Summary
Модели метастазирования в кости не развивают метастазы равномерно или со 100% частотой. Прямая внутрикостная инъекция опухолевых клеток может привести к эмболизации легкого. Мы представляем нашу методику моделирования первичных опухолей костей и метастазов в кости с использованием имплантации солидного опухолевого трансплантата в кость, что приводит к воспроизводимому приживлению и росту.
Abstract
Первичные опухоли костей или метастазы в кости из солидных опухолей приводят к болезненным остеолитическим, остеобластическим или смешанным остеолитическим/остеобластическим поражениям. Эти поражения нарушают структуру кости, увеличивают риск патологических переломов и оставляют пациентов с ограниченными возможностями лечения. Первичные опухоли костей метастазируют в отдаленные органы, причем некоторые типы способны распространяться на другие участки скелета. Тем не менее, последние данные свидетельствуют о том, что при многих солидных опухолях раковые клетки, которые распространились на кости, могут быть основным источником клеток, которые в конечном итоге метастазируют в другие системы органов. Большинство сингенных или ксенотрансплантатных мышиных моделей первичных опухолей костей включают внутрикостную (ортотопическую) инъекцию суспензий опухолевых клеток. Некоторые животные модели скелетных метастазов из солидных опухолей также зависят от прямой инъекции в костную ткань, в то время как другие пытаются повторить дополнительные этапы костного метастатического каскада путем внутрисосудистого введения клеток или в орган первичной опухоли. Однако ни одна из этих моделей не развивает метастазы в кости надежно или со 100% заболеваемостью. Кроме того, было показано, что прямая внутрикостная инъекция опухолевых клеток связана с потенциальной эмболизацией опухоли легкого. Эти эмболические опухолевые клетки приживаются, но не повторяют метастатический каскад. Мы сообщили о мышиной модели остеосаркомы, в которой свежие или криоконсервированные фрагменты опухоли (состоящие из опухолевых клеток плюс стромы) имплантируются непосредственно в проксимальный отдел большеберцовой кости с использованием минимально инвазивной хирургической техники. У этих животных развилось воспроизводимое приживление, рост и, со временем, остеолиз и метастазирование в легкие. Этот метод обладает универсальностью для моделирования метастазов в костную ткань солидной опухоли и может легко использовать трансплантаты, состоящие из одного или нескольких типов клеток, генетически модифицированных клеток, ксенотрансплантатов, полученных от пациентов, и / или меченых клеток, которые можно отслеживать с помощью оптической или расширенной визуализации. Здесь мы демонстрируем эту технику, моделируя первичные опухоли костей и метастазы в кости с помощью имплантации солидного опухолевого трансплантата в кость.
Introduction
Мышиные модели болезней человека и животных становятся все более популярными в биомедицинских исследованиях. Полезность использования мышей в этом контексте заключается в том, что их анатомия и физиология очень похожи на человеческие. Они имеют относительно короткий период беременности и время в послеродовой жизни для достижения зрелости и в значительной степени связаны с относительно низкой стоимостью и простотой жилья, хотя растущие затраты на развитие или покупку связаны с большей степенью генетической модификации, иммунодефицита и/или гуманизации1. Использование инбредных штаммов приводит к созданию в значительной степени однородной популяции животных до включения в исследование. Полное знание их генома предполагает высокую степень сходства с людьми. Ортологичные молекулярные мишени для многих болезненных процессов были идентифицированы в геноме мыши, и в настоящее время существует обширная библиотека специфических для мышей реагентов, которые легко доступны. Таким образом, они предоставляют возможность для относительно высокопроизводительного анализа более быстрым и менее дорогостоящим способом по сравнению с более крупными моделями животных1. Кроме того, с появлением стратегий генетического редактирования, которые допускают сверхэкспрессию или делецию определенных генов либо глобально, либо специфическим образом для типа клеток и/или конститутивно или индуцируемым образом, они представляют собой очень биологически полезную модельную систему для исследования болезней человека и животных2.
Рак — это одна из областей, в которой модели мышей имеют большую полезность. Генетические мышиные модели рака основаны на модуляции экспрессии либо онкогенов, либо генов-супрессоров опухолей, отдельно или в комбинации, чтобы клетки подвергались онкогенной трансформации. Также выполняется инъекция первичных или установленных линий опухолевых клеток мышам. Введение клеточных линий или тканей от людей или других видов животных, включая мышей, остается наиболее широко используемой моделью рака in vivo. Чаще всего выполняется использование клеток и тканей разнородных видов (ксенотрансплантатов) у мышей с ослабленным иммунитетом2. Однако использование опухолевых клеток или тканей аллотрансплантата, где и хозяин, и реципиент принадлежат к одному и тому же виду, позволяет взаимодействовать с интактной иммунной системой в сочетании с одним и тем же штаммом мыши-хозяина в сингенных системах3.
Первичные опухоли костей или метастазы в кости из солидных опухолей приводят к болезненным остеолитическим, остеобластическим или смешанным остеолитическим/остеобластическим поражениям 3,4. Эти опухоли нарушают структуру кости, увеличивая риск патологического перелома, и оставляют пациентов с ограниченными возможностями лечения. Первичные опухоли костей метастазируют в отдаленные органы, причем некоторые типы способны распространяться на другие участки скелета. У пациентов с раком молочной железы кость является наиболее распространенным местом первого метастазирования и наиболее частым первым местом проявления метастатического заболевания 5,6. Кроме того, диссеминированные опухолевые клетки (DTC) присутствуют в костном мозге до постановки диагноза и предсказывают развитие метастазов в других органах7. Поэтому считается, что раковые клетки, присутствующие в кости, являются источником клеток, которые в конечном итоге метастазируют в другие системы органов. Существует множество мышиных моделей метастазов солидной опухоли, которые развивают метастазы преимущественно в легких и лимфатических узлах, а в зависимости от типа опухоли и техники инъекции потенциально другие системы органов3. Тем не менее, мышиные модели метастазирования в кости отсутствуют, чтобы надежно, воспроизводимо производить специфические для сайта скелетные метастазы и развивать метастазы в кости до того, как мыши достигнут критериев раннего удаления из первичной опухолевой нагрузки или метастазирования в другие органы. Мы сообщили о модели первичной костной опухолевой остеосаркомы, которая основана на хирургической имплантации аллотрансплантата солидной опухоли в проксимальный отдел большеберцовой кости мышей8. Опухоли костей образовались у 100% мышей, а у 88% развились легочные метастазы. Эта частота метастазирования превышает то, что обычно сообщается клинически у людей (~ 20-50%), но представляет большой интерес, поскольку легкое является наиболее распространенным местом метастазирования остеосаркомы 9,10,11. Хотя эта модель выгодна при моделировании первичных опухолей костей, она также имеет большое значение для моделирования метастазов в кости из других остеотропных солидных опухолей, таких как опухоли молочной железы, легких, простаты, щитовидной железы, печени, почек и желудочно-кишечного тракта.
Обоснование разработки этой модели состояло в том, чтобы разработать альтернативу традиционной внутрикостной инъекции, обычно в проксимальный отдел большеберцовой или дистальной части бедренной кости, для моделирования первичных опухолей кости или метастазовв кости 12. Наша основная цель состояла в том, чтобы смягчить известное ограничение этого метода, т.е. эмболизацию опухоли легкого. Это приводит к приживлению этих эмболических опухолевых клеток и «искусственному метастазированию», которые не повторяют полный метастатический каскад из установленной первичной опухоли кости, которая метастазирует в легкие 8,13. Это также может быть ситуация, когда установленный костный метастаз распространяется на отдаленный участок. Кроме того, этот метод также был разработан для получения модели метастазирования в кости, которая обеспечила бы большую частоту приживления и роста опухолей в кости и в однородном месте по сравнению с ортотопическими или внутрисосудистыми инъекционными методами. Эта модель имеет явные преимущества по сравнению с этими описанными методами. Эта модель включает контролируемую, последовательную доставку опухолевых клеток в кость. Он также позволяет избежать искусственного метастазирования в легкие после эмболизации легочной артерии и устанавливает исходную однородную исследуемую популяцию. Существует преимущество сайт-специфических опухолей с этой моделью без риска раннего удаления критериев в результате первичных опухолей или метастазирования в другие органы. Наконец, эта модель очень полезна для модификации, включая использование ксенотрансплантатов, полученных от пациентов.
Представленная модель имеет сходство с прямой инъекцией клеточной суспензии в кость после хирургического доступа с последующей инъекцией через кору головного мозга или доставкой в полость костного мозга после создания небольшого дефекта в коре (с развертыванием или без развертывания медуллярной полости)8,14,15,16,17 . Однако имплантация опухолевого аллотрансплантата делает этот метод совершенно другим. Таким образом, целью данного доклада была демонстрация данной модели первичных опухолей костей и метастазирования в кости из солидных опухолей, которая преодолевает многие ограничения ранее описанных моделей. Исследовательские группы, имеющие опыт работы с клеточными культурами, мышиными моделями, анестезией и хирургией мышей, а также анатомией мышей, хорошо оснащены для воспроизведения нашей техники моделирования первичных опухолей костей или метастазов в кости у мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные эксперименты на животных были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Кембриджского университета, Кембридж, Великобритания.
1. Подготовка клеточных линий
- Выращивайте клеточные линии в соответствии со стандартными лабораторными протоколами культивирования клеток для традиционной клеточной культуры или инъекции мышам. Стандартными протоколами, используемыми здесь, являются рост в модифицированной среде Игла Дульбекко, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), L-глютамин и пенициллин/стрептомицин (далее известный как полная среда для роста).
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте клетки остеосаркомы Абрамса используются у мышей Balb/c Foxn1 nu/nu . Для исследований рака молочной железы используются клетки 4T1 у мышей Balb/c и клетки EO771 у мышей C57BL/6. - Выращивайте клетки либо в вентилируемых колбах для культивирования тканей, либо в 6-луночных планшетах для культивирования тканей при 37 ° C при 5% CO2.
- Пройдите интересующую клеточную линию и подготовьте клетки к инъекции, когда клетки достигнут слияния, обычно используемого при инъекции этих клеток мышам.
2. Животные
- Используйте мышей Balb/c Foxn1 nu/nu в возрасте не менее 6-8 недель для образования подкожных опухолей, чтобы убедиться, что животные вышли из фазы быстрого роста и достигли взрослой жизни и зрелости скелета.
- Используйте либо самцов, либо самок мышей. Делайте исключения при выборе гормонально-чувствительных клеточных линий (например, клетки рака молочной железы у самок мышей и клетки рака предстательной железы у самцов мышей).
- Для экспериментов с ксенотрансплантатами используйте иммунодефицитных атимических обнаженных мышей на основе того, что клеточная линия несовместима с интактной иммунной системой мыши в нормальных условиях.
- Для экспериментов с аллотрансплантатами с использованием линий мышиных клеток это также рекомендуется на основе различных генетических и иммунных предпосылок мышей. Однако для сингенных экспериментов используйте животных того же штамма, что и интересующая клеточная линия.
- Домашние животные со стандартной плотностью в зависимости от политики содержания в учреждении.
3. Подкожные опухоли
- Собирают клеточные линии из культуры путем трипсинизации и ресуспендируют в стерильном фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
- Оцените жизнеспособность клеток и определите плотность клеток методом исключения трипанового синего. Используйте гемоцитометр или автоматический счетчик клеток для подсчета клеток. Минимальная жизнеспособность клеток 90% должна использоваться для инъекций мышам для создания подкожных опухолей.
- Отрегулируйте плотность клеток, чтобы ввести 1-2 x 105 клеток в конечный объем от 0,1 до 0,15 мл (от 100 до 150 мкл) стерильного PBS. Держите клетки на льду до инъекции.
- В качестве альтернативы, грануляторы центрифугируют при 800 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулированные клетки в неразбавленной стерильной матричной среде базальной мембраны, чтобы получить 1-2 х 105 клеток в конечном объеме от 0,1 до 0,15 мл (от 100 до 150 мкл). Держите клетки на льду до дальнейшего использования.
- Обезболивают мышей для использования при росте подкожной опухоли изофлураном в кислородной анестезии. Используйте индукционную дозу 5% изофлурана в 2 л/мин кислорода и поддерживающую дозу 2-3% изофлурана в 2 л/мин кислорода. Проверьте отсутствие моргания или педальных рефлексов, прежде чем двигаться дальше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран является ингаляционным анестетиком. Используйте изофлуран в хорошо проветриваемом помещении с соответствующими системами продувки и сбора свободного газа. Пожалуйста, проконсультируйтесь с ветеринарным персоналом учреждения, чтобы разработать план индукции, обслуживания и мониторинга анестезии, а также убедитесь, что персонал лаборатории прошел соответствующую подготовку по мониторингу анестезии и обращению с ингаляционными анестетиками. - Удалите волосы из дорсальной области грудной клетки или живота анестезированных мышей раствором для депиляции или с помощью электрической машинки для стрижки. Раствор для депиляции предпочтителен, чтобы свести к минимуму потенциальную травму кожи. Пропустите этот шаг, если используете мышей с атимической обнаженной натурой.
- Очистите подготовленную область 70% тампоном этанола перед инъекцией клеточной суспензии.
- Используйте туберкулиновый шприц объемом 1 мл с иглой 27 г для подкожного введения клеток в дорсальную область грудной клетки или живота, чтобы на них не влияло движение лопаток. В качестве альтернативы, вводят клетки подкожно в виде суспензии в коммерчески доступный внеклеточный матрикс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция в коммерчески доступный внеклеточный матрикс ограничит миграцию клеточной суспензии в подкожном пространстве, поскольку эти матрицы затвердевают при комнатной температуре. - Восстановите мышей на грелке в отдельных клетках до амбулатории. Затем мышей можно поместить в их обычные клетки с чистой, сухой подстилкой.
- Контролируйте размер подкожной опухоли, покрывающей дорсальную грудную клетку или брюшную полость, с помощью штангенциркуля и еженедельно измеряйте массу тела, чтобы убедиться, что подкожные опухоли не изъязвляются или мыши не соответствуют критериям раннего удаления, установленным комитетом по уходу за животными и их использованию. Рекомендуется максимальный размер опухоли 15 мм в любом измерении, чтобы снизить риск изъязвления кожи или некроза центральной опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проконсультируйтесь с местными рекомендациями, чтобы определить максимально допустимый размер/объем опухоли. - Усыпляют мышей с подкожными опухолями через три-четыре недели путем вдыхания CO2 с последующим вывихом шейки матки. Следуйте принятой политике учреждения в отношении эвтаназии мышей.
- Собирают подкожные опухоли с помощью асептической хирургической техники. Стерилизуйте кожу, покрывающую опухоль, как и раньше, 70% этанолом после удаления волос (если применимо). Надрежьте кожу, покрывающую опухоль, лезвием скальпеля #15 (с ручкой лезвия скальпеля или без нее). Резко рассеките опухоль от окружающих прикрепленных мягких тканей с помощью стерильных хирургических ножниц.
- Поместите опухоль в 6-луночные пластины для культивирования тканей, содержащие полную питательную среду, и измельчите на несколько небольших фрагментов заранее определенного размера (~ 0,6 мм x 0,6 мм x 0,6 мм - 0,25 мм3 до 1 мм x 1 мм x 1 мм - 1 мм3) с помощью лезвия скальпеля #15 (с ручкой лезвия скальпеля или без нее).
- Хранить опухолевые фрагменты в стерильной полной питательной среде при комнатной температуре до момента интрабольшеберной имплантации. Для клеточных линий, которые несут люциферазу или флуоресцентные репортерные гены, используйте биолюминесцентную или флуоресцентную визуализацию ex-vivo, чтобы подтвердить жизнеспособность опухоли перед внутрибольшеберцовой имплантацией мышам.
- Для криоконсервации поместите несколько фрагментов в один и тот же криовиал в полную питательную среду с добавлением 20% FBS и 10% диметилсульфоксида (ДМСО). Постепенно замораживайте с помощью коммерческой системы криоконсервации при –80 °C и храните в жидком азоте длительное время. Сохранить фрагменты опухоли для последующего анализа, но не для будущей имплантации, путем мгновенной заморозки с помощью погружения в жидкий азот. Храните эти замороженные опухолевые фрагменты в течение длительного времени при температуре –80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее сообщалось, что замороженные опухоли не будут приживаться и расти in vivo8.
4. Хирургическая имплантация подкожных опухолевых фрагментов
- Перед хирургической имплантацией доведите свежие или криоконсервированные фрагменты подкожной опухоли до комнатной температуры в полной питательной среде.
- Анестезируют мышей интересующего штамма, используя изофлуран в кислородной анестезии, как описано в разделе 3. Прежде чем продолжить, проверьте отсутствие педальных рефлексов. Вводят подкожный бупренорфин в дозе 0,02-0,05 мг/кг для обеспечения периоперационной анальгезии. При необходимости это можно повторять каждые 6-8 ч в послеоперационном периоде.
- Удалите волосы на правом коленном суставе и проксимальном отделе большеберцовой кости задней конечности с помощью раствора для депиляции, чтобы свести к минимуму потенциальную травму кожи.
- Протрите подготовленный участок хирургическим антисептиком. Сначала потрите 70% этанолом, а затем потрите чередующимся хлоргексидином и солевым скрабом.
- Визуализируйте проксимальный отдел большеберцовой кости как область, расположенную дистальнее коленного сустава, сгибая и разгибая сустав.
- Сделайте разрез 3-4 мм на уровне проксимального отдела большеберцовой кости на медиальной стороне конечности с помощью лезвия скальпеля #15 (с ручкой лезвия скальпеля или без нее). Надрежьте кожу и подкожную клетчатку, чтобы обнажить медиальную кору проксимального отдела большеберцовой кости.
- Слегка надавите кончиком иглы 25 G, одновременно вращая наконечник, чтобы создать небольшое отверстие в медиальной коре проксимального отдела большеберцовой кости. Сделайте это отверстие примерно на 2 мм дистальнее коленного сустава в точке, равноудаленной между корой черепа и каудальной большеберцовой кости. Подбирайте размер иглы в зависимости от размера опухолевых фрагментов.
- С помощью стерильных щипцов подхватывайте и вставляйте опухолевые фрагменты в костномозговую полость проксимального отдела большеберцовой кости. Используйте иглу от 27 до 30 G, чтобы манипулировать фрагментом опухоли в медуллярный канал. В зависимости от размера опухолевых фрагментов имплантируйте минимум 0,5 мм3 общего объема опухоли в каждую большеберцовую кость. Для этого может потребоваться имплантация 1 или более опухолевых фрагментов в зависимости от размера созданных опухолевых фрагментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Модификации для предотвращения или ограничения смещения трансплантата за пределы кости будут заключаться в размещении костного воска или костного цемента в костном дефекте или гелевой пены или подкожного жирового трансплантата поверх отверстия в кости. - Нанесите на края кожи стерильный жидкий тканевый клей или один кожный шов. Не используйте зажимы для ран в этом месте. Будьте осторожны при использовании флуоресцентной визуализации в послеоперационном периоде, так как и тканевые клеи, и шов могут флуоресцировать.
- Восстановите мышей на грелке в отдельных клетках до амбулатории.
5. Последовательная и конечная оценка
- Анестезируйте мышей, используя изофлуран в кислородной анестезии, как описано ранее.
- Оценивайте рост опухоли большеберцовой кости неинвазивно с помощью еженедельной цифровой рентгенографии, биолюминесценции или флуоресцентной визуализации (при использовании клеток, экспрессирующих люциферазу или флуоресцентный репортерный ген). Измерения штангенциркуля конечности в месте имплантации также могут быть выполнены у бодрствующих мышей.
- В дополнение к традиционному мониторингу мышей с опухолями (масса тела, уровень активности, частота дыхания, уход, осанка, мышление и поведение) еженедельно наблюдайте за мышами на наличие признаков хромоты задних конечностей, отека и инфекции в области хирургического вмешательства.
- Следите за хирургической раной кожи в течение первых 10-14 дней на предмет чрезмерного покраснения, отека, дренажа и расхождения раны, пока кожная рана не заживет. Через 4-5 недель оценивают мышей в соответствии с оценкой результатов исследования либо живыми, либо после эвтаназии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Положительный результат будет связан с приживлением опухоли и прогрессирующим ростом опухоли с течением времени. В зависимости от типа опухоли внутрикостный рост опухоли может быть связан с прогрессирующей хромотой задних конечностей, но многие опухоли не вызывают хромоты, несмотря на признаки сопутствующего заболевания костей. Успешное приживление трансплантата было задокументировано с помощью расширенной визуализации, в результате чего наблюдались прогрессирующие рентгенологические, мКТ или мМРТ изменения проксимального отдела большеберцовой кости, связанные с фенотипом кости интересующей клеточной линии (остеолитическое, остеобластическое или смешанное остеолитическое/остеобластическое метастазирование) (рис. 1)8. В нашем предыдущем отчете дефект коры, созданный для имплантации опухолевого трансплантата, был виден в проксимальном отделе большеберцовой кости через 1 неделю после имплантации (рис. 1А). Ко 2-й неделе наблюдался видимый остеолиз и ремоделирование кости рядом с корковым дефектом. Со 2-й по 5-ю недели наблюдалось прогрессирующее разрушение кости и образование новой кости, связанной с приживлением и ростом опухоли (рис. 1B-E). Для клеточных линий с репортерными генами изменения кости будут сопровождаться увеличением результатов флуоресценции или биолюминесценции с течением времени. Острая хромота может быть показателем надвигающегося или фактического патологического перелома кости, что требует немедленной и тщательной рентгенологической оценки мыши и, возможно, раннего исключения из исследования. В зависимости от изучаемой линии опухолевых клеток разрушение кости может происходить быстро, задолго до метастазирования. Это имеет особое значение в исследованиях, связанных с первичными опухолями костей, поскольку мышей, возможно, придется исключить из исследования до развития клинически значимых метастазов, а именно в легкие. В этих случаях рекомендуется хирургическая ампутация опухоленосной конечности, чтобы можно было изучить минимальную остаточную болезнь и последующее метастазирование при использовании первичных опухолей кости, о чем мы сообщали ранее 4,8. Хотя полная ампутация задних конечностей у людей обычно не выполняется, это стандарт лечения в ветеринарии, из которых хорошо задокументировано сходство в клинических и молекулярных характеристиках остеосаркомы человека и собаки. Таким образом, ампутация задних конечностей у мышей актуальна для многих клеточных линий животных. Кроме того, ампутация является жизнеспособным методом лечения у мышей, поскольку процедуры сохранения конечностей, используемые у людей, недостижимы у мелких грызунов, таких как мыши. У мышей, несущих первичные опухоли костей, отсутствие аппетита, прогрессирующая потеря веса, общее плохое состояние тела и затрудненное дыхание (повышенная скорость или усилие) могут сигнализировать о развитии метастазов опухоли в легкие и другие органы. Для подтверждения метастазирования рекомендуется подтверждение с помощью биолюминесцентной визуализации, μCT или μMRI, и пораженные животные должны быть усыплены.
Отрицательный результат, скорее всего, возникший в результате отсутствия приживления опухоли, следует подозревать, если нет признаков прогрессирующих изменений (остеолитических, остеобластических или смешанных остеолитических / остеобластических поражений, в зависимости от исследуемой клеточной линии) при рентгенографии или мКТ-исследовании имплантированной большеберцовой кости. Для клеточных линий, несущих репортерные гены, отсутствие увеличения флуоресценции или биолюминесцентной сигнализации с течением времени с помощью оптической визуализации также подтверждает вывод о том, что опухоль не смогла прижиться. Отсутствие или плохое приживление трансплантата может быть связано с инфекцией в области хирургического вмешательства. Тем не менее, это будет проявляться специфическими клиническими признаками, такими как покраснение, отек или выделения, чаще всего в раннем послеоперационном периоде (первые 1-2 недели после операции). Животные потенциально также могут быть лихорадочными и демонстрировать отсутствие активности или сгорбленную осанку в раннем послеоперационном периоде из-за инфекции в области хирургического вмешательства. Забор и поддержание аллотрансплантатов в стерильных условиях во время подготовки и правильной стерильной подготовки конечности, стерильная интраоперационная техника и полное закрытие раны сведут к минимуму вероятность послеоперационного хирургического осложнения раны, приводящего к инфицированию и неудаче приживления опухоли.
В нашем предыдущем отчете8, при включении как пилотных, так и окончательных исследований, у 16 из 16 мышей (100%), имплантированных фрагменты остеосаркомы, прогрессировали до остеолитического поражения костей, а у 14 из этих 16 мышей (88%) развились метастазы. Все метастазы наблюдались в легких и диагностировались с помощью гистологии уже через 3 недели после имплантации8. У других животных, вскрытых через 1 (n=2) и 2 (n=2) недели после имплантации, не было выявлено каких-либо признаков метастазирования в легкие.
Рисунок 1: Серийная рентгенография. Серийная рентгенография (по порядку) проводится еженедельно через (A) 1, (B) 2, (C) 3, (D) 4 и (E) через 5 недель после интратибиальной имплантации аллотрансплантата подкожной опухоли с использованием первичной клеточной линии опухоли кости (остеосаркома). Со временем происходило прогрессирующее разрушение кости и образование новой кости, связанной с приживлением и ростом опухоли. Эта цифра была изменена с разрешения ref8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом отчете задокументирована наша модель создания первичных опухолей костей или метастазов в кости после интратибиальной имплантации опухолевого аллотрансплантата. Мы считаем, что в этом процессе есть несколько важных шагов. Безопасная плоскость анестетика должна быть установлена как для подкожной инъекции суспензии опухолевых клеток, так и для внутрибольшеберцового размещения полученных опухолевых фрагментов. Должна быть стерильная подготовка места операции как для удаления подкожного аллотрансплантата, так и для интрабольшеберного размещения аллотрансплантата. Фрагменты опухолевого аллотрансплантата должны быть созданы равномерно для последующей интратибиальной имплантации. Для имплантации опухолевых фрагментов следует создать дефект проксимального отдела большеберцовой кости соответствующего размера. Хирургическая рана кожи должна быть полностью закрыта, чтобы снизить риск послеоперационных раневых осложнений. Последний важный шаг заключается в том, что если внеклеточный матрикс используется как часть суспензии опухолевых клеток для подкожной инъекции, следует использовать рекомендованные производителем инструкции по обращению, чтобы избежать затвердевания суспензии перед инъекцией. Правильная стерильная подготовка конечности, стерильная интраоперационная техника и полное закрытие раны сведут к минимуму вероятность послеоперационного хирургического осложнения раны.
Особенности имплантированной опухоли и хирургической техники имеют решающее значение для успешных и воспроизводимых результатов для включения в вашу исследуемую популяцию. Первоначально следует убедиться, что опухолевый ксенотрансплантат/аллотрансплантат имплантируется непосредственно в медуллярную полость большеберцовой кости, убедившись, что опухолевая ткань полностью находится внутри кости. Модификации для предотвращения или ограничения смещения трансплантата за пределы кости первоначально будут заключаться в размещении костного воска или костного цемента в костном дефекте или либо гелевой пены, либо подкожного жирового трансплантата над отверстием в кости. Альтернативой может быть введение опухолевого аллотрансплантата через отверстие на латеральной стороне проксимального отдела большеберцовой кости, созданное под черепной большеберцовой мышцей. Наличие черепно-большеберцовой мышцы будет служить биологической оболочкой над дефектом кости, ограничивая потенциальное смещение опухолевого аллотрансплантата. Однако это более агрессивный хирургический подход с возможностью нервно-мышечной травмы на латеральной стороне проксимального отдела большеберцовой кости. Следует позаботиться о том, чтобы перед имплантацией опухолевые аллотрансплантаты были одинакового размера. При этом опухолевые аллотрансплантаты не должны превышать 1 мм в любом измерении, поскольку большие размеры опухоли в любой биологической системе с меньшей вероятностью приживутся, чем меньшие трансплантаты, когда во время имплантации к трансплантату не обеспечивается прямое, немедленное сосудистое снабжение. Мы сообщили об успешных результатах с конечным объемом имплантированной опухоли 0,5 мм3, но ожидаем, что комбинированные объемы фрагментов опухоли до 1мм3 позволят достичь успешных результатов. Однако максимальный объем имплантируемого опухолевого фрагмента не определен. По сравнению с криоконсервированной тканью, свежие опухолевые ксенотрансплантаты и аллотрансплантаты имеют больше шансов выжить, хотя мы не наблюдали проблем с практикой использования тщательно криоконсервированных опухолевых аллотрансплантатов. Замороженные аллотрансплантаты не следует имплантировать. Кроме того, рассечение капсулы и внешней части подкожной опухоли предотвратит любой вклад этого слоя опухоли, который в значительной степени является волокнистым и сосудистым со значительным иммунным инфильтратом, а не состоит в основном из собственно опухолевых клеток. Альтернативным методом создания опухолевых аллотрансплантатов из более крупной опухолевой массы непосредственно с помощью лезвия скальпеля является использование небольшой иглы для биопсии, которая создает цилиндрическое «ядро» опухоли, которое затем можно разрезать до заданной длины перед имплантацией. Использование иглы для биопсии или перфоратора для биопсии может быть полезным при создании однородных фрагментов опухоли для имплантации, поскольку после того, как в процессе биопсии были созданы два одинаковых размера (ширина и глубина), их можно обрезать до соответствующей длины до имплантации. Если репортерные гены, такие как люцифераза или флуоресцентные белки, используются в имплантированных опухолевых клетках, оценка опухолевых фрагментов во время имплантации или через 1 неделю после имплантации покажет относительный вклад опухолевых клеток в имплантированные опухолевые фрагменты, а также жизнеспособность.
Как и в случае с любой процедурой, существуют ограничения в дополнение к заявленным нами преимуществам этого метода. Метастазирование - это многоступенчатый процесс, который требует, чтобы клетка из своего первичного местоположения успешно выполняла инвазию и миграцию через внеклеточный матрикс, интравазировала кровоснабжение опухоли, выживала в кровообращении, пока она не достигнет своего конечного метастатического пункта назначения, экстравазировалась в собственно орган, а затем либо оставалась в спящем состоянии, либо размножалась, создавая метастатическое поражение. и модификация нормальной тканевой архитектуры, чтобы стать клинически обнаруживаемым метастазом18. Используемые в настоящее время мышиные модели метастазирования в кости в значительной степени основаны либо на прямой ортотопической инъекции опухолевых клеток в нормальное место первичной опухоли, либо на внутрисосудистой инъекции в левый желудочек сердца или периферически в хвостовые вены (боковые или дорсальные каудальные вены), либо на прямую внутрикостную инъекцию суспензии опухолевых клеток3. Тем не менее, недавние сообщения о попытках улучшить модели метастазов в кости пропагандируют инъекцию в подвздошные, каудальные или бедренные артерии 19,20,21. Все эти методы включают в себя один или несколько этапов в костном метастатическом каскаде, за исключением прямой внутрикостной инъекции или, в нашем случае, имплантации опухолевого аллотрансплантата, который моделирует только конечную модификацию ткани. Следовательно, это одно из неотъемлемых ограничений нашей техники. Дополнительным ограничением является то, что, как описано в настоящее время, это требует размножения аллотрансплантатов в промежуточном мыши-хозяине, что требует использования дополнительных мышей и приводит к имплантации опухоли, которая не является 100% чистыми опухолевыми клетками. Аллотрансплантат будет обладать некоторым стромальным вкладом, обеспечиваемым опухолями, растущими в подкожном месте. Потенциальной альтернативой для минимизации этого подкожного стромального вклада была бы инъекция клеток подкожно в биологический субстрат, такой как внеклеточный матрикс или каркас. В качестве альтернативы может быть выполнена ортотопическая инъекция в первичный участок опухоли с последующим удалением опухоли и подготовкой трансплантата.
Метод, описанный в этом отчете, имеет ключевые преимущества по сравнению с существующими методами моделирования первичных опухолей костей или метастазов в кости после прямой внутрикостной инъекции опухолевых клеток. Как уже говорилось, мы и другие наблюдали прямую эмболизацию легких и случайную немедленную смерть после интрабольшебиальной инъекции клеточной суспензии 8,13. Это происходит в результате инъекции опухолевых клеток под давлением в полость костного мозга, после чего опухолевые клетки попадают в периферическое кровоснабжение через сосудистые синусоиды костного мозга и переносятся в легкие венозным возвратом. Эти явления механистически сопоставимы с теми, которые наблюдаются при легочной или венозной тромбоэмболии, связанной с размещением имплантатов под давлением в полости костного мозга, связанной с тотальным эндопротезированием суставов у людей и животных. Мы и другие выдвигаем гипотезу, что это эмболическое явление в легких может быть специфичным для клеточной линии (неопубликованные наблюдения). Тем не менее, сообщалось об очень подробных шагах по ограничению образования этих эмболических артефактных метастазов12. Первоначально должна быть адекватная трипсинизация и создание однородной одноклеточной суспензии для инъекций, которую следует хранить на льду, чтобы предотвратить слипание клеток. Игла должна быть правильно помещена через проксимальную пластину роста большеберцовой кости, после чего следует выполнить небольшие объемы инъекций (~10 мкл) и инъекции без сопротивления в полость костного мозга. Несмотря на это, доставку опухолевых клеток в легкие, а также в другие органы можно легко наблюдать с помощью биолюминесцентной визуализации после внутрикостных и внутрисосудистых инъекций, что позволяет предположить, что клетки, генерирующие этот биолюминесцентный сигнал в легких и других органах, могут привести к отдаленным метастазам (неопубликованные наблюдения)3. Мы обнаружили, что еще одним преимуществом этого метода является то, что одна опухоль растет в однородном костном участке в исследуемой популяции, уменьшая изменчивость от животного к животному. Это позволяет создать единообразную исследуемую популяцию и готовое сравнение между группами лечения. Это контрастирует с метастазами в кости, которые развиваются после ортотопической или внутрисосудистой инъекции, когда клетки могут метастазировать в разные участки скелета и расти с разной кинетикой, что затрудняет сравнение между исследовательскими группами. Рост опухоли в одном анатомическом участке после имплантации наших опухолевых аллотрансплантатов также позволяет избежать возможности удаления мышей из-за метастазирования в другие системы органов или первичной опухолевой нагрузки, как это можно увидеть с помощью методов внутрисосудистых и ортотопических инъекций. Кроме того, мы наблюдали 100% приживление трансплантата после имплантации опухолевого аллотрансплантата, что поддерживает однородную исследуемую популяцию и позволяет избежать ненужного использования дополнительных мышей для достижения соответствующих размеров выборки. Это также преодолевает ограничение неполной и неточной инъекции после чрескожной инъекции суспензий опухолевых клеток в кость.
Этот метод обладает большой степенью универсальности, что привело к модификациям, которые в настоящее время используются в наших исследованиях, и имеет потенциал для большой полезности для будущих приложений. Первоначально, хотя мы используем проксимальный отдел большеберцовой кости в качестве места внутрикостной имплантации, можно легко использовать другие распространенные участки первичных опухолей кости или метастазов в кости, включая, помимо прочего, дистальный отдел бедренной кости и проксимальный отдел плечевой кости. Однако хирургический подход к этим участкам, а также к таким областям, как таз и позвоночник, требует постепенного более обширного хирургического подхода по сравнению с проксимальным отделом большеберцовой кости. Кроме того, такие участки, как таз, позвоночник, череп, лучевая кость и локтевая кость, не получают достаточного костного запаса для имплантации опухоли. При костно-инвазивных злокачественных новообразованиях, таких как опухоли полости рта, размещение опухолевых аллотрансплантатов рядом с костью или в ротоглотке также может повторять прогрессирование инвазивных опухолей 3,22. В экспериментах in vitro и in vivo часто используются методы совместного культивирования или совместной инъекции для определения влияния различных типов клеток на интересующий тип клеток. Таким образом, существует потенциал для одновременной инъекции двух или более типов клеток для создания подкожных опухолей, которые затем могут быть имплантированы в кость с использованием этой техники. Генетически модифицированные клетки могут использоваться отдельно или в сочетании с другими нормальными или генетически модифицированными клетками для создания опухолевых аллотрансплантатов. С ростом интереса к прецизионной медицине и созданию моделей рака человека in vitro и in vivo набирает популярность трансплантация ксенотрансплантата мышам. Недавно была описана модель метастазирования рака молочной железы в кости, где ксенотрансплантаты, полученные от пациентов, имплантированные ортотопически метастазировали в костные диски человека, имплантированные подкожно обнаженным мышам23. Исходя из этого, ксенотрансплантаты, полученные от пациентов, могут быть непосредственно имплантированы в кость с использованием нашей модели, без необходимости в промежуточном хозяине для подкожного распространения. Это позволило бы быстро оценить кинетику опухоли и возможность оценить несколько комбинаций лечения, потенциально из биопсии одного пациента, не требуя большой опухолевой массы для подготовки аллотрансплантата. Растущее использование органоидов в исследованиях рака также может быть использовано в нашей модели24. Для этого потребуется введение иглой или пипеткой этих клеточных агрегатов через отверстие в коре большеберцовой кости. Поэтому мы рекомендуем герметизировать дефект коры головного мозга (как обсуждалось выше), чтобы ограничить возможность миграции органоидов за пределы полости кости и костного мозга. Как мы уже делали, клетки могут быть помечены и отслежены с помощью оптической (биолюминесценция или флуоресценция) или расширенной (цифровая рентгенография, мкКТ или мМРТ) визуализации, позволяющей оценить рост опухоли с течением времени. Это также имеет то преимущество, что сводит к минимуму количество животных, поскольку одни и те же животные изображаются с течением времени.
Таким образом, этот отчет демонстрирует нашу технику моделирования первичных опухолей костей и метастазов в кости с использованием имплантации трансплантата солидной опухоли в кость.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Доктор Хилдрет финансировался NIH под номером премии K01OD026527. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения NIH.
Acknowledgments
Авторы признают решающий вклад доктора Бет Чаффи, DVM, PhD, DACVP в развитие этой техники.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
References
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
- Simmons, J. K., et al.
- Wolfe, T. D., et al. Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- James, J. J., et al. metastases from breast carcinoma: histopathological - radiological correlations and prognostic features. British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Chaffee, B. K., Allen, M. J. A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis. In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).
- Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma. Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).
- Huang, X., et al. Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study. Journal of Bone Oncology. 16, 100230 (2019).
- Li, W., Zhang, S. Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases. Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
- Maloney, C., et al. Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model. Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
- Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis. BoneKey Reports. 5, 777 (2016).
- Marques da Costa, M. E., et al. Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice. Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).
- Raheem, O., et al. A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions. Journal of Translational Medicine. 9, 185 (2011).
- Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma. Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Yu, C., et al. Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (115), e53982 (2016).
- Kuchimaru, T., et al. A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries. Nature Communications. 9 (1), 2981 (2018).
- Haley, H. R., et al. Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice. Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).
- Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma. Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).
- Lefley, D., et al. Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts. Breast Cancer Research. 21 (1), 130 (2019).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
