Summary
لا تتطور نماذج ورم خبيث في العظام إلى ورم خبيث بشكل موحد أو بنسبة 100٪. يمكن أن يؤدي الحقن المباشر داخل الخلايا السرطانية العظمية إلى انصمام الرئة. نقدم تقنيتنا لنمذجة أورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام باستخدام زرع طعم الورم الصلب في العظام ، مما يؤدي إلى النقش والنمو القابل للتكرار.
Abstract
تؤدي أورام العظام الأولية أو النقائل العظمية الناتجة عن الأورام الصلبة إلى آفات مؤلمة في حالة العظم أو عظمية الأرومات أو مختلطة من العظم / العظم. هذه الآفات تضر بنية العظام ، وتزيد من خطر الكسر المرضي ، وتترك للمرضى خيارات علاج محدودة. تنتقل أورام العظام الأولية إلى أعضاء بعيدة، مع بعض الأنواع القادرة على الانتشار إلى مواقع الهيكل العظمي الأخرى. ومع ذلك ، تشير الأدلة الحديثة إلى أنه مع وجود العديد من الأورام الصلبة ، قد تكون الخلايا السرطانية التي انتشرت إلى العظام هي المصدر الرئيسي للخلايا التي تنتقل في النهاية إلى أنظمة الأعضاء الأخرى. تتضمن معظم نماذج الفئران الجينية أو xenograft لأورام العظام الأولية الحقن داخل العظم (تقويم العظام) لمعلقات الخلايا السرطانية. تعتمد بعض النماذج الحيوانية للورم الخبيث الهيكلي من الأورام الصلبة أيضا على الحقن المباشر للعظام ، بينما يحاول البعض الآخر تلخيص خطوات إضافية من سلسلة النقيلي العظمي عن طريق حقن الخلايا داخل الأوعية الدموية أو في عضو الورم الرئيسي. ومع ذلك ، لا يصاب أي من هذه النماذج بورم خبيث في العظام بشكل موثوق أو بنسبة 100٪. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن الحقن المباشر داخل العظم للخلايا السرطانية يرتبط بانصمام الورم المحتمل في الرئة. هذه الخلايا السرطانية الصمية تنقش ولكنها لا تلخص الشلال النقيلي. أبلغنا عن نموذج فأر للساركوما العظمية حيث يتم زرع شظايا الورم الطازجة أو المحفوظة بالتبريد (تتكون من الخلايا السرطانية بالإضافة إلى السدى) مباشرة في الساق القريبة باستخدام تقنية جراحية طفيفة التوغل. طورت هذه الحيوانات نقشا قابلا للتكرار ، ونموا ، وبمرور الوقت ، انحلال العظام وورم خبيث في الرئة. تتمتع هذه التقنية بتعدد الاستخدامات لاستخدامها في نمذجة ورم خبيث في عظم الورم الصلب ويمكنها بسهولة استخدام الطعوم التي تتكون من نوع واحد أو عدة أنواع من الخلايا ، والخلايا المعدلة وراثيا ، والطعوم الخارجية المشتقة من المريض ، و / أو الخلايا المصنفة التي يمكن تتبعها عن طريق التصوير البصري أو المتقدم. هنا ، نوضح هذه التقنية ، ونمذجة أورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام باستخدام زرع طعم الورم الصلب في العظام.
Introduction
أصبحت نماذج الفئران للأمراض البشرية والحيوانية شائعة بشكل متزايد في البحوث الطبية الحيوية. فائدة استخدام الفئران في هذا السياق هي أن تشريحها وعلم وظائف الأعضاء متشابهان جدا مع البشر. لديهم فترة حمل قصيرة نسبيا ووقت في حياة ما بعد الولادة لتحقيق النضج ، ويرتبطون إلى حد كبير بتكلفة منخفضة نسبيا وسهولة السكن ، وإن كانت تكاليف التطوير أو الشراء المتزايدة مرتبطة بدرجات أكبر من التعديل الوراثي و / أو نقص المناعة و / أو إضفاء الطابع الإنساني1. يؤدي استخدام السلالات الفطرية إلى وجود مجموعة موحدة إلى حد كبير قبل إدراج الدراسة. تشير المعرفة الكاملة للجينوم الخاص بهم إلى درجة عالية من التشابه مع البشر. تم تحديد الأهداف الجزيئية المتعامدة للعديد من عمليات المرض في جينوم الفئران وهناك الآن مكتبة واسعة من الكواشف الخاصة بالفئران التي يمكن الحصول عليها بسهولة. لذلك ، فإنها توفر الفرصة للتحليل عالي الإنتاجية نسبيا بطريقة أسرع وأقل تكلفة عند مقارنتها بالنماذج الحيوانية الأكبر1. بالإضافة إلى ذلك ، مع ظهور استراتيجيات التحرير الجيني التي تسمح بالإفراط في التعبير أو حذف جينات معينة إما على مستوى العالم أو بطريقة محددة لنوع الخلية و / أو بشكل تأسيسي أو بطريقة مستحثة ، فإنها تمثل نظاما نموذجيا مفيدا بيولوجيا للغاية للتحقيق في الأمراض البشرية والحيوانية2.
السرطان هو أحد المجالات التي تتمتع فيها نماذج الفئران بفائدة كبيرة. تعتمد نماذج الفئران الجينية للسرطان على تعديل التعبير عن الجينات المسرطنة أو الجينات المثبطة للورم ، بمفردها أو مجتمعة ، حتى تخضع الخلايا للتحول السرطاني. كما يتم حقن خطوط الخلايا السرطانية الأولية أو الثابتة في الفئران. لا يزال إدخال خطوط الخلايا أو الأنسجة من البشر أو الأنواع الحيوانية الأخرى ، بما في ذلك الفئران ، هو النموذج الأكثر استخداما للسرطان في الجسم الحي. يتم استخدام الخلايا والأنسجة من الأنواع غير المتشابهة (الطعوم الخارجية) في الفئران التي تعاني من نقص المناعةبشكل شائع 2. ومع ذلك ، فإن استخدام خلايا أو أنسجة ورم الطعم الخيفي حيث يكون كل من المضيف والمتلقي من نفس النوع يسمح بالتفاعل مع جهاز مناعي سليم عند دمجه مع نفس سلالة الفأر المضيف في الأنظمة الجينية3.
تؤدي أورام العظام الأولية أو ورم خبيث في العظام من الأورام الصلبة إلى آفات مؤلمة تنحلالية للعظم أو عظمية أو مختلطة / تنحلية عظمية 3,4. هذه الأورام تضر بنية العظام ، وتزيد من خطر الكسر المرضي ، وتترك للمرضى خيارات علاج محدودة. تنتقل أورام العظام الأولية إلى أعضاء بعيدة، مع بعض الأنواع القادرة على الانتشار إلى مواقع الهيكل العظمي الأخرى. في مرضى سرطان الثدي ، العظام هي الموقع الأكثر شيوعا للورم الخبيث الأول والموقع الأول الأكثر شيوعا لعرض المرضالنقيلي 5,6. بالإضافة إلى ذلك ، توجد الخلايا السرطانية المنتشرة (DTCs) في نخاع العظم قبل تشخيص ورم خبيث في الأعضاء الأخرى وتتنبأ بتطوره7. لذلك ، يعتقد أن الخلايا السرطانية الموجودة في العظام هي مصدر الخلايا التي تنتقل في النهاية إلى أنظمة الأعضاء الأخرى. توجد العديد من نماذج الفئران من ورم خبيث الورم الصلب التي تطور ورم خبيث في الغالب في الرئة والغدد الليمفاوية ، واعتمادا على نوع الورم وتقنية الحقن ، من المحتمل أن تكون أنظمة الأعضاء الأخرى3. ومع ذلك ، فإن نماذج الفئران من ورم خبيث العظام تفتقر إلى ذلك بشكل موثوق ، وتنتج بشكل متكرر ورم خبيث هيكلي خاص بالموقع وتطور ورم خبيث في العظام قبل أن تصل الفئران إلى معايير الإزالة المبكرة من عبء الورم الأولي أو ورم خبيث إلى أعضاء أخرى. لقد أبلغنا عن نموذج للساركوما العظمية لورم العظم الأساسي الذي يعتمد على الزرع الجراحي للطعم الخيفي للورم الصلب في الساق القريبة من الفئران8. تشكلت أورام العظام في 100 ٪ من الفئران و 88 ٪ وضعت ورم خبيث رئوي. يتجاوز حدوث ورم خبيث هذا ما يتم الإبلاغ عنه سريريا بشكل شائع في الأشخاص (~ 20-50٪) ، ولكنه ذو أهمية كبيرة لأن الرئة هي الموقع الأكثر شيوعا للورم الخبيث للساركوما العظمية9،10،11. في حين أن هذا النموذج مفيد في نمذجة أورام العظام الأولية ، إلا أنه يتمتع أيضا بفائدة كبيرة في نمذجة ورم خبيث في العظام من أورام صلبة أخرى مثل أورام الثدي والرئة والبروستاتا والغدة الدرقية والكبد والكلى والجهاز الهضمي.
كان الأساس المنطقي لتطوير هذا النموذج هو تطوير بديل للحقن التقليدي داخل العظم عادة في عظم الساق القريب أو عظم الفخذ البعيد لنمذجة أورام العظام الأولية أو ورم خبيثفي العظام 12. كان هدفنا الأساسي هو التخفيف من القيود المعروفة لهذه التقنية ، أي انصمام الورم في الرئة. ينتج عن هذا تطعيم هذه الخلايا السرطانية الصمية و "ورم خبيث اصطناعي" لا يلخص الشلال النقيلي الكامل من ورم عظمي أولي راسخ ينتقل إلى الرئتين 8,13. سيكون هذا هو الوضع أيضا عندما ينتشر ورم خبيث عظمي ثابت إلى موقع بعيد. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير هذه التقنية أيضا لإنتاج نموذج لورم خبيث في العظام من شأنه أن يضمن زيادة حدوث التطعيمات ونمو الأورام في العظام وفي موقع موحد عند مقارنتها بتقنيات الحقن التقويمي أو داخل الأوعية. هذا النموذج له مزايا مميزة على هذه التقنيات الموصوفة. يتضمن هذا النموذج التوصيل المتحكم فيه والمتسق للخلايا السرطانية إلى العظام. كما أنه يتجنب ورم خبيث في الرئة بعد الانصمام الرئوي ويؤسس مجموعة دراسة موحدة أساسية. هناك فائدة من الأورام الخاصة بالموقع مع هذا النموذج دون التعرض لخطر معايير الإزالة المبكرة الناتجة عن الأورام الأولية أو ورم خبيث إلى الأعضاء الأخرى. أخيرا ، هذا النموذج له فائدة كبيرة للتعديل ، بما في ذلك استخدام الطعوم الخارجية المشتقة من المريض.
النموذج المقدم له أوجه تشابه مع الحقن المباشر لتعليق الخلية في العظام باتباع نهج جراحي متبوعا إما بالحقن عبر القشرة أو التسليم في تجويف النخاع بعد إحداث عيب صغير في القشرة (مع أو بدون توسيع تجويف النخاع)8،14،15،16،17. ومع ذلك ، فإن زرع طعم خيفي للورم يجعل هذه التقنية مختلفة بشكل واضح. لذلك ، كان الغرض من هذا التقرير هو إظهار هذا النموذج لأورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام من الأورام الصلبة ، والذي يتغلب على العديد من قيود النماذج الموصوفة سابقا. المجموعات البحثية ذات الخبرة في زراعة الخلايا ، ونماذج الفئران ، وتخدير الفئران وجراحتها ، وتشريح الفئران مجهزة تجهيزا جيدا لإعادة إنتاج تقنيتنا لنمذجة أورام العظام الأولية أو ورم خبيث في الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية الموصوفة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة كامبريدج ، كامبريدج ، المملكة المتحدة.
1. إعداد خطوط الخلايا
- تنمو خطوط الخلايا وفقا لبروتوكولات زراعة الخلايا القياسية في المختبر لزراعة الخلايا التقليدية أو الحقن في الفئران. البروتوكولات القياسية المستخدمة هنا هي النمو في وسط النسر المعدل من Dulbecco الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، L-glutamine ، والبنسلين / الستربتومايسين (المعروف فيما يلي باسم وسط النمو الكامل).
ملاحظة: في هذه التجربة ، تستخدم خلايا ساركوما أبرامز العظمية في فئران Balb / c Foxn1 nu / nu . لدراسات سرطان الثدي ، يتم استخدام خلايا 4T1 في الفئران Balb / c وخلايا EO771 في الفئران C57BL / 6. - تنمو الخلايا إما في قوارير زراعة الأنسجة المنفوية أو ألواح زراعة الأنسجة ذات 6 آبار عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
- اجتياز خط اهتمام الخلية وإعداد الخلايا للحقن عندما تصل الخلايا إلى التقاء شائع الاستخدام مع حقن هذه الخلايا في الفئران.
2. الحيوانات
- استخدم فئران Balb / c Foxn1 nu / nu على الأقل من عمر 6-8 أسابيع لتوليد الورم تحت الجلد للتأكد من أن الحيوانات تجاوزت مرحلة النمو السريع وحققت مرحلة البلوغ والنضج الهيكلي.
- استخدم إما ذكور أو إناث الفئران. قم بعمل استثناءات عند اختيار خطوط الخلايا المستجيبة للهرمونات (على سبيل المثال ، خلايا سرطان الثدي في إناث الفئران وخلايا سرطان البروستاتا في ذكور الفئران).
- بالنسبة لتجارب xenograft ، استخدم الفئران العارية التي تعاني من نقص المناعة بناء على عدم توافق خط الخلية مع نظام المناعة السليم للفأر في ظل الظروف العادية.
- بالنسبة لتجارب الطعم الخيفي باستخدام خطوط خلايا الفئران ، يوصى بذلك أيضا بناء على خلفيات وراثية ومناعية مختلفة للفئران. ومع ذلك ، بالنسبة للتجارب الجينية ، استخدم الحيوانات من نفس سلالة خط الخلية محل الاهتمام.
- منزلية بكثافة قياسية اعتمادا على سياسات تربية المؤسسة.
3. الأورام تحت الجلد
- حصاد خطوط الخلايا من الثقافة عن طريق التربسين وإعادة تعليقها في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
- تقييم صلاحية الخلية وتحديد كثافة الخلية بطريقة استبعاد التريبان الأزرق. استخدم مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي لحساب الخلايا. يجب استخدام الحد الأدنى من صلاحية الخلية بنسبة 90٪ للحقن في الفئران لإنشاء أورام تحت الجلد.
- اضبط كثافة الخلية لحقن 1-2 × 105 خلايا في حجم نهائي من 0.1 إلى 0.15 مل (100 إلى 150 ميكرولتر) من PBS المعقم. الحفاظ على الخلايا على الجليد حتى الحقن.
- بدلا من ذلك ، خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا المحببة في وسط مصفوفة غشاء قاعدي معقم غير مخفف للحصول على 1-2 × 105 خلايا بحجم نهائي من 0.1 إلى 0.15 مل (100 إلى 150 ميكرولتر). الحفاظ على الخلايا على الجليد حتى استخدام مرة أخرى.
- تخدير الفئران لاستخدامها في نمو الورم تحت الجلد مع إيزوفلوران في تخدير الأكسجين. يجب استخدام جرعة تحريض من 5٪ إيزوفلوران في 2 لتر / دقيقة من الأكسجين وجرعة صيانة من 2-3٪ إيزوفلوران في 2 لتر / دقيقة من الأكسجين. تحقق من عدم وجود ردود فعل وميض أو دواسة قبل المضي قدما.
ملاحظة: إيزوفلوران هو مخدر استنشاقي. استخدم الأيزوفلوران في منطقة جيدة التهوية مع أنظمة الكسح المناسبة وجمع الغاز المجاني. يرجى استشارة الطاقم البيطري المؤسسي لوضع خطة لتحريض التخدير وصيانته ومراقبته، والتأكد من حصول موظفي المختبر على التدريب المناسب في مجال مراقبة التخدير والتعامل مع عوامل التخدير المستنشقة. - إزالة الشعر من المنطقة الظهرية من الصدر أو البطن من الفئران المخدرة مع محلول إزالة الشعر أو مع المقص الكهربائية. يفضل محلول إزالة الشعر لتقليل الصدمات المحتملة للجلد. تخطي هذه الخطوة في حالة استخدام الفئران عارية athymic.
- نظف المنطقة المحضرة بمسحة إيثانول بنسبة 70٪ قبل حقن تعليق الخلية.
- استخدم حقنة 1 مل من السل مع إبرة 27 جم لحقن الخلايا تحت الجلد فوق المنطقة الظهرية للصدر أو البطن ، حتى لا تتأثر بحركة لوحي الكتف. بدلا من ذلك ، حقن الخلايا تحت الجلد كمعلق في مصفوفة خارج الخلية المتاحة تجاريا.
ملاحظة: الحقن في مصفوفة خارج الخلية المتاحة تجاريا سيحد من هجرة معلق الخلية في الفضاء تحت الجلد لأن هذه المصفوفات تتصلب في درجة حرارة الغرفة. - استعادة الفئران على وسادة التدفئة في أقفاص فردية حتى الإسعافية. يمكن بعد ذلك وضع الفئران في أقفاصها العادية مع فراش نظيف وجاف.
- مراقبة حجم الورم تحت الجلد الذي يغطي الصدر الظهري أو البطن باستخدام الفرجار وقياس أوزان الجسم أسبوعيا للتأكد من أن الأورام تحت الجلد لا تتقرح أو أن الفئران تفي بمعايير الإزالة المبكرة على النحو الذي حددته لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في المؤسسات. يوصى بحد أقصى لحجم الورم 15 مم في أي بعد لتقليل خطر تقرح الجلد أو نخر الورم المركزي.
ملاحظة: استشر الإرشادات المحلية لتحديد الحد الأقصى المسموح به لحجم / حجم الورم. - القتل الرحيم للفئران التي تحمل أوراما تحت الجلد بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع عن طريق استنشاق CO2 متبوعا بخلع عنق الرحم. اتبع سياسات المؤسسة المقبولة للقتل الرحيم للفئران.
- حصاد الأورام تحت الجلد باستخدام تقنية جراحية معقمة. تعقيم الجلد الذي يغطي الورم كما كان من قبل باستخدام 70٪ من الإيثانول بعد إزالة الشعر (إن وجد). شق من خلال الجلد الذي يغطي الورم بشفرة مشرط # 15 (مع أو بدون مقبض شفرة مشرط). تشريح الورم بحدة من الأنسجة الرخوة المرفقة المحيطة مع زوج من مقص جراحي معقمة.
- ضع الورم في ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار تحتوي على وسط نمو كامل وقم باللحم المفروم إلى شظايا صغيرة متعددة ذات حجم محدد مسبقا (~ 0.6 مم × 0.6 مم × 0.6 مم - 0.25 مم 3 حتى 1 مم × 1 مم × 1 مم - 1 مم3) بشفرة مشرط # 15 (مع أو بدون مقبض شفرة مشرط).
- الحفاظ على شظايا الورم في وسط نمو كامل معقم في درجة حرارة الغرفة حتى وقت زرع داخل الظنبوب. بالنسبة لخطوط الخلايا التي تحمل جينات لوسيفيراز أو جينات مراسل الفلورسنت ، استخدم التصوير الحيوي خارج الجسم الحي أو التصوير الفلوري لتأكيد صلاحية الورم قبل زرع داخل الظنبوب في الفئران.
- للحفظ بالتبريد ، ضع شظايا متعددة في نفس cryovial في وسط نمو كامل مكمل ب 20٪ FBS و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). قم بالتجميد تدريجيا باستخدام نظام الحفظ بالتبريد التجاري عند -80 درجة مئوية وتخزينها على المدى الطويل في النيتروجين السائل. الحفاظ على شظايا الورم للتحليل اللاحق ، ولكن ليس للزرع في المستقبل ، عن طريق التجميد المفاجئ باستخدام غمر النيتروجين السائل. قم بتخزين شظايا الورم المجمدة هذه على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية.
ملاحظة: تم الإبلاغ سابقا عن أن الأورام المجمدة المفاجئة لن تنقش وتنمو في الجسم الحي8.
4. الزرع الجراحي لشظايا الورم تحت الجلد
- إحضار شظايا جديدة أو محفوظة بالتبريد من الورم تحت الجلد إلى درجة حرارة الغرفة في وسط نمو كامل قبل الزرع الجراحي.
- تخدير الفئران من سلالة الاهتمام باستخدام الأيزوفلوران في تخدير الأكسجين كما هو موضح في القسم 3. تحقق من عدم وجود ردود فعل دواسة قبل المتابعة. يتم تطبيق البوبرينورفين تحت الجلد بجرعة 0.02-0.05 ملغ/كغ لتوفير التسكين في الفترة المحيطة بالجراحة. يمكن تكرار ذلك كل 6-8 ساعات في فترة ما بعد الجراحة ، إذا لزم الأمر.
- قم بإزالة الشعر على مفصل الركبة الأيمن والساق القريبة من الطرف الخلفي بمحلول إزالة الشعر لتقليل الصدمة المحتملة للجلد.
- فرك المنطقة المعدة بمطهر جراحي. افرك أولا بمسحة إيثانول بنسبة 70٪ ثم افركه بالتناوب مع الكلورهيكسيدين والمقشر الملحي.
- تصور الظنبوب القريب على أنه المنطقة البعيدة عن مفصل الركبة أثناء ثني المفصل وتمديده.
- قم بإنشاء شق 3-4 مم على مستوى الساق القريبة على الجانب الإنسي من الطرف باستخدام شفرة مشرط # 15 (مع أو بدون مقبض شفرة مشرط). شق من خلال الجلد والأنسجة تحت الجلد لفضح القشرة الإنسية للساق القريبة.
- قم بالضغط برفق بطرف إبرة 25 جم ، مع تدوير الطرف أيضا ، لإنشاء ثقب صغير في القشرة الإنسية للساق القريبة. اجعل هذا الثقب بعيدا حوالي 2 مم عن مفصل الركبة عند نقطة متساوية المسافة بين القشرة الظنبوبية القحفية والذيلية. حدد حجم الإبرة حسب حجم شظايا الورم.
- استخدم ملقط معقم لالتقاط شظايا الورم وإدخالها في التجويف النخاعي للساق القريبة. استخدم إبرة من 27 إلى 30 جم لمعالجة جزء الورم في القناة النخاعية. اعتمادا على حجم شظايا الورم ، قم بزرع ما لا يقل عن 0.5 مم3 من إجمالي حجم الورم في كل ساق. قد يتطلب ذلك زرع 1 أو أكثر من شظايا الورم اعتمادا على حجم شظايا الورم التي تم إنشاؤها.
ملاحظة: التعديلات لمنع أو الحد من إزاحة الكسب غير المشروع خارج العظم هي وضع شمع العظام أو الأسمنت العظمي في عيب العظام أو إما رغوة الهلام أو طعم الدهون تحت الجلد فوق الفتحة الموجودة في العظم. - ضع حواف الجلد بلاصق مناديل سائلة معقمة أو خياطة جلدية واحدة. لا تستخدم مقاطع الجرح في هذا الموقع. توخ الحذر عند استخدام التصوير الفلوري في فترة ما بعد الجراحة ، لأن كل من المواد اللاصقة للأنسجة والخياطة لديها القدرة على التألق.
- استعادة الفئران على وسادة التدفئة في أقفاص فردية حتى الإسعافية.
5. التقييم التسلسلي ونقطة النهاية
- تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران في تخدير الأكسجين كما هو موضح سابقا.
- قم بتقييم نمو ورم الظنبوب بشكل غير جراحي إما عن طريق التصوير الشعاعي الرقمي الأسبوعي أو التلألؤ الحيوي أو التصوير الفلوري (إذا كنت تستخدم خلايا تعبر عن لوسيفيراز أو جين مراسل فلوريسنت). يمكن أيضا إجراء قياسات الفرجار للطرف في موقع الزرع في الفئران المستيقظة.
- بالإضافة إلى المراقبة التقليدية للفئران الحاملة للورم (وزن الجسم ، ومستوى النشاط ، ومعدل التنفس ، والاستمالة ، والموقف ، والعقل ، والسلوك) ، راقب الفئران أسبوعيا بحثا عن علامات عرج الأطراف الخلفية والتورم وعدوى موقع الجراحة.
- راقب الجرح الجراحي الجلدي لأول 10-14 يوما بحثا عن الاحمرار المفرط والتورم والتصريف وتفكك الجرح حتى يلتئم جرح الجلد. بعد 4-5 أسابيع ، قم بتقييم الفئران وفقا لتقييم نتائج الدراسة إما على قيد الحياة أو بعد القتل الرحيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قد تترافق النتيجة الإيجابية مع تطعيم الورم ونمو الورم التدريجي بمرور الوقت. اعتمادا على نوع الورم ، قد يرتبط نمو الورم داخل العظم بعرج الأطراف الخلفية التدريجي ، لكن العديد من الأورام لا تسبب العرج على الرغم من علامات مرض العظام المصاحب. تم توثيق النقش الناجح بالتصوير المتقدم ، حيث ستكون هناك تغييرات إشعاعية تقدمية أو μCT أو μMRI في الساق القريبة المرتبطة بالنمط الظاهري العظمي لخط اهتمام الخلية (ورم خبيث عظمي ، عظمي الأرومات ، أو ورم خبيث مختلط / عظمي باني) (الشكل 1) 8. في تقريرنا السابق ، كان العيب القشري الناتج عن زرع ترقيع الورم مرئيا في الساق القريبة بعد أسبوع واحد من الزرع (الشكل 1 أ). بحلول الأسبوع 2 ، كان هناك انحلال عظمي مرئي وإعادة تشكيل العظام بجوار العيب القشري. من الأسابيع 2-5 ، كان هناك تدمير تدريجي للعظام وتشكيل عظام جديدة مرتبطة بتطعيم الورم ونموه (الشكل 1B-E). بالنسبة لخطوط الخلايا التي تحتوي على جينات مراسلة ، فإن التغيرات العظمية ستكون مصحوبة بزيادات في مخرجات التصوير الفلوري أو التلألؤ الحيوي بمرور الوقت. قد يكون العرج الحاد مؤشرا على كسر العظام المرضي الوشيك أو الفعلي ، مما يستلزم إجراء تقييم إشعاعي فوري ودقيق للفأر ، وربما الإزالة المبكرة من الدراسة. اعتمادا على خط الخلايا السرطانية التي تتم دراستها ، قد يحدث تدمير العظام بسرعة ، قبل ورم خبيث بوقت طويل. هذا له أهمية خاصة في الدراسات التي تنطوي على أورام العظام الأولية ، حيث قد يتعين إزالة الفئران من الدراسة قبل تطور ورم خبيث ذي صلة سريريا ، أي الرئة. في هذه الحالات ، يوصى بالبتر الجراحي للطرف الحامل للورم للسماح بدراسة الحد الأدنى من المرض المتبقي وورم خبيث لاحق عند استخدام أورام العظام الأولية ، كما ذكرنا سابقا 4,8. في حين أن البتر الكامل للأطراف الخلفية في البشر لا يتم إجراؤه عادة ، إلا أن هذا هو معيار الرعاية في الطب البيطري ، حيث تم توثيق أوجه التشابه في الخصائص السريرية والجزيئية للساركوما العظمية البشرية والكلاب بشكل جيد. وبالتالي ، فإن بتر الأطراف الخلفية في الفئران مناسب للعديد من خطوط الخلايا الحيوانية. بالإضافة إلى ذلك ، يعد البتر طريقة علاج قابلة للتطبيق في الفئران لأن إجراءات استبقاء الأطراف المستخدمة في البشر لا يمكن تحقيقها في القوارض الصغيرة مثل الفئران. في الفئران التي تحمل أورام العظام الأولية ، قد يشير عدم الشهية وفقدان الوزن التدريجي وحالة الجسم السيئة العامة وصعوبة التنفس (زيادة المعدل أو الجهد) إلى تطور ورم خبيث في الرئة والأعضاء الأخرى. يوصى بالتثبيت عن طريق التصوير الحيوي أو التصوير المقطعي المحوسب أو التصوير بالرنين المغناطيسي لتأكيد ورم خبيث ، ويجب القتل الرحيم للحيوانات المصابة.
يجب الاشتباه في وجود نتيجة سلبية ، ناتجة على الأرجح عن نقص تطعيم الورم ، إذا لم يكن هناك دليل على حدوث تغييرات تدريجية (آفات انحلالية العظم ، أو العظمية ، أو آفات العظم / العظمية المختلطة ، اعتمادا على خط الخلية قيد الدراسة) على التصوير الشعاعي أو فحص التصوير المقطعي المحوسب للساق المزروعة. بالنسبة لخطوط الخلايا التي تحمل جينات المراسل ، فإن عدم وجود زيادة في إشارات التألق أو التلألؤ الحيوي بمرور الوقت عن طريق التصوير البصري من شأنه أن يدعم أيضا الاستنتاج بأن الورم قد فشل في التطعيم. يمكن أن يترافق نقص أو ضعف النقش مع عدوى موقع الجراحة. ومع ذلك ، فإن هذا من شأنه أن يظهر علامات سريرية محددة مثل الاحمرار أو التورم أو الإفرازات الأكثر شيوعا في فترة ما بعد الجراحة المبكرة (أول 1-2 أسابيع بعد الجراحة). يمكن أن تكون الحيوانات أيضا حموية وتظهر قلة النشاط أو وضعية منحنية في فترة ما بعد الجراحة المبكرة بسبب عدوى موقع الجراحة. إن حصاد الطعم الخيفي والحفاظ عليه في ظل ظروف معقمة أثناء التحضير والتحضير المعقم المناسب للطرف ، والتقنية المعقمة أثناء العملية ، والإغلاق الكامل للجرح سيقلل من احتمالية حدوث مضاعفات للجرح الجراحي بعد الجراحة مما يؤدي إلى العدوى وفشل تطعيم الورم.
في تقريرنا السابق8 ، عند تضمين كل من الدراسات التجريبية والنهائية المبلغ عنها ، تقدم 16 من أصل 16 فأرا (100٪) مزروعة بشظايا ساركوما عظمية إلى آفات عظمية حاللة للعظم و 14 من أصل 16 فأرا (88٪) أصيبوا بورم خبيث. لوحظت جميع النقائل إلى الرئة وتم تشخيصها بواسطة الأنسجة في وقت مبكر من 3 أسابيع بعد الزرع8. لم تكشف الحيوانات الإضافية التي تم تشريحها في 1 (ن = 2) و 2 (ن = 2) أسابيع بعد الزرع عن أي دليل على ورم خبيث في الرئة.
الشكل 1: التصوير الشعاعي التسلسلي. التصوير الشعاعي التسلسلي (بالترتيب) يتم إجراؤه أسبوعيا في (A) 1 و (B) 2 و (C) 3 و (D) 4 و (E) بعد 5 أسابيع من زرع الطعم الخيفي للورم تحت الجلد داخل الظنبوب باستخدام خط خلايا ورم عظمي أولي (ساركوما عظمية). بمرور الوقت ، كان هناك تدمير تدريجي للعظام وتشكيل عظام جديدة مرتبطة بتطعيم الورم ونموه. تم تعديل هذا الرقم بإذن من المرجع8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوثق هذا التقرير نموذجنا لإنشاء أورام العظام الأولية أو ورم خبيث في العظام بعد زرع الطعم الخيفي داخل الظنبوب للورم. ونعتقد أن هناك عدة خطوات حاسمة في هذه العملية. يجب إنشاء مستوى مخدر آمن لكل من الحقن تحت الجلد لتعليق الخلايا السرطانية ووضع شظايا الورم الناتجة داخل الظنبوب. يجب أن يكون هناك إعداد معقم للموقع الجراحي لإزالة كل من الطعم الخيفي تحت الجلد ووضع الطعم الخيفي داخل الظنبوب. يجب إنشاء شظايا الطعم الخيفي للورم بشكل موحد للزرع اللاحق داخل الظنبوب. يجب إنشاء عيب بحجم مناسب في الساق القريبة لزرع شظايا الورم. يجب إغلاق جرح الجلد الجراحي تماما لتقليل مخاطر مضاعفات الجرح بعد الجراحة. الخطوة الأخيرة الحاسمة هي أنه إذا تم استخدام المصفوفة خارج الخلية كجزء من تعليق الخلايا السرطانية للحقن تحت الجلد ، فيجب استخدام تعليمات المناولة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة لتجنب تصلب التعليق قبل الحقن. إن التحضير المعقم المناسب للطرف ، والتقنية المعقمة أثناء العملية ، والإغلاق الكامل للجرح سيقلل من احتمالية حدوث مضاعفات للجرح الجراحي بعد الجراحة.
تعد ميزات الورم المزروع والتقنية الجراحية أمرا بالغ الأهمية للحصول على نتائج ناجحة وقابلة للتكرار لدمجها في مجتمع دراستك. في البداية ، يجب التحقق من أن الطعم الأجنبي للورم / الطعم الخيفي يتم زرعه مباشرة في التجويف النخاعي للساق ، مع التأكد من أن أنسجة الورم داخل العظم بالكامل. التعديلات لمنع أو الحد من إزاحة الكسب غير المشروع خارج العظم ستكون في البداية وضع شمع العظام أو الأسمنت العظمي في عيب العظام أو إما رغوة هلام أو طعم دهني تحت الجلد فوق الثقب في العظم. البديل هو إدخال الطعم الخيفي للورم من خلال ثقب على الجانب الجانبي من الظنبوب القريب ، الذي تم إنشاؤه تحت عضلة الظنبوب القحفية. سيكون وجود العضلة الظنبوبية القحفية بمثابة غطاء بيولوجي فوق عيب العظام ، مما يحد من الإزاحة المحتملة للطعم الخيفي للورم. ومع ذلك ، هذا هو نهج جراحي أكثر عدوانية مع احتمال حدوث صدمة عصبية عضلية على الجانب الجانبي من الساق القريبة. يجب توخي الحذر للتأكد من أن الطعم الخيفي للورم يتم إنشاؤه ليكون بحجم موحد قبل الزرع. ومع ذلك ، يجب ألا تتجاوز الطعم الخيفي للورم 1 مم في أي بعد ، نظرا لأن أحجام الورم الأكبر في أي نظام بيولوجي تكون أقل عرضة للنقش من الطعوم الأصغر عندما لا يكون هناك إمداد وعائي مباشر وفوري يتم توفيره للكسب غير المشروع في وقت الزرع. لقد أبلغنا عن نتائج ناجحة مع حجم الورم المزروع النهائي البالغ 0.5 مم 3 ولكننا نتوقع أن تحقق أحجام شظايا الورم المجمعة التي تصل إلى 1 مم3 نتائج ناجحة. ومع ذلك ، لم يتم تحديد الحد الأقصى لحجم جزء الورم القابل للزرع. بالمقارنة مع الأنسجة المحفوظة بالتبريد ، من المرجح أن تبقى الطعوم الخارجية للأورام الطازجة والطعم الخيفي على قيد الحياة ، على الرغم من أننا لم نلاحظ مشكلة في ممارسة استخدام الطعم الخيفي للورم المحفوظ بالتبريد بعناية. لا ينبغي زرع الطعم الخيفي المجمد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تشريح الكبسولة والجزء الخارجي من الورم تحت الجلد سيمنع أي مساهمة من هذه الطبقة من الورم ، والتي تكون ليفية ووعائية إلى حد كبير مع تسلل مناعي كبير بدلا من أن تتكون إلى حد كبير من الخلايا السرطانية المناسبة. هناك طريقة بديلة لإنشاء الطعم الخيفي للورم من كتلة الورم الأكبر مباشرة باستخدام شفرة مشرط وهي استخدام إبرة خزعة صغيرة تخلق "نواة" ورم أسطوانية يمكن قطعها بعد ذلك إلى طول محدد مسبقا قبل الزرع. قد يكون استخدام إبرة الخزعة أو لكمة الخزعة الأساسية مفيدا في إنشاء شظايا ورم موحدة للزرع ، لأنه بعد إنشاء بعدين موحدين (العرض والعمق) من خلال عملية الخزعة ، يمكن بعد ذلك قطعهما إلى طول مناسب قبل الزرع. إذا تم استخدام جينات المراسل مثل لوسيفيراز أو بروتينات الفلورسنت في الخلايا السرطانية المزروعة ، فإن تقييم شظايا الورم في وقت الزرع أو 1 أسبوع بعد الزرع سيشير إلى المساهمة النسبية من الخلايا السرطانية في شظايا الورم المزروعة ، وكذلك الجدوى.
كما هو الحال مع أي إجراء ، هناك قيود بالإضافة إلى الفوائد المبلغ عنها لهذه التقنية. ورم خبيث هو عملية متعددة الخطوات تتطلب خلية من موقعها الأساسي لتنفيذ الغزو بنجاح والهجرة من خلال المصفوفة خارج الخلية ، داخل الأوعية الدموية للورم ، والبقاء على قيد الحياة في الدورة الدموية حتى يصل إلى وجهته النقيلية النهائية ، وتسرب إلى العضو المناسب ثم إما البقاء في حالة نائمة أو التكاثر لخلق آفة نقيلية ، وتعديل بنية الأنسجة الطبيعية لتصبح ورم خبيث يمكن اكتشافه سريريا18. تعتمد نماذج الفئران المستخدمة حاليا من ورم خبيث عظمي إلى حد كبير إما على الحقن التقويمي المباشر للخلايا السرطانية في الموقع الطبيعي للورم الرئيسي ، أو الحقن داخل الأوعية في البطين الأيسر للقلب أو محيطيا في أوردة الذيل (الأوردة الذيلية الجانبية أو الظهرية) ، أو الحقن المباشر داخل العظم لتعليق الخلايا السرطانية3. ومع ذلك ، فقد دعت التقارير الأخيرة التي تحاول تحسين نماذج ورم خبيث في العظام إلى الحقن في الشرايين غير المشروعة أو الذيلية أو الفخذية19،20،21. تتضمن كل هذه الطرق خطوة واحدة أو أكثر داخل شلال العظم النقيلي ، باستثناء الحقن المباشر داخل العظم أو في حالتنا زرع طعم خيفي للورم ، والذي ينتج فقط تعديل الأنسجة. لذلك ، هذا هو أحد القيود المتأصلة في أسلوبنا. هناك قيد إضافي هو أنه كما هو موضح حاليا ، فإنه يتطلب نشر الطعم الخيفي في مضيف فأر وسيط ، الأمر الذي يتطلب استخدام فئران إضافية ويؤدي إلى زرع ورم ليس خلايا ورمية نقية بنسبة 100٪. سيمتلك الطعم الخيفي بعض المساهمة اللحمية التي توفرها الأورام التي تنمو في مكان تحت الجلد. البديل المحتمل لتقليل هذه المساهمة اللحمية تحت الجلد هو حقن الخلايا تحت الجلد في ركيزة بيولوجية مثل مصفوفة خارج الخلية أو سقالة. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء حقن تقويم العظام في الموقع الرئيسي للورم ، يليه إزالة الورم وإعداد الكسب غير المشروع.
تتميز الطريقة الموضحة في هذا التقرير بمزايا رئيسية عند مقارنتها بالطرق الحالية لنمذجة أورام العظام الأولية أو ورم خبيث في العظام بعد الحقن المباشر داخل العظم للخلايا السرطانية. كما تمت مناقشته ، لاحظنا نحن وآخرون الانصمام المباشر للرئتين والموت الفوري العرضي بعد الحقن داخل الظنبوب لتعليق الخلية 8,13. ينتج هذا عن الحقن المضغوط للخلايا السرطانية في تجويف النخاع ، وبعد ذلك تدخل الخلايا السرطانية إلى إمدادات الدم المحيطية من خلال الجيوب الأنفية الوعائية لنخاع العظم ويتم نقلها إلى الرئة عن طريق العودة الوريدية. هذه الأحداث قابلة للمقارنة ميكانيكيا مع تلك التي لوحظت مع الجلطات الدموية الرئوية أو الوريدية المرتبطة بوضع الغرسات المضغوطة في تجويف النخاع المرتبط برأب المفاصل الكلي في البشر والحيوانات. نحن وآخرون نفترض أن هذه الظاهرة الصمية للرئتين قد تكون محددة لخط الخلية (ملاحظات غير منشورة). ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن خطوات مفصلة للغاية للحد من إنشاء هذه النقائل الأثرية الصمية12. في البداية ، يجب أن يكون هناك تريبسين كاف وإنشاء تعليق خلية واحدة موحدة للحقن ، والتي يجب تخزينها على الجليد لمنع تكتل الخلايا. يجب وضع الإبرة بشكل صحيح من خلال صفيحة نمو الظنبوب القريبة ، وبعد ذلك يجب إجراء أحجام حقن صغيرة (~ 10 ميكرولتر) وحقن خالية من المقاومة في تجويف النخاع. على الرغم من ذلك، يمكن ملاحظة توصيل الخلايا السرطانية إلى الرئتين، وكذلك إلى الأعضاء الأخرى، بسهولة عن طريق تصوير التلألؤ الحيوي بعد تقنيات الحقن داخل العظم وداخل الأوعية، مما يشير إلى أنه من الممكن أن تؤدي الخلايا التي تولد إشارة التوهج الحيوي هذه في الرئتين والأعضاء الأخرى إلى ورم خبيث بعيد (ملاحظات غير منشورة)3. لقد وجدنا أن فائدة أخرى لهذه التقنية هي أن ورما واحدا ينمو في موقع عظمي موحد داخل مجتمع الدراسة ، مما يقلل من التباين من إلى. وهذا يتيح إنشاء مجتمع دراسة موحد ومقارنة جاهزة بين مجموعات العلاج. هذا على عكس ورم خبيث في العظام يتطور بعد الحقن التقويمي أو داخل الأوعية الدموية ، حيث يمكن للخلايا أن تنتقل إلى مواقع هيكلية مختلفة وتنمو مع حركية مختلفة ، مما يجعل المقارنات بين مجموعات الدراسة صعبة. كما أن نمو الورم في موقع تشريحي واحد بعد زرع الطعم الخيفي للورم يتجنب أيضا إمكانية إزالة الفئران بسبب ورم خبيث إلى أجهزة الأعضاء الأخرى أو عبء الورم الأولي ، كما يمكن رؤيته مع تقنيات الحقن داخل الأوعية الدموية وتقويم العظام. بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا نقشا بنسبة 100٪ بعد زرع الطعم الخيفي للورم ، والذي يدعم مجموعة دراسة موحدة ويتجنب الاستخدام غير الضروري للفئران الإضافية لتحقيق أرقام حجم العينة المناسبة. هذا أيضا يتغلب على الحد من الحقن غير الكامل وغير الدقيق بعد الحقن عن طريق الجلد من معلقات الخلايا السرطانية في العظام.
تتمتع هذه التقنية بدرجة كبيرة من التنوع مما أدى إلى تعديلات يتم استخدامها حاليا في بحثنا ولديها القدرة على تحقيق فائدة كبيرة للتطبيقات المستقبلية. في البداية ، بينما نستخدم الظنبوب القريب كموقع زرع داخل العظم ، يمكن بسهولة استخدام المواقع الشائعة الأخرى لأورام العظام الأولية أو ورم خبيث في العظام ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر عظم الفخذ البعيد وعظم العضد القريب. ومع ذلك ، فإن النهج الجراحي لهذه المواقع وكذلك لمناطق مثل الحوض والعمود الفقري يتطلب نهجا جراحيا أكثر شمولا تدريجيا عند مقارنته بالساق القريبة. بالإضافة إلى ذلك ، لا تستفيد مواقع مثل الحوض والعمود الفقري والجمجمة ونصف القطر والزند من مخزون العظام الكافي لزرع الورم. بالنسبة للأورام الخبيثة الغازية للعظام مثل أورام الفم ، فإن وضع الطعم الخيفي للورم بجوار العظام أو داخل البلعوم الفموي قد يلخص أيضا تطور الأورام الغازية 3,22. غالبا ما تستخدم التجارب في المختبر وفي الجسم الحي تقنيات الثقافة المشتركة أو الحقن المشترك لتحديد تأثيرات أنواع الخلايا المختلفة على نوع الخلية محل الاهتمام. لذلك ، توجد إمكانية لحقن نوعين أو أكثر من الخلايا في وقت واحد لإنشاء أورام تحت الجلد ، والتي يمكن بعد ذلك زرعها في العظام باستخدام هذه التقنية. يمكن استخدام الخلايا المعدلة وراثيا بمفردها أو بالاشتراك مع خلايا طبيعية أو معدلة وراثيا أخرى لإنشاء الطعم الخيفي للورم. مع الاهتمام المتزايد بالطب الدقيق وإنشاء نماذج في المختبر وفي الجسم الحي للسرطان البشري ، تكتسب زراعة الطعم الأجنبي المشتقة من المريض في الفئران شعبية. في الآونة الأخيرة ، تم وصف نموذج لورم خبيث عظمي لسرطان الثدي حيث تم زرع الطعوم الخارجية المشتقة من المريض بشكل متعامد إلى أقراص عظمية بشرية مزروعة تحت الجلد في الفئران العارية23. من هذا ، يمكن زرع الطعوم الخارجية المشتقة من المريض مباشرة في العظام باستخدام نموذجنا ، دون الحاجة إلى مضيف وسيط للتكاثر تحت الجلد. هذا من شأنه أن يسمح بالتقييم السريع لحركية الورم والقدرة على تقييم مجموعات علاجية متعددة يحتمل أن تكون من خزعة مريض واحد فقط ، ولا تتطلب كتلة ورم كبيرة لإعداد الطعم الخيفي. يمكن أيضا استخدام الاستخدام المتزايد للعضويات في أبحاث السرطان في نموذجنا24. سيتطلب ذلك حقن إبرة أو ماصة من مجاميع الخلايا هذه من خلال الفتحة الموجودة في قشرة الظنبوب. لذلك ، نوصي بإغلاق العيب القشري (كما تمت مناقشته أعلاه) للحد من إمكانية هجرة الأعضاء خارج تجويف العظام والنخاع. كما فعلنا ، يمكن تسمية الخلايا وتتبعها عن طريق التصوير البصري (التلألؤ الحيوي أو التألق) أو التصوير المتقدم (التصوير الشعاعي الرقمي ، μCT ، أو μMRI) مما يسمح بتقييم نمو الورم بمرور الوقت. هذا له أيضا فائدة في تقليل أعداد الحيوانات حيث يتم تصوير نفس الحيوانات بمرور الوقت.
باختصار ، يوضح هذا التقرير تقنيتنا في نمذجة أورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام باستخدام زرع طعم الورم الصلب في العظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تم تمويل الدكتور هيلدريث من قبل المعاهد الوطنية للصحة بموجب رقم الجائزة K01OD026527. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Acknowledgments
يقر المؤلفون بالمساهمة الحاسمة للدكتورة بيث تشافي ، DVM ، دكتوراه ، DACVP في تطوير هذه التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
References
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
- Simmons, J. K., et al.
- Wolfe, T. D., et al. Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- James, J. J., et al. metastases from breast carcinoma: histopathological - radiological correlations and prognostic features. British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Chaffee, B. K., Allen, M. J. A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis. In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).
- Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma. Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).
- Huang, X., et al. Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study. Journal of Bone Oncology. 16, 100230 (2019).
- Li, W., Zhang, S. Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases. Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
- Maloney, C., et al. Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model. Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
- Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis. BoneKey Reports. 5, 777 (2016).
- Marques da Costa, M. E., et al. Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice. Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).
- Raheem, O., et al. A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions. Journal of Translational Medicine. 9, 185 (2011).
- Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma. Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Yu, C., et al. Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (115), e53982 (2016).
- Kuchimaru, T., et al. A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries. Nature Communications. 9 (1), 2981 (2018).
- Haley, H. R., et al. Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice. Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).
- Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma. Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).
- Lefley, D., et al. Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts. Breast Cancer Research. 21 (1), 130 (2019).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
