Summary
Presentert her er en protokoll for å indusere diffuse traumatisk hjerneskade ved hjelp av en lateral væske perkusjon enhet etterfulgt av innsamling av blindtarmen innhold for gut mikrobiomet analyse.
Abstract
Økende bevis viser at bakterieflora-hjerne-aksen spiller en viktig rolle i patogenesen av hjernesykdommer. Flere studier viser også at traumatiske hjerne skader forårsake endringer i tarmen bakterieflora. Imidlertid forblir mekanismer underliggende toveis regulering av hjernen-gut aksen ukjent. Foreløpig finnes det få modeller for å studere endringene i tarmen bakterieflora etter traumatisk hjerneskade. Derfor, den presenterte studien kombinerer protokoller for inducing traumatisk hjerneskade ved hjelp av en lateral væske perkusjon enhet og analyse av blindtarmen prøver etter skade for å undersøke endringer i tarmen mikrobiomet. Endringer i tarmen bakterieflora sammensetning etter traumatisk hjerneskade bestemmes ved hjelp av 16S-rDNA sekvensering. Denne protokollen gir en effektiv metode for å studere forholdet mellom enteric mikroorganismer og traumatisk hjerneskade.
Introduction
Traumatisk Brain skade (TBI) er et globalt folkehelseproblem og den ledende dødsårsaken og uførhet hos unge voksne1,2. TBI forårsaker mange dødsfall hvert år, og overlevende opplever en rekke fysiske, psykiske, emosjonelle, og kognitive funksjonshemminger. Derfor er TBI en tung byrde for pasientens familie og samfunnsressurser. TBI innebærer både den primære hjerneskade som oppstår på tidspunktet for traumer og eventuelle sekundære hjerne skader som utvikler timer til måneder etter første skade. Sekundær hjerneskade er formidlet av flere biokjemiske kaskader, som ikke bare er skadelig for hjernen, men også har betydelige negative effekter på ulike organsystemer, inkludert Gastrointestinal system3.
For tiden er det tre modeller for å indusere TBI i dyr eksperimenter: væske perkusjon skade, kontroll kortikale innvirkning (CCI), og vekt drop akselerasjon. Lateral Fluid perkusjon skade (LFPI) er den mest brukte modellen for å etablere diffuse hjerneskade (DAI)4. Enheten produserer hjerneskade gjennom en craniectomy ved å bruke en kort væsketrykk puls til intakt Dura. Denne pulsen er laget av streiken av pendelen. LFPI er en reproduserbar og kontrollerbar modelleringsmetode for TBI forskning.
Mikrobiomet er definert som den kollektive genomer av alle mikroorganismer som bor i menneskekroppen. Intestinal mikrober spesielt ikke bare spille en viktig rolle i intestinal homeostase og funksjon, men også regulere mange aspekter av verts fysiologi og funksjon av andre organer5. I de senere årene, er det økende bevis som indikerer at gut bakterieflora regulere hjernens utvikling og funksjon via hjerne-gut akser6. Forstyrrelse av tarmen bakterieflora har vært knyttet til flere hjernens funksjon lidelser inkludert Parkinsons sykdom, affektive lidelser, og autisme7. Nylig har prekliniske studier også rapportert at akutt hjerneskade kan indusere endringer i gut bakterieflora8,9.
En studie av Treangen et al.10 funnet betydelig nedgang i tre mikrobielle arter og økninger i to mikrobielle arter etter CCI-indusert TBI. Dette tyder på at modulering av gut bakterieflora kan være en terapeutisk metode i TBI ledelse. Men mekanismene underliggende hjerneskade-indusert gut bakterieflora endringer forblir ukjent. Av denne grunn, en relativt enkel og effektiv modell for å studere endringene i gut bakterieflora etter TBI er nødvendig. Derfor presenterer denne studien en protokoll for å undersøke endringer i gut bakterieflora etter TBI i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer utført ble godkjent av Experimental Animal etikk Committee of Zhejiang University. Alle instrumenter og materialer som brukes i kirurgi er sterile. TBI-proceudre tar omtrent 20 minutter.
1. Animal omsorg
- Bruk 5 til 6 uker gamle mannlige C57BL/6J mus (20-25 g vekt) i dette eksperimentet.
- Opprettholde mus på en 12 h/12 h lys/mørk syklus, og sørge for at de får mat og vann ad lib. Gi samme mengder mat og vann til både humbug og TBI grupper gjennom studien.
- Gjør alle anstrengelser for å minimere dyret smerte og ubehag.
2. induksjon av traumatisk hjerneskade
- Injiser ketamin (80-100 mg/kg)/Xylazine (10 mg/kg) IP for anestesi. Test dybden av anestesi ved hjelp av et øyerefleks eller smerte refleks. Bruk kunstige tårer eller smøre øye salve for å holde øynene fra tørking.
- Etter anestesi, sette musen i liggende posisjon. Bruk en temperatur kontrollert oppvarmings pute for å opprettholde temperaturen ved 37 ° c under operasjonen og i 30 minutter etter TBI.
- Barbere håret av snittområdet.
- Desinfisere hodebunnen med 70% etanol ved hjelp av tre vekslende scrubs, deretter incise hodebunnen i et sagittal plan.
- Bruk tang til å trekke snittet på begge sider og skille periosteum litt.
- Bruk en markør til å tegne en sirkel (3 mm diameter) på høyre parietal område av skallen, 2 mm unna midtlinjen.
- Drill skallen med en elektrisk drill. Kontroller at dette trinnet er operert nøye for å beskytte Dura fra å bli skadet.
- Fjern bein klaffen og utsett et lite bein vindu (3 mm i diameter).
- Plasser en plastisk skade kanyle (innvendig diameter = 2,5 mm, lengde = 8 mm) over kraniotomi og sement kanyle til skallen ved hjelp av en dental akryl.
- Fyll kanyle med steril 0,9% NaCl (normal saltvann) ved hjelp av en sprøyte (5 mL) for å sikre at det ikke er noen bobler i kanyle.
- Slå på oscilloskop og forsterker og sikre at høytrykks rør av lateral væske perkusjon skade (LFPI) enheten er fri for luftbobler. Test enheten ved å levere omtrent 10 pulser til den gir et stødig signal. Juster vinkelen på pendelen startposisjon for å nå en puls intensitet på ca 2,0 ATM.
- Koble skade kanyle til LFPI-enheten. Indusere hjerneskade ved å trekke i avtrekkeren og slippe pendelen. Deretter får en puls og overføre den til Dura gjennom hele lukket væske-fylte Slangesystem.
- Operere musene i humbug gruppen med samme kirurgiske prosedyren. Ikke Utfør LFPI.
3. post-kirurgi behandling
- Etter inducing hjernen skade, fjerne plast kanyle og Sutur snittet. Under operasjonen administrere buprenorfin (2mg/kg) SQ eller IP og deretter hver 6-12 h i tre dager.
- Legg musen på en varmepute til den er oppegående. Sett temperaturen på varmeputen til 37 ° c for å akselerere bedøvelse gjenoppliving.
- Putte musa rygg inne byrået og administrere næringen og vann annonse lib.
4. Laparotomy og sample samling fra blindtarmen
- Euthanize musene ved CO2 etterfulgt av cervical forvridning på tilsvarende tidspunkt poeng.
Merk: i dette eksperimentet var de valgte tids punktene 1 t, 6 t, 1 d, 3 d, og 7 d post-traumatisk hjerneskade for å analysere den dynamiske utviklingen av gut bakterieflora. - Fjern håret fra overflaten av magen. Desinfisere magen med 70% etanol.
- Plasser en steril gardin over musen. Lag et snitt fra nedre abdomen midtlinjen, like over prepuce i mannlige mus.
- Etter det tarmen er avdekket, finne det cecum og mildt adskilt den fra annet intestinal traktater. Unngå å gripe cecum med tenner eller skarp tang. Bruk atraumatiske tang, for eksempel Adson tang med serrations.
- Skjær blindtarmen med skarp saks.
- Pakk ut blindtarmen innhold manuelt på steril dressing og oppbevar innholdet i 1,5 mL mikrosentrifugen rør.
- Oppbevar det blindtarmen innholdet ved-80 ° c inntil mikrobiomet analyse.
5. DNA utvinning og 16S-rDNA sekvensering og dataanalyse
-
Isolering av DNA fra avføring
Merk: et kommersielt tilgjengelig DNA-isolasjons sett (tabell med materialer) ble brukt for dette eksperimentet.- Bruk en skalpell å skrape 300 mg avføring i en 2 mL mikrosentrifugen tube og plassere røret på isen.
- Tilsett 1 mL hemme buffer til hver prøve. Vortex kontinuerlig i 1 min eller til feces prøven er grundig homogenisert.
- Sentrifuger prøven ved maksimal hastighet for 1 min til pellets avføring partikler.
- Pipetter 2 μL av proteinase K i et nytt 2 mL mikrosentrifugen rør. Pipet 600 μL av supernatanten fra trinn 5.1.3 inn i 2 mL mikrosentrifugen rør som inneholder proteinase K. Deretter legger du til 600 μL av buffer 1 og Vortex for 15 s.
- Ruge prøven ved 70 ° c i 10 min.
- Tilsett 600 μL av 100% etanol til lysat (1:1 ratio) og bland med virvlingen. Sentrifuger ved den maksimale hastigheten kort for å fjerne dråper fra innsiden av røret lokket.
- Påfør 600 μL av lysat i Spin-kolonnen. Sentrifuger ved maksimal hastighet i 1 min. kast flyten gjennom. Gjenta dette trinnet én gang til. Deretter overfører du kolonnen til et nytt 2 mL oppsamlings rør.
- Åpne spin-kolonnen og Legg til 500 μL av buffer 2. Sentrifuger ved maksimal hastighet i 1 min. Fjern kolonnen og plasser den i et nytt 2 mL oppsamlings rør.
- Tilsett 500 μL av buffer 3 i kolonnen. Sentrifuger ved maksimal hastighet i 3 min. kast flyten gjennom. Gjenta sentrifugering prosessen en gang for å sikre at buffer 3 er helt eluert.
- Sett spin-kolonnen inn i et nytt rør 2 mL oppsamlings rør og Pipetter 200 μL av buffer 4 direkte på membranen. Ruge for 1 min ved romtemperatur (RT), deretter sentrifuger ved maksimal hastighet for 1 min til eluere DNA.
-
16S-rDNA sekvensering og dataanalyse
- Bruk 20-30 ng av DNA for å generere amplicons.
- Bruk kommersielt tilgjengelige primere designet for de relativt bevarte regionene som grenser til v3 og v4 hypervariable regioner av bakterier 16S rDNA. Den fremover primere inneholder sekvensen "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT" og omvendt primere som inneholder sekvensen "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC" ble brukt i den foreliggende studien.
- Gjør PCR-reaksjonene blanding ved å tilsette 2,5 μL av buffer 1, 2 μL av dNTPs, 1 μL av hver primer, 0,5 μL av DNA-polymerase, og 20 ng av mal-DNA i et rør. Bruk ddH2O for å justere reaksjonssystemet til 25 μL.
- Sett PCR reaksjons parametre som følger: Utfør pre-denaturering ved 94 ° c i 3 minutter en gang. Utfør denaturering ved 94 ° c i 5 s, anneal ved 57 ° c for 90 s, Forleng ved 72 ° c i 10 s, og gjenta dette 24X.
- Utfør PE250/300 par-end-sekvensering i henhold til produsentens instruksjon og bruk QIIME dataanalyse pakke for 16S rRNA dataanalyse.
Merk: i dette eksperimentet, DNA-sekvensering og dataanalyse ble først og fremst gjort av en profesjonell sekvensering selskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering av TBI er vist i figur 1. Etter anestesi og desinfeksjon, hodebunnen var radert sagittally (figur 1a). En kraniotomi (3 mm i diameter) ble trephined inn i skallen over høyre parietal cortex med en elektrisk drill, Dura ble holdt intakt (figur 1B, C). En plastisk skade kanyle ble plassert over bein vinduet og befestet til skallen ved hjelp av Dental akryl (figur 1d).
Prosedyren for lateral væske perkusjon er vist i figur 2. Før du starter enheten ble testet ved å levere ca 10 pulser til den gir et stødig signal. Vinkelen på pendelen ble justert til utgangsposisjonen for å nå en puls intensitet på ca 2,0 ATM (figur 2a). Kanyle var fylt med den sterile normale saltvann. Da kanyle var koblet til LFPI enheten (figur 2b). Hjerneskade ble indusert ved å skape en impuls inn i lukket skallen hulrom (figur 2C).
Laparotomy og blindtarmen avføringsprøve samling er vist i Figur 3. Laparotomy ble utført på nedre del av magen og langs midtlinjen (figur 3a). Blindtarmen ble identifisert og forsiktig separert (figur 3b, C). Blindtarmen er vanligvis plassert i nedre høyre del av magen. Det ble deretter radert med skarp saks (figur 3D). Innholdet i blindtarmen (figur 3e) ble ekstrahert og lagret i 1,5 ml rør (fig. 3F). Avførings prøvene ble umiddelbart oppbevart ved-80 ° c før videre bruk.
16S-rDNA sekvensering demonstrerte redusert mangfold av blindtarmen bakterieflora i mus 3 dager etter TBI, den mest tallrike dyr i blindtarmen innholdet i humbug og TBI grupper ble vist i Figur 4. Den Wilcoxon rang sum test ble utført for å evaluere bakterieflora forskjeller mellom TBI og humbug grupper i 16S sekvensering analyse, og p -verdien var mindre enn 0,05. Den ikke-metriske multi-dimensjonale skalering (tidlig) viste også endret sammensetning av blindtarmen bakterieflora etter TBI (figur 5).
Figur 1 : Etablering av TBI. (A) etter anestesi og desinfeksjon, hodebunnen var radert. (B) Operer en circinate kraniotomi på skallen over høyre parietal cortex. (C) holde Dura intakt. (D) sement plast skaden kanyle til skallen ved hjelp av Dental akryl. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Prosedyren for lateral væske perkusjon. (A) justering av pendelen Start posisjons vinkelen. (B) fylling av kanyle med sterilt, normalt saltvann, deretter tilkobling av KANYLE til LFPI-enheten. (C) hjerneskade induksjon ved utgivelsen av pendelen og etablering av en impuls i lukket skallen hulrom. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Laparotomy og blindtarmen avføringsprøve samling. (A) begynnelsen av laparotomy fra nedre del av magen og langs midtlinjen. (B, C) Identifisering av blindtarmen og påfølgende (skånsom) fjerning. (D) kutting av blindtarmen med skarp saks. (E) ekstraksjon av innholdet i blindtarmen. (F) lagring av blindtarmen innholds prøver i 1,5 ml Eppendorf rør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Sammenligningen av blindtarmen bakterieflora mangfold. De fleste rike dyr i blindtarmen innhold av humbug og TBI grupper demonstrerte redusert mangfold av blindtarmen bakterieflora i mus 3 dager etter TBI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Tidlig-analysen. Ikke-metriske multi-dimensjonale skalering (tidlig) viste endret sammensetning av blindtarmen bakterieflora etter TBI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Presentert her er en enkel og effektiv protokoll for å bestemme endringer i cecal bakterieflora etter TBI i mus. Induksjon av hjerneskade og innsamling av blindtarmen innholds prøver er kritiske deler av protokollen.
Til tross for forskerne har studert endringer av gut bakterieflora følgende TBI, hjerneskade brukt i disse studiene var CCI-8 og vekt drop/effekt-indusert modeller9. Men den CCI modellen meste replikerer hjernen kontusjon, og vekten slipp modellen kan lide av noen unøyaktigheter. Blant alle eksisterende hjerneskade modeller, er LFPI den mest brukte modellen, som inkluderer fokal og diffus hjerneskade11,12 og replikerer mange viktige funksjoner observert hos kliniske TBI pasienter. Viktige trinn gjennom hele prosessen inkluderer beskyttelse av Dura og holde kanyle lufttett. Men både kraniotomi og conglutination krever drift av en dyktig utøver, som kan være en begrensning av denne protokollen. Imidlertid, LFPI er fremdeles en enkel, stabile, og akkurat metoden. Derfor TBI i mus ble indusert ved hjelp LFPI i denne studien, som gjør protokollen mer representative og verdifulle i hjerneskade forskning.
For gut bakterieflora analyse, avføringsprøver ble brukt for sin ikke-invasiveness og bekvemmelighet. Likevel er det noen begrensninger av avføring prøvetaking. For det første, beløpet av feces samlet inne hver musen med ett bestemt tid punkt er liten, og beløpet av feces kanskje være mangelfull å utføre 16S-rDNA analyse. Sekund, på grunn av post-traumatisk Gastrointestinal dysfunksjon, avføring er vanskelig å samle i den akutte fasen etter hjerneskade (1 h post-skade i denne studien). I tillegg har bevis vist at avføring bakterieflora sammensetning er forskjellig fra bakterieflora i andre intestinal segmenter13. Derfor blindtarmen innholdet ble samlet inn for gut bakterieflora analyse i denne studien. Blindtarmen innhold prøvetaking krever at mus er ofret, og denne metoden gjør det mulig for prøvetaking av tarmkanalen for histologiske og immunologiske undersøkelser, som er viktige forsknings aspekter i studier av hjerneskade-indusert gut dysfunksjon. Denne metoden kan også brukes til å undersøke bakterieflora endringer i andre gastrointestinale traktater, inkludert jejunum, ileum og kolon. Avslutningsvis er denne protokollen en ideell metode for å studere TBI-indusert endringer i gut bakterieflora.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppriktig takker Baohong Wang for sin tekniske veiledning.
Acknowledgments
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA isolation kit | QIAGEN | 51604 | For fast purification of genomic DNA from stool samples |
| Gene analysis service | GENEWIZ | Gene analyse service | |
| Heating pad | Shanghai SAFE Biotech Co. | TR-200 | heating pad |
| Injector | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | injector | |
| LFPI device | Virginia Commonwealth University |
FP302 | LFPI device |
| Micro cranial drill | RWD Life Science | 78061 | Micro cranial drill |
| Povidone Iodine | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | Povidone Iodine |
References
- Cheng, P., et al. Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study. 14, e1002332 (2017).
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S.
- Kabadi, S. V., et al. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease. Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).
- Collins, S. M., Surette, M., Bercik, P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nature Reviews Microbiology. 10, 735-742 (2012).
- Cryan, J. F., Dinan, T. G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).
- Nicholson, S. E., et al. Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent. Shock. , (2018).
- Houlden, A., et al. Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production. Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).
- Treangen, T. J., et al. Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome. Frontiers in Immunology. 9, 2757 (2018).
- Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
- Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way. Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).
