Summary
यहाँ प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल पेट microbiome विश्लेषण के लिए caecum सामग्री के संग्रह के बाद एक पार्श्व द्रव टक्कर डिवाइस का उपयोग कर फैलाना दर्दनाक मस्तिष्क चोट प्रेरित करने के लिए है.
Abstract
बढ़ते सबूत से पता चलता है कि microbiota-गट मस्तिष्क अक्ष मस्तिष्क रोगों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. कई अध्ययनों से यह भी पता चलता है कि दर्दनाक मस्तिष्क चोटों आंत microbiota में परिवर्तन का कारण. हालांकि, मस्तिष्क-गट अक्ष के द्विदिश विनियमन अंतर्निहित तंत्र अज्ञात रहते हैं। वर्तमान में, कुछ मॉडल दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के बाद आंत microbiota में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए मौजूद हैं. इसलिए, प्रस्तुत अध्ययन एक पार्श्व द्रव टक्कर डिवाइस और आंत microbiome में परिवर्तन की जांच के लिए चोट के बाद सीकम के नमूने के विश्लेषण का उपयोग दर्दनाक मस्तिष्क चोट inducing के लिए प्रोटोकॉल को जोड़ती है. दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के बाद आंत microbiota संरचना के परिवर्तन 16S-rDNA अनुक्रमण का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल आंत्र सूक्ष्मजीवों और दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी विधि प्रदान करता है.
Introduction
दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई) एक वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या है और युवा वयस्कों में मृत्यु और विकलांगता का प्रमुख कारण1,2. टीबीआई हर साल कई मौतों का कारण बनता है, और जीवित बचे शारीरिक, मनोरोग, भावनात्मक, और संज्ञानात्मक विकलांगता की एक किस्म का अनुभव. इसलिए, टीबीआई एक रोगी के परिवार और सामाजिक संसाधनों के लिए एक भारी बोझ है। टीबीआई दोनों प्राथमिक मस्तिष्क चोट है कि आघात के समय और किसी भी माध्यमिक मस्तिष्क की चोट है कि प्रारंभिक चोट के बाद महीनों के लिए घंटे विकसित होता है शामिल है. माध्यमिक मस्तिष्क की चोट कई जैव रासायनिक cascades द्वारा मध्यस्थता है, जो न केवल मस्तिष्क के लिए हानिकारक हैं, लेकिन यह भी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल प्रणाली सहित विभिन्न अंग प्रणालियों पर महत्वपूर्ण नकारात्मक प्रभाव पड़ता है3.
वर्तमान में, वहाँ तीन मॉडल पशु प्रयोगों में टीबीआई प्रेरित करने के लिए कर रहे हैं: तरल पदार्थ टक्कर चोट, नियंत्रण cortical प्रभाव (सीसीआई), और वजन ड्रॉप त्वरण. पार्श्व द्रव टक्कर चोट (LFPI) फैलाना मस्तिष्क चोट (डीएआई)4स्थापित करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया मॉडल है। डिवाइस बरकरार ड्यूरा करने के लिए एक संक्षिप्त तरल पदार्थ दबाव नाड़ी लागू करने से एक craniectomy के माध्यम से मस्तिष्क की चोट पैदा करता है. यह नाड़ी लोलक की हड़ताल से बनाई गई है। LFPI टीबीआई अनुसंधान के लिए एक पुन: उत्पादनीय और नियंत्रणीय मॉडलिंग विधि है।
माइक्रोबायोम को मानव शरीर में रहने वाले सभी सूक्ष्मजीवों के सामूहिक जीनोम के रूप में परिभाषित किया गया है। विशेष रूप से आंत्र सूक्ष्मजीव न केवल आंतों के घरेलू शोथ और कार्य में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं बल्कि मेजबान शरीर क्रिया विज्ञान के कई पहलुओं और अन्यअंगोंके कार्यकरण को भी विनियमित करते हैं . हाल के वर्षों में, वहाँ सबूत है कि इंगित करता है कि आंत microbiota मस्तिष्क के विकास को विनियमित और मस्तिष्क gut अक्ष6के माध्यम से कार्य में वृद्धि हुई है. आंत microbiota के विघटन पार्किंसंस रोग, मूड विकार, और आत्मकेंद्रित7सहित कई मस्तिष्क समारोह विकारों से जोड़ा गया है. हाल ही में, पूर्व नैदानिक अध्ययनों से यह भी पता चला है कि मस्तिष्क की तीव्र चोट आंत माइक्रोबायोटा8,9 में परिवर्तन पैदा कर सकतीहै.
ट्रेगेन एट अल द्वारा किए गए एक अध्ययन मेंपाया गया कि तीन माइक्रोबियल प्रजातियों में महत्वपूर्ण कमी आई है और सीसीआई प्रेरित टीबीआई के बाद दो माइक्रोबियल प्रजातियों में वृद्धि होती है। यह सबूत इंगित करता है कि आंत microbiota के मॉडुलन टीबीआई प्रबंधन में एक चिकित्सीय विधि हो सकती है. हालांकि, मस्तिष्क चोट प्रेरित आंत microbiota परिवर्तन अंतर्निहित तंत्र अज्ञात रहते हैं. इस कारण से, टीबीआई के बाद आंत microbiota में परिवर्तन का अध्ययन करने का एक अपेक्षाकृत सरल और कुशल मॉडल की आवश्यकता है. इसलिए, वर्तमान अध्ययन चूहों में टीबीआई के बाद आंत microbiota में परिवर्तन की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
प्रदर्शन की गई सभी प्रक्रियाओं को झेजियांग विश्वविद्यालय की प्रायोगिक पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सर्जरी में इस्तेमाल किए जाने वाले सभी उपकरण और सामग्री बाँझ होती हैं। TBI proceudre के बारे में 20 मिनट लगते हैं.
1. पशु देखभाल
- इस प्रयोग में 5 से 6 सप्ताह के पुरुष C57BL/6J चूहों (20-25 ग्राम वजन) का प्रयोग करें।
- एक 12 h/12 h प्रकाश / अंधेरे चक्र पर चूहों को बनाए रखें, और सुनिश्चित करें कि वे भोजन और पानी के विज्ञापन libitum प्राप्त करते हैं. अध्ययन के दौरान शर्मीले और टीबीआई दोनों समूहों को समान मात्रा में भोजन और पानी प्रदान करें।
- पशु दर्द और बेचैनी को कम करने के लिए सभी प्रयास करें।
2. दर्दनाक मस्तिष्क की चोट का प्रेरण
- एनेस्थेसिया के लिए केटामाइन (80-100 मिलीग्राम/किग्रा)/Xylazine (10 मिलीग्राम/kg) आईपी इंजेक्शन। एक आँख पलटा या दर्द पलटा का उपयोग संज्ञाहरण की गहराई का परीक्षण करें। आंखों को सुखाने से रखने के लिए कृत्रिम आँसू या स्नेहक आंख मरहम का प्रयोग करें।
- संज्ञाहरण के बाद, प्रवण स्थिति में माउस डाल दिया. सर्जरी के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर तापमान को बनाए रखने के लिए और टीबीआई के बाद 30 मिनट के लिए तापमान नियंत्रित हीटिंग पैड का उपयोग करें।
- चीरा क्षेत्र के बाल दाढ़ी.
- तीन बारी scrubs का उपयोग कर 70% इथेनॉल के साथ खोपड़ी को साफ करें, तो एक sagittal विमान में खोपड़ी incise.
- दोनों पक्षों पर चीरा वापस लेने के लिए बलकाप्रयोग करें और periosteum थोड़ा अलग.
- खोपड़ी के सही पार्श्विक क्षेत्र पर एक चक्र (3 मिमी व्यास) आकर्षित करने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें, 2 मिमी मिडलाइन से दूर।
- एक इलेक्ट्रिक ड्रिल के साथ खोपड़ी ड्रिल। सुनिश्चित करें कि यह चरण ड्यूरा क्षतिग्रस्त होने से बचाने के लिए सावधानी से संचालित किया जाता है।
- हड्डी फ्लैप निकालें और एक छोटी सी हड्डी खिड़की का पर्दाफाश (3 व्यास में मिमी).
- एक प्लास्टिक की चोट कैनुला (आंतरिक व्यास - 2.5 मिमी, लंबाई - 8 मिमी) craniotomy पर रखें और एक दंत एक्रिलिक का उपयोग कर खोपड़ी के लिए cannula सीमेंट.
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि कैनुला में कोई बुलबुले नहीं हैं, एक सिरिंज (5 एमएल) का उपयोग करके 0.9% NaCl (सामान्य नमकीन) के साथ कैनुला भरें।
- आस्टसीलस्कप और एम्पलीफायर चालू करें और सुनिश्चित करें कि पार्श्व द्रव टक्कर चोट के उच्च दबाव ट्यूब (LFPI) डिवाइस हवा के बुलबुले से मुक्त है. यह एक स्थिर संकेत देता है जब तक के बारे में 10 दालों पहुंचाने के द्वारा डिवाइस का परीक्षण करें। लगभग 2.0 एटीएम की स्पंद तीव्रता तक पहुँचने के लिए पेंडुलम प्रारंभिक स्थिति के कोण को समायोजित करें।
- चोट कैनुला को LFPI डिवाइस से कनेक्ट करें. ट्रिगर खींच और पेंडुलम को रिहा करके मस्तिष्क की चोट को प्रेरित करें। फिर, एक नाड़ी प्राप्त करने और यह पूरे बंद तरल पदार्थ से भरे ट्यूबिंग प्रणाली के माध्यम से ड्यूरा को संचारित.
- एक ही शल्य प्रक्रिया के साथ शर्म समूह में चूहों संचालित. LFPI निष्पादित न करें।
3. पोस्ट-सर्जरी उपचार
- मस्तिष्क की चोट को प्रेरित करने के बाद, प्लास्टिक कैनुला को हटा दें और चीरा सीवन करें। सर्जरी के दौरान buprenorphine (2mg/kg) SQ या आईपी और उसके बाद तीन दिनों के लिए हर 6-12 एच प्रशासन.
- माउस को एक हीटिंग पैड पर तब तक रखें जब तक कि वह ऐम्बुलेटरी न हो। संवेदनाहारी पुनर्जीवन में तेजी लाने के लिए हीटिंग पैड के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
- माउस को पिंजरे में वापस रखो और भोजन और पानी के विज्ञापन libitumप्रशासन .
4. सीकम से लैपरोटोमी और नमूना संग्रह
- इसी समय अंक पर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ2 द्वारा चूहों को यूथेनाइज करें।
नोट: इस प्रयोग में, चुना समय अंक थे 1 एच, 6 एच, 1 डी, 3 डी, और 7 डी पोस्ट-ट्रैमेटिक मस्तिष्क चोट आंत microbiota के गतिशील विकास का विश्लेषण करने के लिए. - पेट की सतह से बालों को निकालें। 70% इथेनॉल के साथ पेट को संक्रमित करें।
- माउस के ऊपर एक बाँझ कपड़ा रखें। पुरुष चूहों में prepuce के ठीक ऊपर, निचले पेट midline से एक चीरा बनाओ.
- आंतों को उजागर करने के बाद, सीकम का पता लगाएं और धीरे से इसे अन्य आंतों के ट्रैक्ट से अलग कर दिया। दांतेदार या तेज बलके साथ सीकम को पकड़ने से बचें। serrations के साथ Adson forceps जैसे atraumatic forceps, का उपयोग करें.
- तेज कैंची से सीकम काटें।
- बाँझ ड्रेसिंग पर मैन्युअल रूप से सीकम सामग्री निकालें और सामग्री को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में संग्रहीत करें।
- माइक्रोबायोम विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सीकम सामग्री को संग्रहीत करें।
5. डीएनए निष्कर्षण और 16S-rDNA अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण
-
मल से डीएनए का अलगाव
नोट: इस प्रयोग के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए आइसोलेशन किट (सामग्री तालिका) का उपयोग किया गया था।- एक 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में मल के 300 मिलीग्राम परिमार्जन और बर्फ पर ट्यूब जगह करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें।
- प्रत्येक नमूने के लिए बफर को बाधित करने के 1 एमएल जोड़ें। भंवर लगातार 1 मिनट के लिए या जब तक मल का नमूना पूरी तरह से homogenized है.
- मल कणों को गोली करने के लिए 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर नमूना सेंट्रीफ्यूज।
- पिपेट 2 जेडएल प्रोटीनेज के एक नए 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में। सुपरनेटेंट के 600 डिग्री सेल्सियस चरण 5.1.3 से प्रोटीनसेस के 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में। फिर, बफर 1 के 600 $L और 15 s के लिए भंवर जोड़ें.
- 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर नमूना इनक्यूबेट करें।
- lysate (1:1 अनुपात) के लिए 100% इथेनॉल के 600 $L जोड़ें और भंवर द्वारा मिश्रण. ट्यूब ढक्कन के अंदर से बूंदों को हटाने के लिए अधिकतम गति पर सेंट्रीफ्यूज।
- स्पिन कॉलम में lysate के 600 $L लागू करें। 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर सेंट्रीफ्यूज. प्रवाह के माध्यम से छोड़ें। इस चरण को एक बार और दोहराएँ. उसके बाद, एक नया 2 एमएल संग्रह ट्यूब में स्तंभ स्थानांतरित करें।
- स्पिन स्तंभ खोलें और बफ़र 2 का 500 $L जोड़ें. 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर सेंट्रीफ्यूज. कॉलम निकालें और इसे एक नया 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखें।
- स्तंभ में बफ़र 3 का 500 $L जोड़ें. 3 मिनट के लिए अधिकतम गति से सेंट्रीफ्यूज को छोड़ दें। प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें। बफर 3 पूरी तरह से eluted है यह सुनिश्चित करने के लिए एक बार centrifugation प्रक्रिया को दोहराएँ.
- स्पिन कॉलम को एक नई ट्यूब 2 एमएल संग्रह ट्यूब और पिपेट 200 डिग्री एल बफर 4 में सीधे झिल्ली पर रखें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट, फिर डीएनए को शांत करने के लिए 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर अपकेंद्रित्र।
-
16S-rDNA अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण
- amplicons उत्पन्न करने के लिए डीएनए के 20-30 एनजी का प्रयोग करें.
- बैक्टीरिया 16S rDNA के V3 और V4 अतिचर क्षेत्रों की सीमा पर अपेक्षाकृत संरक्षित क्षेत्रों के लिए डिजाइन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्राइमर का उपयोग करें। अनुक्रम युक्त आगे प्राइमर "CCTACGGGERBGCASCAGKVSERVGAAT" और अनुक्रम युक्त रिवर्स प्राइमर "GGACTACNVGGGTGTTATC" वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया गया.
- बफर 1 के 2.5 डिग्री सेल्सियस, डीएनटीपी के 2 डिग्री एल, प्रत्येक प्राइमर के 1 डिग्री एल, डीएनए पॉलिमरेज के 0.5 डिग्री एल, और एक ट्यूब में टेम्पलेट डीएनए के 20 एनजी जोड़कर पीसीआर प्रतिक्रियाओं के मिश्रण को बनाएं। प्रतिक्रिया प्रणाली को 25 डिग्री सेल्सियस में समायोजित करने के लिए डी डी एच2व् का उपयोग करें।
- PCR प्रतिक्रिया पैरामीटर को निम्नानुसार सेट करें: एक बार 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-विकृतीकरण करें। 5 s के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण करें, 90 s के लिए 57 डिग्री सेल्सियस पर anneal, 10 s के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार, और इस 24x दोहराएँ।
- निर्माता के निर्देश के अनुसार PE250/300 युग्मित-अंत अनुक्रमण निष्पादित करें और 16S rRNA डेटा विश्लेषण के लिए QIIME डेटा विश्लेषण पैकेज का उपयोग करें।
नोट: इस प्रयोग में, डीएनए अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण मुख्य रूप से एक पेशेवर अनुक्रमण कंपनी द्वारा किया गया.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TBI की स्थापना चित्र 1में दिखाया गया है। संज्ञाहरण और कीटाणुशोधन के बाद, खोपड़ी को धनुर्वेदित ाहा (चित्र 1क) में शामिल किया गया था। एक craniotomy (3 मिमी व्यास में) एक बिजली ड्रिल के साथ सही पार्श्व प्रांतस्था पर खोपड़ी में trephined किया गया था, ड्यूरा बरकरार रखा गया था (चित्र 1 बी,सी)। एक प्लास्टिक की चोट कैनुला हड्डी की खिड़की के ऊपर रखा गया था और दंत एक्रिलिक का उपयोग करके खोपड़ी को सीमेंटेड किया गया था (चित्र 1डी) ।
पार्श्व द्रव आघात की प्रक्रिया चित्र 2 में दर्शायागया है। डिवाइस शुरू करने से पहले के बारे में 10 दालों पहुंचाने के द्वारा परीक्षण किया गया था जब तक यह एक स्थिर संकेत देता है. लोलक के कोण को लगभग 2ण्0 अदम की स्पंद तीव्रता तक पहुँचने के लिए प्रारंभिक स्थिति में समायोजित किया गया था (चित्र 2क) । कैनुला बाँझ सामान्य लवण से भरा हुआ था। तब कैनुला को एलएफपीआई उपकरण से जोड़ा गया था (चित्र 2ख) । मस्तिष्क की चोट बंद कपाल गुहा में एक आवेग पैदा करके प्रेरित किया गया था (चित्र 2ब्) .
लैपरोटोमी और सीकम मल नमूना संग्रह चित्र 3में दिखाया गया है। लैपरोटॉमी निचले पेट पर और मिडलाइन के साथ की गई थी (चित्र 3क) सीकम की पहचान की गई और धीरे से अलग किया गया (चित्र 3 ठ,ब्) . सीकम आमतौर पर पेट के निचले दाएँ भाग में स्थित होता है। इसके बाद इसे तेज कैंची से इंका या दिया गया (चित्र 3डी) . सीकम की विषय-वस्तु (चित्र 3ई) निकाली गई और 1ण्5 एमएल ट्यूबों में संग्रहित की गई (चित्र 3 एफ) मल के नमूनों को आगे के उपयोग से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत संग्रहीत किया गया था।
16S-rDNA अनुक्रमण ने टीबीआई के 3 दिन बाद चूहों में सीकम माइक्रोबायोटा की कम विविधता का प्रदर्शन किया, शम और टीबीआई समूहों की सीकम सामग्री में सबसे प्रचुर मात्रा में टैक्सा चित्र 4में दिखाया गया था। 16S अनुक्रमण विश्लेषण में TBI और शम समूहों के बीच microbiota अंतर का मूल्यांकन करने के लिए Wilcoxon रैंक योग परीक्षण किया गया था, और p मान 0.05 से कम था। गैर-मीट्रिक बहु-आयामी स्केलिंग (एनएमडीएस) में भी टीबीआई के बाद केकम माइक्रोबायोटा की परिवर्तित संरचना दिखाई दी (चित्र 5)।
चित्र 1 : टीबीआई की स्थापना. (ए) संज्ञाहरण और कीटाणुशोधन के बाद, खोपड़ी को उत्तेजित किया गया था। (बी) दाहिने पार्श्विक प्रांतस्था के ऊपर खोपड़ी पर एक सिरसीनेट क्रैनिओटोमी संचालित करता है। (सी) ड्यूरा को अक्षुण्ण रखें। (घ)प्लास्टिक की चोट को दंत ऐक्रिलिक का उपयोग करके खोपड़ी में सीमेंट करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : पार्श्व द्रव टक्कर की प्रक्रिया. (क)लोलक प्रारंभिक स्थिति कोण का समायोजन। (बी) बाँझ सामान्य नमकीन के साथ कैनुला को भरना, फिर LFPI डिवाइस के लिए कैनुला का कनेक्शन। (ग)पेंडुलम की रिहाई और बंद कपाल गुहा में एक आवेग के निर्माण से मस्तिष्क की चोट प्रेरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : Laparotomy और caecum मल नमूना संग्रह. (ए) निचले पेट से और मिडलाइन के साथ लैपरोटॉमी की शुरुआत। (बी, सी) सीकम और बाद में (मजबूत) हटाने की पहचान। (डी)तेज कैंची के साथ सीकम का काटना। (ई) सीकम की सामग्री का निष्कर्षण। (च)1.5 एमएल एपेनडॉर्फ ट्यूबों में सीकम सामग्री के नमूनों का भंडारण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : कैकम माइक्रोबायोटा विविधता की तुलना। शर्मीले और टीबीआई समूहों के सीकम सामग्री में सबसे प्रचुर मात्रा में टैक्सा ने टीबीआई के 3 दिनों के बाद चूहों में सीकम माइक्रोबायोटा की विविधता को कम किया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5 : NMDS विश्लेषण. गैर-मीट्रिक बहु-आयामी स्केलिंग (एनएमडीएस) ने टीबीआई के बाद कैकम माइक्रोबायोटा की परिवर्तित संरचना को दिखाया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ प्रस्तुत एक सरल और कुशल प्रोटोकॉल चूहों में TBI के बाद cecal microbiota में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए है. मस्तिष्क की चोट और सीकम सामग्री के नमूनों का संग्रह शामिल प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण भाग हैं।
शोधकर्ताओं ने टीबीआई के बाद आंत microbiota के परिवर्तन का अध्ययन करने के बावजूद, इनअध्ययनों में इस्तेमाल मस्तिष्क की चोट सीसीआई-8 और वजन में गिरावट / हालांकि, सीसीआई मॉडल ज्यादातर मस्तिष्क contusion प्रतिकृति, और वजन ड्रॉप मॉडल कुछ inaccuracies से पीड़ित हो सकता है. सभी मौजूदा मस्तिष्क चोट मॉडल के अलावा, LFPI सबसे अधिक इस्तेमाल किया मॉडल है, जो फोकल और फैलाना मस्तिष्क चोट11,12 शामिल है और कई महत्वपूर्ण विशेषताओं नैदानिक TBI रोगियों में मनाया प्रतिकृति. इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम ड्यूरा की सुरक्षा और cannula airtight रखने में शामिल हैं. हालांकि, दोनों craniotomy और conglutination एक कुशल कलाकार के संचालन की आवश्यकता है, जो इस प्रोटोकॉल की एक सीमा हो सकती है. हालांकि, LFPI अभी भी एक सरल, स्थिर, और सटीक तरीका है. इसलिए, चूहों में TBI इस अध्ययन में LFPI का उपयोग कर प्रेरित किया गया था, जो प्रोटोकॉल अधिक प्रतिनिधि और मस्तिष्क चोट अनुसंधान में मूल्यवान बनाता है.
आंत microbiota विश्लेषण के लिए, मल के नमूने अपनी गैर-आक्रामकता और सुविधा के लिए इस्तेमाल किया गया. फिर भी, मल नमूने की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, एक निश्चित समय बिंदु पर प्रत्येक माउस में एकत्र मल की मात्रा छोटी है, और मल की मात्रा 16S-rDNA विश्लेषण करने के लिए अपर्याप्त हो सकती है। दूसरा, पोस्ट-ट्रैमेटिक गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल डिसफंक्शन के कारण, मस्तिष्क की चोट के बाद तीव्र चरण के दौरान मल के नमूने एकत्र करना मुश्किल होता है (1 एच इस अध्ययन में चोट के बाद)। इसके अतिरिक्त, साक्ष्यों से पता चला है कि मल माइक्रोबायोटा संरचना अन्य आंतों के खंडों13में माइक्रोबायोटा से भिन्न है। इसलिए, इस अध्ययन में आंत microbiota विश्लेषण के लिए सीकम सामग्री एकत्र किए गए थे। Caecum सामग्री नमूने की आवश्यकता है कि चूहों का बलिदान कर रहे हैं, और इस विधि हिस्टोलॉजिकल और प्रतिरक्षा परीक्षाओं के लिए आंत्र पथ के नमूने के लिए अनुमति देता है, जो मस्तिष्क चोट प्रेरित आंत रोग के अध्ययन में महत्वपूर्ण अनुसंधान पहलुओं रहे हैं. इसके अतिरिक्त, इस विधि का उपयोग जेजुनम, इलेयम, और बृहदान्त्र सहित अन्य जठरांत्र संबंधी मार्ग में माइक्रोबायोटा परिवर्तनों की जांच करने के लिए किया जा सकता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल आंत microbiota में टीबीआई प्रेरित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श तरीका है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक ईमानदारी से उसे तकनीकी मार्गदर्शन के लिए Baohong वांग धन्यवाद.
Acknowledgments
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA isolation kit | QIAGEN | 51604 | For fast purification of genomic DNA from stool samples |
| Gene analysis service | GENEWIZ | Gene analyse service | |
| Heating pad | Shanghai SAFE Biotech Co. | TR-200 | heating pad |
| Injector | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | injector | |
| LFPI device | Virginia Commonwealth University |
FP302 | LFPI device |
| Micro cranial drill | RWD Life Science | 78061 | Micro cranial drill |
| Povidone Iodine | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | Povidone Iodine |
References
- Cheng, P., et al. Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study. 14, e1002332 (2017).
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S.
- Kabadi, S. V., et al. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease. Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).
- Collins, S. M., Surette, M., Bercik, P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nature Reviews Microbiology. 10, 735-742 (2012).
- Cryan, J. F., Dinan, T. G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).
- Nicholson, S. E., et al. Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent. Shock. , (2018).
- Houlden, A., et al. Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production. Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).
- Treangen, T. J., et al. Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome. Frontiers in Immunology. 9, 2757 (2018).
- Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
- Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way. Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).
