 L de chaque amorce, 0,5 l de polymérase d'ADN, et 20 ng d'ADN de modèle dans un tube. Utilisez ddH2O pour ajuster le système de réaction à 25 L.
- Définiz les paramètres de réaction PCR comme suit : effectuez la pré-dénaturation à 94 oC pendant 3 min une fois. Effectuer la dénaturation à 94 oC pour 5 s, l'annel à 57 oC pour 90 s, étendre à 72 oC pour 10 s, et répéter ce 24x.
- Effectuer le séquençage apparié PE250/300 selon les instructions du fabricant et utiliser le paquet d'analyse de données QIIME pour l'analyse des données 16S rRNA.
REMARQUE : Dans cette expérience, le séquençage de l'ADN et l'analyse des données ont été effectués principalement par une entreprise de séquençage professionnelle.
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Representative Results
L'établissement de l'ITC est indiqué à la figure 1. Après anesthésie et désinfection, le cuir chevelu a été incisé sagittalement (Figure 1A). Une craniotomie (3 mm de diamètre) a été trephined dans le crâne sur le cortex pariétal droit avec une perceuse électrique, le dura a été maintenu intact (Figure 1B, C). Une canule de dommages en plastique a été placée au-dessus de la fenêtre d'os et cimentée au crâne utilisant l'acrylique dentaire (figure 1D).
La procédure de percussion latérale fluide est montrée dans la figure 2. Avant de commencer l'appareil a été testé en livrant environ 10 impulsions jusqu'à ce qu'il donne un signal régulier. L'angle du pendule a été ajusté à la position de départ pour atteindre une intensité d'impulsion d'environ 2,0 atm (figure 2A). La canule a été remplie de la saline normale stérile. Ensuite, la canule a été connectée à l'appareil LFPI (Figure 2B). Les lésions cérébrales ont été induites par la création d'une impulsion dans la cavité crânienne fermée (figure 2C).
La laparotomie et la collecte d'échantillons fécaux de caecum sont présentées à la figure 3. La laparotomie a été pratiquée sur le bas-ventre et le long de la ligne médiane (figure 3A). Le caecum a été identifié et légèrement séparé (Figure 3B, C). Le caecum est habituellement situé dans la partie inférieure droite de l'abdomen. Il a ensuite été incisé avec des ciseaux pointus (Figure 3D). Le contenu du caecum (Figure 3E) a été extrait et stocké dans des tubes de 1,5 ml(figure 3F). Les échantillons de matières fécales ont été immédiatement entreposés à -80 oC avant d'être utilisés.
Le séquençage 16S-rDNA a démontré la diversité réduite du microbiote de caecum chez les souris 3 jours après TBI, le taxa le plus abondant dans le contenu de caecum des groupes de faux et de TBI ont été montrés dans la figure 4. Le test de la somme de grade de Wilcoxon a été effectué pour évaluer les différences de microbiote entre les groupes Det et les groupes fictifs dans l'analyse de séquençage 16S, et la valeur p était inférieure à 0,05. La mise à l'échelle multidimensionnelle non métrique (NMDS) a également montré une composition modifiée du microbiote du caecum après TBI (Figure 5).
Figure 1 : Création de TBI. (A) Après anesthésie et désinfection, le cuir chevelu a été incisé. (B) Opérer une craniotomie circinate sur le crâne sur le cortex pariétal droit. (C) Gardez la dura intacte. (D) Cimenter la canule de blessure en plastique au crâne utilisant l'acrylique dentaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : La procédure de percussion latérale fluide. (A) Ajustement de l'angle de position de départ du pendule. (B) Remplissage de la canule avec saline normale stérile, puis connexion de la canule à l'appareil LFPI. (C) Induction de lésions cérébrales par la libération du pendule et la création d'une impulsion dans la cavité crânienne fermée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Laparotomie et recueil d'échantillons fécaux de caecum. (A) Début de la laparotomie du bas-ventre et le long de la ligne médiane. (B,C) Identification du caecum et de l'enlèvement ultérieur (doux). (D) Coupe du caecum avec des ciseaux pointus. (E) Extraction du contenu du caecum. (F) Stockage des échantillons de teneur en caecum dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : La comparaison de la diversité du microbiote caecum. Le taxon le plus abondant dans la teneur en caecum des groupes de faux et de TBI a démontré la diversité réduite du microbiote de caecum chez les souris 3 jours après TBI. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : L'analyse NMDS. La mise à l'échelle multidimensionnelle non métrique (NMDS) a montré une composition modifiée du microbiote de caecum après TBI. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Présenté ici est un protocole simple et efficace pour déterminer les changements dans le microbiote cécal après TBI chez les souris. L'induction des lésions cérébrales et la collecte d'échantillons de contenu de caecum sont des parties critiques du protocole.
Bien que les chercheurs aient étudié les changements du microbiote intestinal à la suite de l'ITC, les lésions cérébrales utilisées dans ces études étaient l'ICC- 8 et les modèles induits par la baissede poids et l'impact9. Cependant, le modèle de l'ICC reproduit principalement la contusion cérébrale, et le modèle de chute de poids peut souffrir de certaines inexactitudes. Parmi tous les modèles existants de lésions cérébrales, le LFPI est le modèle le plus couramment utilisé, qui comprend les lésions cérébrales focales et diffuses11,12 et reproduit de nombreuses caractéristiques importantes observées chez les patients cliniques TBI. Les principales étapes du processus comprennent la protection de la dura et le maintien de la canule hermétique. Cependant, la craniotomie et la conglutination exigent le fonctionnement d'un interprète habile, qui peut être une limitation de ce protocole. Cependant, LFPI est toujours une méthode simple, stable et précise. Par conséquent, TBI chez les souris a été induit e utilisant LFPI dans cette étude, qui rend le protocole plus représentatif et précieux dans la recherche sur les lésions cérébrales.
Pour l'analyse du microbiote intestinal, des échantillons fécaux ont été utilisés pour sa non-invasivité et sa commodité. Néanmoins, il y a certaines limites de l'échantillonnage fécal. Tout d'abord, la quantité d'excréments recueillies chez chaque souris à un certain moment est faible, et la quantité d'excréments peut être insuffisante pour effectuer l'analyse 16S-rDNA. Deuxièmement, en raison d'un dysfonctionnement gastro-intestinal post-traumatique, les échantillons d'excréments sont difficiles à recueillir pendant la phase aigue après une lésion cérébrale (1 h après une blessure dans cette étude). En outre, les preuves ont montré que la composition du microbiote fécal est différente du microbiote dans d'autres segments intestinaux13. Par conséquent, le contenu de caecum a été rassemblé pour l'analyse de microbiote d'intestin dans cette étude. L'échantillonnage de contenu de Caecum exige que les souris soient sacrifiées, et cette méthode permet l'échantillonnage du tractus intestinal pour des examens histologiques et immunologiques, qui sont des aspects importants de recherche dans les études du dysfonctionnement intestinal induit par des dommages du cerveau. En outre, cette méthode peut être utilisée pour étudier les changements de microbiote dans d'autres voies gastro-intestinales, y compris le jejunum, l'iléum et le côlon. En conclusion, ce protocole est une méthode idéale pour étudier les changements induits par TBI dans le microbiote intestinal.
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Disclosures
Les auteurs remercient sincèrement Baohong Wang pour ses conseils techniques.
Acknowledgments
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA isolation kit | QIAGEN | 51604 | For fast purification of genomic DNA from stool samples |
| Gene analysis service | GENEWIZ | Gene analyse service | |
| Heating pad | Shanghai SAFE Biotech Co. | TR-200 | heating pad |
| Injector | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | injector | |
| LFPI device | Virginia Commonwealth University |
FP302 | LFPI device |
| Micro cranial drill | RWD Life Science | 78061 | Micro cranial drill |
| Povidone Iodine | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | Povidone Iodine |
References
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