Summary
Presentato qui è un protocollo per indurre lesioni cerebrali traumatiche diffuse utilizzando un dispositivo a percussione fluida laterale seguito dalla raccolta del contenuto di caecum per l'analisi del microbioma intestinale.
Abstract
Sempre più prove dimostrano che l'asse microbiota-gut-cervello svolge un ruolo importante nella patogenesi delle malattie cerebrali. Diversi studi dimostrano anche che le lesioni cerebrali traumatiche causano cambiamenti al microbiota intestinale. Tuttavia, i meccanismi alla base della regolazione bidirezionale dell'asse cervello-gut rimangono sconosciuti. Attualmente, esistono pochi modelli per studiare i cambiamenti nel microbiota intestinale dopo lesioni cerebrali traumatiche. Pertanto, lo studio presentato combina protocolli per indurre lesioni cerebrali traumatiche utilizzando un dispositivo di percussioni fluide laterale e l'analisi di campioni di caecum in seguito alla lesione per studiare le alterazioni nel microbioma intestinale. Le alterazioni della composizione del microbiota intestinale dopo lesioni cerebrali traumatiche sono determinate utilizzando il sequenziamento 16S-rDNA. Questo protocollo fornisce un metodo efficace per studiare le relazioni tra microrganismi enterici e lesioni cerebrali traumatiche.
Introduction
La lesione cerebrale traumatica (TBI) è un problema di salute pubblica globale e la principale causa di morte e disabilità nei giovani adulti1,2. TBI causa molti decessi ogni anno, e i sopravvissuti sperimentano una varietà di disabilità fisiche, psichiatriche, emotive e cognitive. Pertanto, la TBI è un pesante fardello per la famiglia e le risorse sociali di un paziente. TBI coinvolge sia la lesione cerebrale primaria che si verifica al momento del trauma e qualsiasi lesioni cerebrali secondarie che sviluppano ore a mesi dopo la lesione iniziale. Lesione cerebrale secondaria è mediata da diverse cascate biochimiche, che non sono solo dannose per il cervello, ma hanno anche effetti negativi significativi su vari sistemi di organi, tra cui il sistema gastrointestinale3.
Attualmente, ci sono tre modelli per indurre La TBI negli esperimenti sugli animali: lesione da percussione fluida, l'impatto corticale di controllo (CCI) e l'accelerazione della caduta di peso. Lesione di percussioni fluide laterali (LFPI) è il modello più comunemente usato per stabilire lesioni cerebrali diffuse (DAI)4. Il dispositivo produce lesioni cerebrali attraverso una craniectomia applicando un breve impulso di pressione del fluido alla dura intatta. Questo impulso è creato dallo sciopero del pendolo. LFPI è un metodo di modellazione riproducibile e controllabile per la ricerca TBI.
Il microbioma è definito come i genomi collettivi di tutti i microrganismi che risiedono nel corpo umano. I microbi intestinali, in particolare, non solo svolgono un ruolo importante nell'omeostasi intestinale e nella funzione, ma regolano anche molti aspetti della fisiologia dell'ospite e del funzionamento di altri organi5. Negli ultimi anni, ci sono prove crescenti che indicano che il microbiota intestinale regola lo sviluppo e la funzione del cervello tramite assi cervello-gut6. L'interruzione del microbiota intestinale è stata collegata a diversi disturbi della funzione cerebrale, tra cui il morbo di Parkinson, disturbi dell'umore e autismo7. Recentemente, studi preclinici hanno anche riferito che la lesione cerebrale acuta può indurre cambiamenti nel microbiota intestinale8,9.
Uno studio di Treangen et al.10 ha rilevato diminuzioni significative in tre specie microbiche e aumenti in due specie microbiche dopo il TBI indotto dal CCI. Questa evidenza indica che la modulazione del microbiota intestinale può essere un metodo terapeutico nella gestione TBI. Tuttavia, i meccanismi alla base dei cambiamenti del microbiota intestinale indotti da lesioni cerebrali rimangono sconosciuti. Per questo motivo, è necessario un modello relativamente semplice ed efficiente di studiare i cambiamenti nel microbiota intestinale dopo che è richiesto tè. Pertanto, il presente studio presenta un protocollo per esaminare le alterazioni nel microbiota intestinale dopo la TBI nei topi.
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Protocol
Tutte le procedure eseguite sono state approvate dal Comitato Sperimentale di Etica Animale dell'Università di Hejiang. Tutti gli strumenti e i materiali utilizzati in chirurgia sono sterili. Il processo di proceudre TBI dura circa 20 minuti.
1. Cura degli animali
- Utilizzare topi C57BL/6J maschi da 5 a 6 settimane (20-25 g di peso) in questo esperimento.
- Mantenere i topi su un ciclo di luce/buio di 12 h/12 h e assicurarsi che ricevano cibo e acqua al libitum. Fornire le stesse quantità di cibo e acqua a entrambi i gruppi farsa e TBI durante lo studio.
- Fai tutti gli sforzi per ridurre al minimo il dolore e il disagio degli animali.
2. Induzione di lesioni cerebrali traumatiche
- Iniettare Ketamina (80-100 mg/kg)/Xylazine (10 mg/kg) IP per l'anestesia. Testare la profondità dell'anestesia utilizzando un riflesso o dolore. Utilizzare lacrime artificiali o lubrificante unguento per mantenere gli occhi da asciugare.
- Dopo l'anestesia, mettere il topo in posizione prona. Utilizzare una piastra di riscaldamento a temperatura controllata per mantenere la temperatura a 37 gradi centigradi durante l'intervento chirurgico e per 30 min dopo TBI.
- Rasare i capelli dell'area di incisione.
- Disinfettare il cuoio capelluto con il 70% di etanolo utilizzando tre scrub alternati, quindi incise il cuoio capelluto in un piano sagittale.
- Utilizzare pinze per ritrarre l'incisione su entrambi i lati e separare leggermente il periosteo.
- Utilizzare un marcatore per disegnare un cerchio (3 mm di diametro) sull'area parietale destra del cranio, a 2 mm di distanza dalla linea mediana.
- Forare il cranio con un trapano elettrico. Assicurarsi che questo passaggio sia azionato con attenzione per proteggere la dura da essere danneggiata.
- Rimuovere il lembo osseo ed esporre una piccola finestra ossea (3 mm di diametro).
- Mettere una cannula di lesione plastica (diametro interno - 2,5 mm, lunghezza 8 mm) sopra la craniotomia e cementare la cannula al cranio utilizzando un acrilico dentale.
- Riempire la cannula con sterile 0.9% NaCl (normale salina) utilizzando una siringa (5 mL) per garantire che non ci siano bolle nella cannula.
- Accendere l'oscilloscopio e l'amplificatore e assicurarsi che il tubo ad alta pressione del dispositivo di lesione a percussione del fluido laterale (LFPI) sia privo di bolle d'aria. Testare il dispositivo fornendo circa 10 impulsi fino a quando non dà un segnale costante. Regolare l'angolo della posizione iniziale del pendolo per raggiungere un'intensità dell'impulso di circa 2,0 atm.
- Collegare la cannula lesione al dispositivo LFPI. Indurre lesioni cerebrali tirando il grilletto e rilasciando il pendolo. Quindi, ottenere un impulso e trasmetterlo alla dura attraverso l'intero sistema di tubing pieno di liquido chiuso.
- Operare i topi nel gruppo farsa con la stessa procedura chirurgica. Non eseguire il LFPI.
3. Trattamento post-chirurgico
- Dopo aver indurso la lesione cerebrale, rimuovere la cannula di plastica e suturare l'incisione. Durante l'intervento somministrato buprenorphine (2mg/kg) SQ o IP e successivamente ogni 6-12 h per tre giorni.
- Posare il mouse su una piastra di riscaldamento fino a quando non è ambulatoriale. Impostare la temperatura della piastra di riscaldamento a 37 gradi centigradi per accelerare la rianimazione anestetica.
- Rimettere il mouse nella gabbia e somministrare cibo e acqua ad libitum.
4. Laparotomia e raccolta di campioni dal caecum
- Eutanasia i topi da CO2 seguiti da lussazione cervicale nei punti temporali corrispondenti.
NOTA: In questo esperimento, i punti temporali scelti erano 1 h, 6 h, 1 d, 3 d e 7 d lesione cerebrale post-traumatica per analizzare l'evoluzione dinamica del microbiota intestinale. - Rimuovere i capelli dalla superficie dell'addome. Disinfettare l'addome con il 70% di etanolo.
- Posizionare un drappo sterile sul mouse. Fare un'incisione dalla linea mediana dell'addome inferiore, appena sopra il prepuzio nei topi maschi.
- Dopo che gli intestini sono esposti, individuare il cecum e separarlo delicatamente da altri tratti intestinali. Evitare di afferrare il cecum con pinze dentate o affilate. Utilizzare pinze atraumatiche, come pinze Adson con seghettature.
- Tagliare il caecum con le forbici affilate.
- Estrarre manualmente il contenuto di caecum su una medicazione sterile e conservare il contenuto in tubi di microcentrifuga da 1,5 mL.
- Conservare il contenuto di caecum a -80 gradi centigradi fino all'analisi del microbioma.
5. Estrazione del DNA e sequenziamento e analisi dei dati 16S-rDNA
-
Isolamento del DNA dalle feci
NOTA: per questo esperimento è stato utilizzato un kit di isolamento del DNA disponibile in commercio (Tabella dei materiali).- Utilizzare un bisturi per raschiare 300 mg di feci in un tubo di microcentrifuga da 2 mL e posizionare il tubo sul ghiaccio.
- Aggiungere 1 mL di buffer di inibizione ad ogni campione. Vortice continuo per 1 min o fino a quando il campione feci è accuratamente omogeneizzato.
- Centrifugare il campione alla velocità massima di 1 min per pellet le particelle feci.
- Pipette 2 - L di proteinasi K in un nuovo tubo di microcentrifuga da 2 mL. Tubo 600 -L del supernatante dal passo 5.1.3 nel tubo di microcentrifuga da 2 mL contenente proteinasi K. Quindi, aggiungere 600 l di Buffer 1 e vortice per 15 s.
- Incubare il campione a 70 gradi centigradi per 10 min.
- Aggiungere al lisa (rapporto 1:1) 600 luna del 100% e mescolare mediante vortice. Centrifuga alla massima velocità brevemente per rimuovere le gocce dall'interno del coperchio del tubo.
- Applicare 600 l ofthe alla colonna di spin. Centrifuga alla velocità massima per 1 min. Scartare il flusso attraverso. Ripetere questo passaggio ancora una volta. Quindi, trasferire la colonna in un nuovo tubo di raccolta 2 mL.
- Aprire la colonna di selezione e aggiungere 500 l of Buffer 2. Centrifuga alla velocità massima per 1 min. Rimuovere la colonna e posizionarla in un nuovo tubo di raccolta da 2 mL.
- Aggiungere 500 l di Buffer 3 nella colonna. Centrifuga alla velocità massima per 3 min. Scartare il flusso attraverso. Ripetere il processo di centrifugazione una volta per assicurarsi che il Buffer 3 sia completamente eluito.
- Posizionare la colonna di spin in un nuovo tubo da 2 mL e pipetta 200 -L di Buffer 4 direttamente sulla membrana. Incubare per 1 min a temperatura ambiente (RT), quindi centrifugare alla velocità massima per 1 min per eluire il DNA.
-
Sequenziamento e analisi dei dati 16S-rDNA
- Utilizzare 20-30 ng di DNA per generare amplicons.
- Utilizzare primer disponibili in commercio progettati per le regioni relativamente conservate confinanti con le regioni ipervariabili V3 e V4 dei batteri 16S rDNA. Nel presente studio sono stati utilizzati i primer a termine contenenti la sequenza "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT" e i primer invertiti contenenti la sequenza "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC".
- Apportare la miscela di reazioni PCR aggiungendo 2,5 l of Buffer 1, 2 - L di dNTP, 1 L di ogni primer, 0,5 l di polimerasi di DNA e 20 ng di DNA modello in un tubo. Utilizzare ddH2O per regolare il sistema di reazione a 25.
- Impostare i parametri di reazione PCR come segue: eseguire la pre-denaturazione a 94 gradi centigradi per 3 min una sola volta. Eseguire la denaturazione a 94 gradi centigradi per 5 s, anneal a 57 gradi per 90 s, estendere a 72oC per 10 s, e ripetere questo 24x.
- Eseguire il sequenziamento di estremità accoppiate PE250/300 in base alle istruzioni del produttore e utilizzare il pacchetto di analisi dei dati QIIME per l'analisi dei dati rRNA 16S.
NOTA: In questo esperimento, il sequenziamento del DNA e l'analisi dei dati sono stati eseguiti principalmente da una società di sequenziamento professionale.
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Representative Results
La creazione di TBI è illustrata nella Figura 1. Dopo l'anestesia e la disinfezione, il cuoio capelluto è stato inciso sagittally (Figura 1A). Una craniotomia (3 mm di diametro) è stata trafitta nel cranio sopra la corteccia parietale destra con un trapano elettrico, la dura è stata mantenuta intatta (Figura 1B,C). Una cannula di lesione plastica è stata posta sopra la finestra ossea e cementata al cranio utilizzando acrilico dentale (Figura 1D).
La procedura di percussioni fluide laterali è mostrata figura 2. Prima di iniziare il dispositivo è stato testato fornendo circa 10 impulsi fino a quando non dà un segnale costante. L'angolo del pendolo è stato regolato alla posizione iniziale per raggiungere un'intensità dell'impulso di circa 2,0 atm (Figura 2A). La cannula era piena di sterile normale salina. Quindi la cannula è stata collegata al dispositivo LFPI (Figura 2B). La lesione cerebrale è stata indotta creando un impulso nella cavità cranica chiusa (Figura 2C).
Laparotomy e caecum fecal collection sono mostrati Figura 3. La laparotomia è stata eseguita sull'addome inferiore e lungo la linea mediana (Figura 3A). Il caecum è stato identificato e separato delicatamente (Figura 3B,C). Il caecum si trova di solito nella parte inferiore destra dell'addome. E 'stato poi incisato con forbici affilate (Figura 3D). Il contenuto del caecum (Figura 3E) è stato estratto e conservato in tubi da 1,5 mL (Figura 3F). I campioni fecali sono stati immediatamente conservati a -80 gradi centigradi prima di un ulteriore utilizzo.
Il sequeging 16S-rDNA ha dimostrato una ridotta diversità di microbiota di caecum nei topi 3 giorni dopo il TBI, il taxa più abbondante nel contenuto di cesità dei gruppi di sham e TBI è stato mostrato nella Figura 4. Il test di somma di classificazione Wilcoxon è stato eseguito per valutare le differenze di microbiota tra TBI e gruppi fittizi nell'analisi del sequenziamento 16S e il valore p era inferiore a 0,05. Il ridimensionamento multidimensionale non metrico (NMDS) ha anche mostrato una composizione modificata del microbiota del caecum dopo t- TBI (Figura 5).
Figura 1 : Istituzione di TBI. (A) Dopo l'anestesia e la disinfezione, il cuoio capelluto è stato inciso. (B) Azionare una craniotomia cicinata sul cranio sulla corteccia parietale destra. (C) Mantenere intatta la dura. (D) Cementare la cannula di plastica al cranio utilizzando acrilico dentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : La procedura di percussioni fluide laterali. (A) Regolazione dell'angolo di posizione iniziale del pendolo. (B) Riempimento della cannula con sterile normale salina, quindi collegamento della cannula al dispositivo LFPI. (C) Induzione delle lesioni cerebrali per rilascio del pendolo e creazione di un impulso nella cavità cranica chiusa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : raccolta di campioni fecali laparotomia e caecum. (A) Inizio della laparotomia dall'addome inferiore e lungo la linea mediana. (B, C) Identificazione del caecum e successiva rimozione (delicata). (D) Taglio del caecum con forbici affilate. (E) Estrazione del contenuto di caecum. (F) Memorizzazione dei campioni di contenuto di caecum in tubi Eppendorf da 1,5 mL. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Il confronto della diversità del microbiota di caecum. Il taxa più abbondante nel contenuto di ceecum dei gruppi di farsa e TBI ha dimostrato una ridotta diversità del microbiota di caecum nei topi 3 giorni dopo la TBI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : l'analisi NMDS. Il ridimensionamento multidimensionale non metrico (NMDS) ha mostrato una composizione modificata del microbiota del caecum dopo il TBI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Presentato qui è un protocollo semplice ed efficiente per determinare i cambiamenti nel microbiota cecale dopo il TBI nei topi. L'induzione di lesioni cerebrali e la raccolta di campioni di contenuto di caecum sono parti critiche del protocollo.
Nonostante i ricercatori abbiano studiato i cambiamenti del microbiota intestinale dopo la TBI, la lesione cerebrale utilizzata in questi studi era CCI-8 e modelli di goccia/impatto indotti9. Tuttavia, il modello CCI replica per lo più la contusione cerebrale, e il modello di caduta di peso può soffrire di alcune imprecisioni. Tra tutti i modelli di lesioni cerebrali esistenti, LFPI è il modello più comunemente usato, che include lesioni cerebrali focali e diffuse11,12 e replica molte caratteristiche importanti osservate nei pazienti clinici TBI. Le fasi chiave durante tutto il processo includono la protezione della dura e il mantenimento ermetico della cannula. Tuttavia, sia la craniotomia che la congolazione richiedono il funzionamento di un esecutore qualificato, che può essere una limitazione di questo protocollo. Tuttavia, LFPI è ancora un metodo semplice, stabile e preciso. Pertanto, TBI nei topi è stato indotto utilizzando LFPI in questo studio, che rende il protocollo più rappresentativo e prezioso nella ricerca sulle lesioni cerebrali.
Per l'analisi del microbiota intestinale, sono stati utilizzati campioni fecali per la sua non invasiva e convenienza. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni del campionamento fecale. In primo luogo, la quantità di feci raccolte in ogni topo in un certo punto temporale è piccola e la quantità di feci potrebbe essere insufficiente per eseguire l'analisi 16S-rDNA. In secondo luogo, a causa di disfunzione gastrointestinale post-traumatica, i campioni di feci sono difficili da raccogliere durante la fase acuta dopo la lesione cerebrale (1 h post-lesione in questo studio). Inoltre, le prove hanno dimostrato che la composizione del microbiota fecale è diversa dal microbiota in altri segmenti intestinali13. Pertanto, il contenuto di caecum è stato raccolto per l'analisi del microbiota intestinale in questo studio. Il campionamento del contenuto di Caecum richiede che i topi siano sacrificati, e questo metodo consente il campionamento del tratto intestinale per esami istologici e immunologici, che sono importanti aspetti di ricerca negli studi sulla disfunzione intestinale indotta da lesioni cerebrali. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per studiare i cambiamenti di microbiota in altri tratti gastrointestinali tra cui il jejunum, ileum, e colon. In conclusione, questo protocollo è un metodo ideale per studiare i cambiamenti indotti da TBI nel microbiota intestinale.
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Disclosures
Gli autori ringraziano sinceramente Baohong Wang per la sua guida tecnica.
Acknowledgments
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA isolation kit | QIAGEN | 51604 | For fast purification of genomic DNA from stool samples |
| Gene analysis service | GENEWIZ | Gene analyse service | |
| Heating pad | Shanghai SAFE Biotech Co. | TR-200 | heating pad |
| Injector | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | injector | |
| LFPI device | Virginia Commonwealth University |
FP302 | LFPI device |
| Micro cranial drill | RWD Life Science | 78061 | Micro cranial drill |
| Povidone Iodine | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | Povidone Iodine |
References
- Cheng, P., et al. Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study. 14, e1002332 (2017).
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S.
- Kabadi, S. V., et al. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease. Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).
- Collins, S. M., Surette, M., Bercik, P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nature Reviews Microbiology. 10, 735-742 (2012).
- Cryan, J. F., Dinan, T. G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).
- Nicholson, S. E., et al. Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent. Shock. , (2018).
- Houlden, A., et al. Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production. Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).
- Treangen, T. J., et al. Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome. Frontiers in Immunology. 9, 2757 (2018).
- Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
- Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way. Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).
