Summary
अस्थि मेटास्टेसिस मॉडल समान रूप से या 100% घटनाओं के साथ मेटास्टेसिस विकसित नहीं करते हैं। प्रत्यक्ष इंट्रा-ओसेस ट्यूमर सेल इंजेक्शन के परिणामस्वरूप फेफड़ों का एम्बोलाइजेशन हो सकता है। हम हड्डी में ठोस ट्यूमर ग्राफ्ट प्रत्यारोपण का उपयोग करके प्राथमिक हड्डी ट्यूमर और हड्डी मेटास्टेसिस मॉडलिंग की हमारी तकनीक प्रस्तुत करते हैं, जिससे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एनग्राफमेंट और विकास होता है।
Abstract
ठोस ट्यूमर से प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर या हड्डी मेटास्टेसिस के परिणामस्वरूप दर्दनाक ओस्टियोलाइटिक, ओस्टियोब्लास्टिक या मिश्रित ओस्टियोलाइटिक / ओस्टियोब्लास्टिक घाव होते हैं। ये घाव हड्डी की संरचना से समझौता करते हैं, पैथोलॉजिकल फ्रैक्चर के जोखिम को बढ़ाते हैं, और रोगियों को सीमित उपचार विकल्पों के साथ छोड़ देते हैं। प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर दूर के अंगों में मेटास्टेसाइज करते हैं, कुछ प्रकार अन्य कंकाल साइटों में फैलने में सक्षम होते हैं। हालांकि, हाल के सबूत बताते हैं कि कई ठोस ट्यूमर के साथ, हड्डी में फैलने वाली कैंसर कोशिकाएं कोशिकाओं का प्राथमिक स्रोत हो सकती हैं जो अंततः अन्य अंग प्रणालियों में मेटास्टेसाइज करती हैं। प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर के अधिकांश सिंजेनिक या जेनोग्राफ्ट माउस मॉडल में ट्यूमर सेल निलंबन के इंट्रा-ओसेस (ऑर्थोटोपिक) इंजेक्शन शामिल हैं। ठोस ट्यूमर से कंकाल मेटास्टेसिस के कुछ पशु मॉडल भी प्रत्यक्ष हड्डी इंजेक्शन पर निर्भर करते हैं, जबकि अन्य कोशिकाओं को इंट्रावास्कुलर रूप से या प्राथमिक ट्यूमर के अंग में इंजेक्ट करके हड्डी मेटास्टैटिक कैस्केड के अतिरिक्त चरणों को पुन: उत्पन्न करने का प्रयास करते हैं। हालांकि, इनमें से कोई भी मॉडल हड्डी मेटास्टेसिस को मज़बूती से या 100% की घटना के साथ विकसित नहीं करता है। इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंट्रा-ओसेस इंजेक्शन को फेफड़ों के संभावित ट्यूमर एम्बोलाइजेशन से जुड़ा हुआ दिखाया गया है। ये एम्बोलिक ट्यूमर कोशिकाएं एनग्राफ्ट करती हैं लेकिन मेटास्टैटिक कैस्केड को पुन: उत्पन्न नहीं करती हैं। हमने ओस्टियोसारकोमा के एक माउस मॉडल की सूचना दी जिसमें ताजा या क्रायोसंरक्षित ट्यूमर के टुकड़े (ट्यूमर कोशिकाओं और स्ट्रोमा से मिलकर) को न्यूनतम इनवेसिव सर्जिकल तकनीक का उपयोग करके सीधे समीपस्थ टिबिया में प्रत्यारोपित किया जाता है। इन जानवरों ने प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एन्ग्राफ्टमेंट, विकास और, समय के साथ, ऑस्टियोलिसिस और फेफड़ों के मेटास्टेसिस को विकसित किया। इस तकनीक में ठोस ट्यूमर हड्डी मेटास्टेसिस को मॉडल करने के लिए उपयोग की जाने वाली बहुमुखी प्रतिभा है और आसानी से एक या कई सेल प्रकारों, आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं, रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स और / या लेबल कोशिकाओं से युक्त ग्राफ्ट को नियोजित कर सकती है जिन्हें ऑप्टिकल या उन्नत इमेजिंग द्वारा ट्रैक किया जा सकता है। यहां, हम इस तकनीक का प्रदर्शन करते हैं, हड्डी में ठोस ट्यूमर ग्राफ्ट प्रत्यारोपण का उपयोग करके प्राथमिक हड्डी ट्यूमर और हड्डी मेटास्टेसिस मॉडलिंग करते हैं।
Introduction
मानव और पशु रोग के माउस मॉडल जैव चिकित्सा अनुसंधान में तेजी से लोकप्रिय हो रहे हैं। इस संदर्भ में चूहों का उपयोग करने की उपयोगिता यह है कि उनकी शारीरिक रचना और शरीर विज्ञान मनुष्यों के समान हैं। परिपक्वता प्राप्त करने के लिए प्रसवोत्तर जीवन में उनके पास अपेक्षाकृत कम गर्भधारण अवधि और समय होता है, और बड़े पैमाने पर अपेक्षाकृत कम लागत और आवास की आसानी से जुड़े होते हैं, हालांकि विकास या खरीद की बढ़ती लागत आनुवंशिक संशोधन, इम्यूनोडेफिशिएंसी और / या मानवीकरण की अधिक डिग्री से जुड़ी होतीहै। इनब्रेड उपभेदों के उपयोग से अध्ययन समावेश से पहले बड़े पैमाने पर एक समान पशु आबादी होती है। उनके जीनोम का एक पूर्ण ज्ञान मनुष्यों के लिए समानता की एक उच्च डिग्री का सुझाव देता है। माउस जीनोम में कई रोग प्रक्रियाओं के लिए ऑर्थोलॉगस आणविक लक्ष्यों की पहचान की गई है और अब माउस-विशिष्ट अभिकर्मकों का एक व्यापक पुस्तकालय है जो आसानी से उपलब्ध हैं। इसलिए, वे बड़े पशु मॉडल1 की तुलना में अपेक्षाकृत उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए अधिक तेजी से और कम खर्चीले तरीके से अवसर प्रदान करते हैं। इसके अलावा, आनुवंशिक संपादन रणनीतियों के आगमन के साथ जो विश्व स्तर पर या सेल प्रकार विशिष्ट तरीके से और / या संवैधानिक रूप से या इंड्यूसेबल तरीके से कुछ जीनों के ओवरएक्प्रेशन या विलोपन की अनुमति देता है, वे मानव औरपशु रोगों की जांच के लिए एक बहुत ही जैविक रूप से उपयोगी मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं।
कैंसर एक ऐसा क्षेत्र है जिसमें माउस मॉडल की बहुत उपयोगिता है। कैंसर के आनुवंशिक माउस मॉडल ऑन्कोजेनिक परिवर्तन से गुजरने के लिए कोशिकाओं के लिए अकेले या संयोजन में ऑन्कोजीन या ट्यूमर शमन जीन की अभिव्यक्ति के मॉड्यूलेशन पर निर्भर करते हैं। चूहों में प्राथमिक या स्थापित ट्यूमर सेल लाइनों का इंजेक्शन भी किया जाता है। चूहों सहित मनुष्यों या अन्य जानवरों की प्रजातियों से सेल लाइनों या ऊतकों की शुरूआत, विवो में कैंसर का सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल बना हुआ है। इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों में असमान प्रजातियों (जेनोग्राफ्ट्स) से कोशिकाओं और ऊतकों का उपयोग सबसेअधिक किया जाता है। हालांकि, एलोग्राफ्ट ट्यूमर कोशिकाओं या ऊतकों का उपयोग जहां मेजबान और प्राप्तकर्ता दोनों एक ही प्रजाति के होते हैं, सिंजेनिक सिस्टम3 में एक ही मेजबान माउस तनाव के साथ संयुक्त होने पर एक बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ बातचीत की अनुमति देता है।
ठोस ट्यूमर से प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर या हड्डी मेटास्टेसिस के परिणामस्वरूप दर्दनाक ओस्टियोलाइटिक, ओस्टियोब्लास्टिक, या मिश्रित ओस्टियोलाइटिक / ओस्टियोब्लास्टिक घावहोते हैं। ये ट्यूमर हड्डी की संरचना से समझौता करते हैं, जिससे पैथोलॉजिकल फ्रैक्चर का खतरा बढ़ जाता है, और रोगियों को सीमित उपचार विकल्पों के साथ छोड़ दिया जाता है। प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर दूर के अंगों में मेटास्टेसाइज करते हैं, कुछ प्रकार अन्य कंकाल साइटों में फैलने में सक्षम होते हैं। स्तन कैंसर के रोगियों में, हड्डी पहले मेटास्टेसिस की सबसे आम साइट है और मेटास्टैटिक रोग 5,6 की प्रस्तुति की सबसे लगातार पहली साइट है। इसके अलावा, प्रसारित ट्यूमर कोशिकाएं (डीटीसी) अन्य अंगों में मेटास्टेसिस के निदान से पहले अस्थि मज्जा में मौजूद होती हैं, और भविष्यवाणीकरती हैं। इसलिए, यह माना जाता है कि हड्डी में मौजूद कैंसर कोशिकाएं कोशिकाओं का स्रोत हैं जो अंततः अन्य अंग प्रणालियों में मेटास्टेसाइज करती हैं। ठोस ट्यूमर मेटास्टेसिस के कई माउस मॉडल मौजूद हैं जो मुख्य रूप से फेफड़ों और लिम्फ नोड्स में मेटास्टेसिस विकसित करते हैं, और ट्यूमर प्रकार और इंजेक्शन तकनीक के आधार पर, संभावित रूप से अन्य अंग प्रणालियां3। हालांकि, हड्डी मेटास्टेसिस के माउस मॉडल की कमी है जो निर्भर रूप से, साइट विशिष्ट कंकाल मेटास्टेसिस का उत्पादन करते हैं और चूहों को प्राथमिक ट्यूमर के बोझ या मेटास्टेसिस से अन्य अंगों में प्रारंभिक हटाने के मानदंड तक पहुंचने से पहले हड्डी मेटास्टेसिस विकसित करते हैं। हमने प्राथमिक हड्डी ट्यूमर ओस्टियोसारकोमा के एक मॉडल की सूचना दी हैजो चूहों के समीपस्थ टिबिया में एक ठोस ट्यूमर के सर्जिकल आरोपण पर निर्भर करता है। 100% चूहों में हड्डी के ट्यूमर का गठन हुआ और 88% ने फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस विकसित किया। मेटास्टेसिस की यह घटना आमतौर पर लोगों (~ 20-50%) में चिकित्सकीय रूप से रिपोर्ट की जाती है, लेकिन बहुत रुचि है क्योंकि फेफड़े ओस्टियोसारकोमा 9,10,11 के लिए मेटास्टेसिस की सबसे आम साइट है। जबकि यह मॉडल प्राथमिक हड्डी ट्यूमर मॉडलिंग में फायदेमंद है, यह अन्य ऑस्टियोट्रोपिक ठोस ट्यूमर जैसे स्तन, फेफड़े, प्रोस्टेट, थायरॉयड, यकृत, गुर्दे और जठरांत्र संबंधी ट्यूमर से हड्डी मेटास्टेसिस मॉडलिंग में भी बहुत उपयोगिता है।
इस मॉडल के विकास के लिए तर्क यह था कि प्राथमिक हड्डी ट्यूमर या हड्डी मेटास्टेसिस12 को मॉडल करने के लिए आमतौर पर समीपस्थ टिबिया या डिस्टल फीमर में पारंपरिक इंट्रा-ओसेस इंजेक्शन का विकल्प विकसित किया जाए। हमारा प्राथमिक लक्ष्य इस तकनीक की एक ज्ञात सीमा को कम करना था यानी, फेफड़ों का ट्यूमर एम्बोलाइजेशन। इसके परिणामस्वरूप इन एम्बोलिक ट्यूमर कोशिकाओं और "कृत्रिम मेटास्टेसिस" का उन्मूलन होता है जो एक स्थापित प्राथमिक हड्डी ट्यूमर से पूर्ण मेटास्टैटिक कैस्केड को पुन: उत्पन्न नहीं करते हैं जो फेफड़ों में मेटास्टेसाइज करता है 8,13. यह वह स्थिति भी होगी जब एक स्थापित हड्डी मेटास्टेसिस एक दूर की साइट पर फैलता है। इसके अलावा, इस तकनीक को हड्डी मेटास्टेसिस के एक मॉडल का उत्पादन करने के लिए भी विकसित किया गया था जो ऑर्थोटोपिक या इंट्रावस्कुलर इंजेक्शन तकनीकों की तुलना में हड्डी में और एक समान साइट पर ट्यूमर के एन्ग्राफमेंट और विकास की अधिक घटना सुनिश्चित करेगा। इस मॉडल में इन वर्णित तकनीकों पर अलग-अलग फायदे हैं। इस मॉडल में हड्डी में ट्यूमर कोशिकाओं का नियंत्रित, सुसंगत वितरण शामिल है। यह, फुफ्फुसीय एम्बोलाइजेशन के बाद कृत्रिम फेफड़ों के मेटास्टेसिस से भी बचता है और एक आधारभूत समान अध्ययन आबादी स्थापित करता है। प्राथमिक ट्यूमर या मेटास्टेसिस से अन्य अंगों को होने वाले प्रारंभिक निष्कासन मानदंडों के जोखिम के बिना इस मॉडल के साथ साइट-विशिष्ट ट्यूमर का लाभ है। अंत में, इस मॉडल में संशोधन के लिए बहुत उपयोगिता है, जिसमें रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स का उपयोग भी शामिल है।
प्रस्तुत मॉडल में शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण के बाद हड्डी में सेल निलंबन इंजेक्शन को निर्देशित करने के लिए समानताएं हैं, जिसके बाद कॉर्टेक्स के माध्यम से इंजेक्शन या कॉर्टेक्स में एक छोटा दोष बनाने के बाद मज्जा गुहा में डिलीवरी (मज्जा गुहा के साथ या बिना) 8,14,15,16,17।. हालांकि, एक ट्यूमर एलोग्राफ्ट का आरोपण इस तकनीक को स्पष्ट रूप से अलग बनाता है। इसलिए, इस रिपोर्ट का उद्देश्य ठोस ट्यूमर से प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर और हड्डी मेटास्टेसिस के इस मॉडल को प्रदर्शित करना था, जो पहले वर्णित मॉडल की कई सीमाओं को दूर करता है। सेल कल्चर, माउस मॉडल, माउस एनेस्थीसिया और सर्जरी, और माउस एनाटॉमी में अनुभव के साथ अनुसंधान समूह चूहों में प्राथमिक हड्डी ट्यूमर या हड्डी मेटास्टेसिस को मॉडल करने के लिए हमारी तकनीक को पुन: पेश करने के लिए अच्छी तरह से सुसज्जित हैं।
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Protocol
सभी वर्णित पशु प्रयोगों को कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय, कैम्ब्रिज, यूके की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. सेल लाइनों की तैयारी
- चूहों में पारंपरिक सेल कल्चर या इंजेक्शन के लिए प्रयोगशाला के मानक सेल कल्चर प्रोटोकॉल के अनुसार सेल लाइनों को विकसित करें। यहां उपयोग किए जाने वाले मानक प्रोटोकॉल डलबेकको के संशोधित ईगल के माध्यम में वृद्धि हैं जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), एल-ग्लूटामाइन और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (इसके बाद पूर्ण विकास माध्यम के रूप में जाना जाता है) होता है।
नोट: इस प्रयोग में, अब्राम ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं का उपयोग बाल्ब / सी फॉक्सएन 1 एनयू / एनयू चूहों में किया जाता है। स्तन कैंसर के अध्ययन के लिए, बाल्ब / सी चूहों में 4 टी 1 कोशिकाओं और सी 57बीएल / 6 चूहों में ईओ 771 कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है। - 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर वेंट टिशू कल्चर फ्लास्क या 6-वेल टिशू कल्चर प्लेटों में कोशिकाओं को विकसित करें।
- रुचि की सेल लाइन को पारित करें और कोशिकाओं को इंजेक्शन के लिए तैयार करें जब कोशिकाएं चूहों में इन कोशिकाओं के इंजेक्शन के साथ आमतौर पर उपयोग की जाने वाली एक कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं।
2. जानवर
- चमड़े के नीचे ट्यूमर उत्पादन के लिए कम से कम 6-8 सप्ताह की उम्र के बाल्ब / सी फॉक्सएन 1 एनयू / एनयू चूहों का उपयोग करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि जानवर तेजी से विकास चरण से परे हैं और वयस्कता और कंकाल परिपक्वता प्राप्त कर चुके हैं।
- नर या मादा चूहों का उपयोग करें। हार्मोन-उत्तरदायी सेल लाइनों का चयन करते समय अपवाद बनाएं (उदाहरण के लिए, महिला चूहों में स्तन कैंसर कोशिकाएं और पुरुष चूहों में प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाएं)।
- जेनोग्राफ्ट प्रयोगों के लिए, सामान्य परिस्थितियों में एक बरकरार माउस प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ असंगत सेल लाइन के आधार पर इम्यूनोडेफिशिएंसी एथिमिक नग्न चूहों का उपयोग करें।
- मुराइन सेल लाइनों का उपयोग करके एलोग्राफ्ट प्रयोगों के लिए, यह असमान माउस आनुवंशिक और प्रतिरक्षा पृष्ठभूमि के आधार पर भी अनुशंसित है। हालांकि, सिंजेनिक प्रयोगों के लिए, सेल लाइन ऑफ इंटरेस्ट के समान तनाव के जानवरों का उपयोग करें।
- संस्थान की पशुपालन नीतियों के आधार पर मानक घनत्व पर घर के जानवर।
3. चमड़े के नीचे ट्यूमर
- ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा कल्चर से सेल लाइनों की कटाई करें और बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (पीबीएस) में पुन: निलंबित करें।
- सेल व्यवहार्यता का आकलन करें और ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण विधि द्वारा सेल घनत्व निर्धारित करें। कोशिकाओं की गिनती के लिए हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करें। चमड़े के नीचे के ट्यूमर बनाने के लिए चूहों में इंजेक्शन के लिए 90% की न्यूनतम सेल व्यवहार्यता का उपयोग किया जाना है।
- बाँझ पीबीएस के 0.1 से 0.15 एमएल (100 से 150 μL) की अंतिम मात्रा में 1-2 x 105 कोशिकाओं को इंजेक्ट करने के लिए सेल घनत्व को समायोजित करें। इंजेक्शन तक कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
- वैकल्पिक रूप से, 5 मिनट के लिए 800 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके पेलेट कोशिकाएं। सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और 0.1 से 0.15 एमएल (100 से 150 μL) की अंतिम मात्रा में 1-2 x 105 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए अघुलनशील बाँझ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम में पेलेट कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को आगे के उपयोग तक बर्फ पर रखें।
- ऑक्सीजन एनेस्थीसिया में आइसोफ्लुरेन के साथ चमड़े के नीचे ट्यूमर के विकास के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहों को एनेस्थेटाइज करें। 2 एल/मिन ऑक्सीजन में 5% आइसोफ्लुरेन की इंडक्शन डोज और 2 एल/मिन ऑक्सीजन में 2-3% आइसोफ्लुरेन की रखरखाव खुराक का उपयोग करें। आगे बढ़ने से पहले पलक झपकने या पेडल रिफ्लेक्सिस की कमी की जांच करें।
नोट: आइसोफ्लूरेन एक इनहेलेशनल एनेस्थेटिक है। उचित मैला ढोने और मुक्त गैस संग्रह प्रणालियों के साथ एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में आइसोफ्लुरेन का उपयोग करें। एनेस्थीसिया प्रेरण, रखरखाव और निगरानी के लिए एक योजना विकसित करने के लिए संस्थागत पशु चिकित्सा कर्मचारियों के साथ परामर्श करें, और सुनिश्चित करें कि प्रयोगशाला के कर्मचारियों को संज्ञाहरण निगरानी और इनहेलेंट एनेस्थेटिक एजेंटों की हैंडलिंग में उचित प्रशिक्षण है। - एनेस्थेटाइज्ड चूहों के वक्ष या पेट के पृष्ठीय क्षेत्र से बालों को डिपिलेटिंग घोल के साथ या इलेक्ट्रिक क्लिपर के साथ हटा दें। त्वचा को संभावित आघात को कम करने के लिए डिपिलेटिंग समाधान को प्राथमिकता दी जाती है। एथिमिक नग्न चूहों का उपयोग करते समय इस चरण को छोड़ दें।
- सेल निलंबन के इंजेक्शन से पहले तैयार क्षेत्र को 70% इथेनॉल स्वैब के साथ साफ करें।
- वक्ष या पेट के पृष्ठीय क्षेत्र पर कोशिकाओं को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करने के लिए 27 ग्राम सुई के साथ 1 एमएल ट्यूबरकुलिन सिरिंज का उपयोग करें, कंधे के ब्लेड के आंदोलन से प्रभावित न हों। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बाह्य मैट्रिक्स में निलंबन के रूप में चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बाह्य मैट्रिक्स में इंजेक्शन चमड़े के नीचे के स्थान में सेल निलंबन के प्रवास को सीमित करेगा क्योंकि ये मैट्रिक्स कमरे के तापमान पर जम जाते हैं। - एम्बुलेटरी तक अलग-अलग पिंजरों में हीटिंग पैड पर चूहों को पुनर्प्राप्त करें। चूहों को तब साफ, सूखे बिस्तर के साथ अपने सामान्य पिंजरों में रखा जा सकता है।
- पृष्ठीय वक्ष या पेट के ऊपर चमड़े के नीचे के ट्यूमर के आकार की निगरानी एक कैलिपर के साथ करें और यह सुनिश्चित करने के लिए साप्ताहिक रूप से शरीर के वजन को मापें कि चमड़े के नीचे के ट्यूमर अल्सर नहीं करते हैं या चूहे संस्थानों की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा स्थापित प्रारंभिक निष्कासन मानदंडों को पूरा करते हैं। त्वचा के अल्सर या केंद्रीय ट्यूमर नेक्रोसिस के जोखिम को कम करने के लिए किसी भी आयाम में 15 मिमी के अधिकतम ट्यूमर आकार की सिफारिश की जाती है।
नोट: अधिकतम अनुमेय ट्यूमर आकार / मात्रा निर्धारित करने के लिए स्थानीय दिशानिर्देशों से परामर्श करें। - सीओ2 इनहेलेशन द्वारा तीन से चार सप्ताह के बाद चमड़े के नीचे के ट्यूमर वाले चूहों को इच्छामृत्यु दें, जिसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था होती है। माउस इच्छामृत्यु के लिए संस्थान की स्वीकार्य नीतियों का पालन करें।
- सड़न रोकनेवाला शल्य चिकित्सा तकनीक का उपयोग करके चमड़े के नीचे के ट्यूमर की कटाई। बालों को हटाने के बाद 70% इथेनॉल के साथ ट्यूमर के ऊपर की त्वचा को पहले की तरह बाँझ करें (यदि लागू हो)। # 15 स्केलपेल ब्लेड (स्केलपेल ब्लेड हैंडल के साथ या बिना) के साथ ट्यूमर के ऊपर की त्वचा के माध्यम से इंजेक्शन लगाएं। बाँझ सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी के साथ आसपास के जुड़े नरम ऊतकों से ट्यूमर को तेजी से विच्छेदित करें।
- ट्यूमर को 6-वेल टिशू कल्चर प्लेटों में रखें जिसमें पूर्ण विकास माध्यम होता है और पूर्व-निर्धारित आकार (~ 0.6 मिमी x 0.6 मिमी x 0.6 मिमी x 0.6 मिमी - 0.25 मिमी3 तक 1 मिमी x 1 मिमी x 1 मिमी -1 मिमी 3) के कई छोटे टुकड़ों में कीमा होता है, जिसमें # 15 स्केलपेल ब्लेड (स्केलपेल ब्लेड हैंडल के साथ या बिना) होता है।
- इंट्राटिबियल आरोपण के समय तक कमरे के तापमान पर बाँझ पूर्ण विकास माध्यम में ट्यूमर के टुकड़े बनाए रखें। ल्यूसिफेरस या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन ले जाने वाली सेल लाइनों के लिए, चूहों में इंट्राटिबियल प्रत्यारोपण से पहले ट्यूमर व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए एक्स-विवो बायोल्यूमिनेसेंट या फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग करें।
- क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए, 20% एफबीएस और 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के साथ पूरक पूर्ण विकास माध्यम में एक ही क्रायोवियल में कई टुकड़े रखें। -80 डिग्री सेल्सियस पर एक वाणिज्यिक क्रायोप्रिजर्वेशन सिस्टम का उपयोग करके धीरे-धीरे फ्रीज करें और तरल नाइट्रोजन में दीर्घकालिक स्टोर करें। बाद के विश्लेषण के लिए ट्यूमर के टुकड़ों को संरक्षित करें, लेकिन भविष्य के आरोपण के लिए नहीं, तरल नाइट्रोजन विसर्जन का उपयोग करके स्नैप फ्रीजिंग द्वारा। इन जमे हुए ट्यूमर के टुकड़ों को -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक स्टोर करें।
नोट: यह पहले बताया गया है कि स्नैप जमे हुए ट्यूमर विवो8 में नहीं बढ़ेंगे और बढ़ेंगे।
4. चमड़े के नीचे ट्यूमर के टुकड़ों का सर्जिकल आरोपण।
- सर्जिकल प्रत्यारोपण से पहले पूर्ण विकास माध्यम में चमड़े के नीचे के ट्यूमर के ताजा या क्रायोसंरक्षित टुकड़े कमरे के तापमान पर लाएं।
- धारा 3 में वर्णित ऑक्सीजन संज्ञाहरण में आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके रुचि के तनाव के चूहों को एनेस्थेटाइज करें। आगे बढ़ने से पहले पेडल रिफ्लेक्सिस की कमी की जांच करें। पेरी-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया प्रदान करने के लिए 0.02-0.05 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक पर चमड़े के नीचे ब्यूप्रेनोर्फिन का प्रशासन करें। यदि आवश्यक हो, तो पोस्ट-ऑपरेटिव अवधि में हर 6-8 घंटे में इसे दोहराया जा सकता है।
- त्वचा को संभावित आघात को कम करने के लिए डिपिलेटिंग घोल के साथ दाहिने घुटने के जोड़ और हिंदलिम्ब के समीपस्थ टिबिया पर बालों को हटा दें।
- सर्जिकल एंटीसेप्टिक के साथ तैयार क्षेत्र को स्क्रब करें। पहले 70% इथेनॉल स्वैब के साथ स्क्रब करें और फिर वैकल्पिक क्लोरहेक्सिडिन और सलाइन स्क्रब से स्क्रब करें।
- समीपस्थ टिबिया को घुटने के जोड़ से दूर के क्षेत्र के रूप में कल्पना करें, जबकि जोड़ को फ्लेक्स और विस्तारित करते हैं।
- # 15 स्केलपेल ब्लेड (स्केलपेल ब्लेड हैंडल के साथ या बिना) के साथ अंग के मध्यवर्ती पहलू पर समीपस्थ टिबिया के स्तर पर 3-4 मिमी चीरा बनाएं। समीपस्थ टिबिया के मध्यवर्ती कॉर्टेक्स को उजागर करने के लिए त्वचा और चमड़े के नीचे के ऊतक के माध्यम से इंजेक्शन लगाएं।
- समीपस्थ टिबिया के मेडियल कॉर्टेक्स में एक छोटा छेद बनाने के लिए, 25 ग्राम सुई की नोक के साथ कोमल दबाव लागू करें, जबकि टिप को भी घुमाएं। इस छेद को कपाल और पुच्छल टिबियल कॉर्टेक्स के बीच समान दूरी पर घुटने के जोड़ से लगभग 2 मिमी दूर बनाएं। ट्यूमर के टुकड़ों के आकार के आधार पर सुई के आकार का चयन करें।
- समीपस्थ टिबिया के मज्जा गुहा में ट्यूमर के टुकड़ों को उठाने और डालने के लिए बाँझ बल का उपयोग करें। मज्जा नहर में ट्यूमर के टुकड़े को हेरफेर करने के लिए 27 से 30 ग्राम सुई का उपयोग करें। ट्यूमर के टुकड़ों के आकार के आधार पर, प्रत्येक टिबिया में न्यूनतम 0.5 मिमी3 कुल ट्यूमर की मात्रा प्रत्यारोपित करें। इसके लिए बनाए गए ट्यूमर के टुकड़ों के आकार के आधार पर 1 या अधिक ट्यूमर के टुकड़ों के आरोपण की आवश्यकता हो सकती है।
नोट: हड्डी के बाहर ग्राफ्ट के विस्थापन को रोकने या सीमित करने के लिए संशोधन हड्डी दोष में हड्डी के मोम या हड्डी सीमेंट का प्लेसमेंट या तो जेल फोम या हड्डी में छेद पर चमड़े के नीचे वसा ग्राफ्ट होगा। - त्वचा के किनारों को बाँझ तरल ऊतक चिपकने वाला या एकल त्वचा सीवन के साथ मिलाएं। इस साइट में घाव क्लिप का उपयोग न करें। पोस्ट-ऑपरेटिव अवधि में फ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करते समय सावधानी बरतें, क्योंकि ऊतक चिपकने वाला और सीवन दोनों में फ्लोरेसिस की क्षमता होती है।
- एम्बुलेटरी तक अलग-अलग पिंजरों में हीटिंग पैड पर चूहों को पुनर्प्राप्त करें।
5. सीरियल और अंतिम बिंदु मूल्यांकन
- ऑक्सीजन एनेस्थीसिया में आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें जैसा कि पहले वर्णित है।
- साप्ताहिक डिजिटल रेडियोग्राफी, बायोल्यूमिनेसेंस, या फ्लोरेसेंस इमेजिंग (यदि ल्यूसिफेरस या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का उपयोग करके) द्वारा टिबियल ट्यूमर के विकास का मूल्यांकन गैर-आक्रामक रूप से करें। आरोपण स्थल पर अंग का कैलिपर माप जागृत चूहों में भी किया जा सकता है।
- ट्यूमर-असर चूहों (शरीर का वजन, गतिविधि स्तर, श्वसन दर, संवारने, मुद्रा, मेंटेशन और व्यवहार) की पारंपरिक निगरानी के अलावा, पिछले अंग लंगड़ापन, सूजन और सर्जिकल साइट संक्रमण के संकेतों के लिए साप्ताहिक चूहों की निगरानी करें।
- अत्यधिक लालिमा, सूजन, सूखा और घाव की विकृति के लिए पहले 10-14 दिनों के लिए त्वचा सर्जिकल घाव की निगरानी करें जब तक कि त्वचा का घाव ठीक न हो जाए। 4-5 सप्ताह के बाद, अध्ययन परिणाम मूल्यांकन के अनुसार चूहों का मूल्यांकन या तो जीवित या इच्छामृत्यु के बाद करें।
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Representative Results
एक सकारात्मक परिणाम समय के साथ ट्यूमर एनग्राफमेंट और प्रगतिशील ट्यूमर के विकास से जुड़ा होगा। ट्यूमर के प्रकार के आधार पर, इंट्राओसियस ट्यूमर की वृद्धि प्रगतिशील हिंद अंग लंगड़ापन से जुड़ी हो सकती है, लेकिन कई ट्यूमर परिचर हड्डी रोग के संकेतों के बावजूद लंगड़ापन का कारण नहीं बनते हैं। उन्नत इमेजिंग के साथ सफल एन्ग्राफमेंट का दस्तावेजीकरण किया गया था, जिससे सेल लाइन ऑफ इंटरेस्ट (ओस्टियोलाइटिक, ओस्टियोब्लास्टिक, या मिश्रित ओस्टियोलाइटिक / ओस्टियोब्लास्टिक मेटास्टेसिस) के हड्डी फेनोटाइप से जुड़े समीपस्थ टिबिया में प्रगतिशील रेडियोग्राफिक, μCT, या μMRI परिवर्तन होंगे (चित्रा 1)8)। हमारी पिछली रिपोर्ट में, ट्यूमर ग्राफ्ट प्रत्यारोपण के लिए बनाया गया कॉर्टिकल दोष आरोपण के 1 सप्ताह बाद समीपस्थ टिबिया में दिखाई दे रहा था (चित्रा 1 ए)। सप्ताह 2 तक, कॉर्टिकल दोष से सटे ओस्टियोलिसिस और हड्डी रीमॉडेलिंग दिखाई दे रहे थे। सप्ताह 2-5 से, प्रगतिशील हड्डी विनाश और ट्यूमर एनग्राफमेंट और विकास से जुड़ी नई हड्डी का गठन हुआ (चित्रा 1बी-ई)। रिपोर्टर जीन के साथ सेल लाइनों के लिए, हड्डी में परिवर्तन समय के साथ प्रतिदीप्ति या बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग आउटपुट में वृद्धि के साथ होगा। तीव्र लंगड़ापन आसन्न या वास्तविक पैथोलॉजिकल हड्डी फ्रैक्चर का एक संकेतक हो सकता है, जिससे माउस के तत्काल और सावधानीपूर्वक रेडियोग्राफिक मूल्यांकन की आवश्यकता होती है, और संभवतः अध्ययन से जल्दी हटा दिया जाता है। अध्ययन किए जा रहे ट्यूमर सेल लाइन के आधार पर, हड्डी का विनाश तेजी से हो सकता है, मेटास्टेसिस से बहुत आगे। यह प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर से जुड़े अध्ययनों में विशिष्ट महत्व का है, क्योंकि चूहों को नैदानिक रूप से प्रासंगिक मेटास्टेसिस के विकास से पहले अध्ययन से हटाना पड़ सकता है, अर्थात् फेफड़े। इन मामलों में, प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर का उपयोग करते समय न्यूनतम अवशिष्ट बीमारी और बाद में मेटास्टेसिस के अध्ययन की अनुमति देने के लिए ट्यूमर-असर अंग के सर्जिकल विच्छेदन की सिफारिश की जाती है, जैसा कि हमने पहले 4,8 बताया है। जबकि लोगों में पूर्ण हिंद अंग विच्छेदन आमतौर पर नहीं किया जाता है, यह पशु चिकित्सा में देखभाल का मानक है, जिनमें से मानव और कैनाइन ओस्टियोसारकोमा की नैदानिक और आणविक विशेषताओं में समानताएं अच्छी तरह से प्रलेखित हैं। चूहों में हिंद अंग विच्छेदन, इसलिए, कई पशु कोशिका लाइनों के लिए प्रासंगिक है। इसके अलावा, विच्छेदन चूहों में एक व्यवहार्य उपचार विधि है क्योंकि लोगों में उपयोग की जाने वाली अंग-संयम प्रक्रियाएं चूहों जैसे छोटे कृन्तकों में प्राप्त नहीं होती हैं। प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर वाले चूहों में, अक्षमता, प्रगतिशील वजन घटाने, सामान्य खराब शरीर की स्थिति और सांस लेने में कठिनाई (बढ़ी हुई दर या प्रयास) फेफड़ों और अन्य अंगों को ट्यूमर मेटास्टेसिस के विकास का संकेत दे सकती है। मेटास्टेसिस की पुष्टि करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग, μCT, या μMRI इमेजिंग द्वारा पुष्टि की जाती है, और प्रभावित जानवरों को इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए।
एक नकारात्मक परिणाम, जो संभवतः ट्यूमर एनग्राफमेंट की कमी के परिणामस्वरूप होता है, पर संदेह किया जाना चाहिए यदि प्रत्यारोपित टिबिया की रेडियोग्राफी या μCT परीक्षा पर प्रगतिशील परिवर्तन (ओस्टियोलाइटिक, ओस्टियोब्लास्टिक, या मिश्रित ऑस्टियोलाइटिक / ओस्टियोब्लास्टिक घावों, अध्ययन किए जा रहे सेल लाइन के आधार पर) का कोई सबूत नहीं है। रिपोर्टर जीन ले जाने वाली सेल लाइनों के लिए, ऑप्टिकल इमेजिंग द्वारा समय के साथ प्रतिदीप्ति या बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नलिंग में वृद्धि की कमी भी इस निष्कर्ष का समर्थन करेगी कि ट्यूमर एनग्राफ्ट करने में विफल रहा है। शल्य चिकित्सा स्थल संक्रमण की कमी या खराब संक्रमण से जुड़ा हो सकता है। हालांकि, यह विशिष्ट नैदानिक संकेत ों जैसे लालिमा, सूजन, या निर्वहन को प्रारंभिक पोस्ट-ऑपरेटिव अवधि (सर्जरी के बाद पहले 1-2 सप्ताह) में प्रदर्शित करेगा। सर्जिकल साइट संक्रमण के कारण जानवरों को संभावित रूप से ज्वर भी हो सकता है और शल्य चिकित्सा स्थल संक्रमण के कारण शुरुआती पोस्ट-ऑपरेटिव अवधि में गतिविधि की कमी या कुबड़ मुद्रा प्रदर्शित हो सकती है। तैयारी और अंग की उचित बाँझ तैयारी, बाँझ इंट्राऑपरेटिव तकनीक, और पूर्ण घाव बंद होने के दौरान बाँझ परिस्थितियों में एलोग्राफ्ट ्स की कटाई और रखरखाव से पोस्ट-ऑपरेटिव सर्जिकल घाव जटिलता की संभावना कम हो जाएगी, जिसके परिणामस्वरूप संक्रमण और ट्यूमर एनग्राफमेंट की विफलता होगी।
हमारी पिछली रिपोर्ट8 में, जब रिपोर्ट किए गए पायलट और निश्चित अध्ययन दोनों को शामिल किया गया, तो ओस्टियोसारकोमा के टुकड़ों के साथ प्रत्यारोपित 16 चूहों में से 16 (100%) ने ओस्टियोलाइटिक हड्डी के घावों में प्रगति की और इन 16 चूहों में से 14 (88%) ने मेटास्टेसिस विकसित किया। सभी मेटास्टेस को फेफड़ों में देखा गया और प्रत्यारोपण के 3 सप्ताह बाद हिस्टोलॉजी द्वारा निदान कियागया। प्रत्यारोपण के बाद 1 (एन = 2) और 2 (एन = 2) सप्ताह में किए गए अतिरिक्त जानवरों ने फेफड़ों के मेटास्टेसिस का कोई सबूत नहीं दिखाया।
चित्र 1: सीरियल रेडियोग्राफी। सीरियल रेडियोग्राफी (क्रम में) एक प्राथमिक हड्डी ट्यूमर सेल लाइन (ओस्टियोसारकोमा) का उपयोग करके चमड़े के नीचे ट्यूमर के इंट्राटिबियल प्रत्यारोपण के 5 सप्ताह बाद (ए) 1, (बी) 2, (सी) 3, (डी) 4, और (ई) साप्ताहिक रूप से किया जाता है। समय के साथ, प्रगतिशील हड्डी विनाश और ट्यूमर एन्ग्राफमेंट और विकास से जुड़ी नई हड्डी का गठन हुआ। इस आंकड़े को रेफरी8 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यह रिपोर्ट एक ट्यूमर के इंट्राटिबियल आरोपण के बाद प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर या हड्डी मेटास्टेसिस बनाने के लिए हमारे मॉडल का दस्तावेजीकरण करती है। हमारा मानना है कि इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। ट्यूमर सेल निलंबन के चमड़े के नीचे इंजेक्शन और परिणामी ट्यूमर टुकड़ों के इंट्राटिबियल प्लेसमेंट दोनों के लिए एक सुरक्षित एनेस्थेटिक विमान स्थापित किया जाना चाहिए। उपचर्म एलोग्राफ्ट को हटाने और एलोग्राफ्ट के इंट्राटिबियल प्लेसमेंट दोनों के लिए सर्जिकल साइट की बाँझ तैयारी होनी चाहिए। बाद में इंट्राटिबियल आरोपण के लिए ट्यूमर एलोग्राफ्ट टुकड़े समान रूप से बनाए जाने चाहिए। ट्यूमर के टुकड़ों के आरोपण के लिए समीपस्थ टिबिया में एक उचित आकार का दोष बनाया जाना चाहिए। सर्जिकल त्वचा के घाव को पोस्ट-ऑपरेटिव घाव जटिलताओं के जोखिम को कम करने के लिए पूरी तरह से बंद कर दिया जाना चाहिए। अंतिम महत्वपूर्ण कदम यह है कि यदि बाह्य मैट्रिक्स का उपयोग चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए ट्यूमर सेल निलंबन के हिस्से के रूप में किया जाता है, तो इंजेक्शन से पहले निलंबन के जमने से बचने के लिए निर्माता द्वारा अनुशंसित हैंडलिंग निर्देशों का उपयोग किया जाना चाहिए। अंग की उचित बाँझ तैयारी, बाँझ इंट्राऑपरेटिव तकनीक, और पूर्ण घाव बंद होने से पोस्ट-ऑपरेटिव सर्जिकल घाव जटिलता की संभावना कम हो जाएगी।
प्रत्यारोपित ट्यूमर और सर्जिकल तकनीक की विशेषताएं आपके अध्ययन की आबादी में शामिल करने के लिए सफल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए महत्वपूर्ण हैं। प्रारंभ में, यह सत्यापित किया जाना चाहिए कि ट्यूमर जेनोग्राफ्ट / एलोग्राफ्ट को सीधे टिबिया के मज्जा गुहा में प्रत्यारोपित किया जाता है, यह सुनिश्चित करते हुए कि ट्यूमर ऊतक पूरी तरह से हड्डी के अंदर है। हड्डी के बाहर ग्राफ्ट के विस्थापन को रोकने या सीमित करने के लिए संशोधन शुरू में हड्डी दोष में हड्डी के मोम या हड्डी सीमेंट का प्लेसमेंट या तो जेल फोम या हड्डी में छेद पर चमड़े के नीचे वसा ग्राफ्ट होगा। एक विकल्प कपाल टिबियल मांसपेशी के नीचे बनाए गए समीपस्थ टिबिया के पार्श्व पहलू पर एक छेद के माध्यम से ट्यूमर एलोग्राफ्ट डालना होगा। कपाल टिबियल मांसपेशी की उपस्थिति तब हड्डी के दोष पर जैविक कवर के रूप में काम करेगी, जिससे ट्यूमर के संभावित विस्थापन को सीमित किया जा सकेगा। हालांकि, यह समीपस्थ टिबिया के पार्श्व पहलू पर न्यूरोमस्कुलर आघात की क्षमता के साथ एक अधिक आक्रामक सर्जिकल दृष्टिकोण है। यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि प्रत्यारोपण से पहले ट्यूमर एलोग्राफ्ट ्स को एक समान आकार का बनाया गया है। कहा जा रहा है कि, ट्यूमर एलोग्राफ्ट्स को किसी भी आयाम में 1 मिमी से अधिक नहीं होना चाहिए, क्योंकि किसी भी जैविक प्रणाली में बड़े ट्यूमर के आकार में छोटे ग्राफ्ट की तुलना में एनग्राफ्ट होने की संभावना कम होती है जब आरोपण के समय ग्राफ्ट को प्रत्यक्ष, तत्काल संवहनी आपूर्ति प्रदान नहीं की जाती है। हमने 0.5 मिमी 3 के अंतिम प्रत्यारोपित ट्यूमर की मात्रा के साथ सफल परिणामों की सूचना दी है, लेकिन उम्मीद है कि 1 मिमी3 तक संयुक्त ट्यूमर टुकड़े की मात्रा सफल परिणाम प्राप्त करेगी। हालांकि, अधिकतम प्रत्यारोपण योग्य ट्यूमर टुकड़े की मात्रा निर्धारित नहीं की गई है। क्रायोसंरक्षित ऊतक की तुलना में, ताजा ट्यूमर जेनोग्राफ्ट्स और एलोग्राफ्ट्स के जीवित रहने की अधिक संभावना है, हालांकि हमने सावधानीपूर्वक क्रायोप्रिजर्व्ड ट्यूमर एलोग्राफ्ट्स का उपयोग करने के अभ्यास के साथ कोई समस्या नहीं देखी है। स्नैप-फ्रोजन एलोग्राफ्ट ्स को प्रत्यारोपित नहीं किया जाना चाहिए। इसके अलावा, उपचर्म ट्यूमर के कैप्सूल और बाहरी हिस्से का विच्छेदन ट्यूमर की इस परत से किसी भी योगदान को रोक देगा, जो बड़े पैमाने पर ट्यूमर कोशिकाओं से युक्त होने के बजाय एक महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा घुसपैठ के साथ काफी हद तक रेशेदार और संवहनी है। स्केलपेल ब्लेड के साथ सीधे बड़े ट्यूमर द्रव्यमान से ट्यूमर एलोग्राफ्ट बनाने का एक वैकल्पिक तरीका एक छोटी बायोप्सी सुई का उपयोग करके है जो एक बेलनाकार ट्यूमर "कोर" बनाता है जिसे तब आरोपण से पहले पूर्वनिर्धारित लंबाई तक काटा जा सकता है। बायोप्सी सुई या कोर बायोप्सी पंच का उपयोग आरोपण के लिए एक समान ट्यूमर टुकड़े बनाने में फायदेमंद हो सकता है, क्योंकि बायोप्सी प्रक्रिया द्वारा दो समान आयाम (चौड़ाई और गहराई) बनाए जाने के बाद, उन्हें प्रत्यारोपण से पहले उचित लंबाई तक काटा जा सकता है। यदि प्रत्यारोपित ट्यूमर कोशिकाओं में ल्यूसिफेरस या फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे रिपोर्टर जीन का उपयोग किया जा रहा है, तो प्रत्यारोपण के समय या आरोपण के 1 सप्ताह बाद ट्यूमर के टुकड़ों का मूल्यांकन प्रत्यारोपित ट्यूमर के टुकड़ों में ट्यूमर कोशिकाओं से सापेक्ष योगदान का संकेत देगा, साथ ही व्यवहार्यता भी।
किसी भी प्रक्रिया के साथ, इस तकनीक के हमारे रिपोर्ट किए गए लाभों के अलावा सीमाएं हैं। मेटास्टेसिस एक बहु-चरणीय प्रक्रिया है जिसमें एक कोशिका को अपने प्राथमिक स्थान से बाह्य मैट्रिक्स के माध्यम से आक्रमण और प्रवास को सफलतापूर्वक निष्पादित करने, ट्यूमर की रक्त आपूर्ति को इंट्रावेट करने, परिसंचरण में जीवित रहने की आवश्यकता होती है जब तक कि यह अपने अंतिम मेटास्टैटिक गंतव्य तक नहीं पहुंच जाता, अंग में उचित रूप से प्रवेश करता है और फिर या तो निष्क्रिय अवस्था में रहता है या मेटास्टैटिक घाव बनाने के लिए प्रसार करता है, और नैदानिक रूप से पता लगाने योग्य मेटास्टेसिसबनने के लिए सामान्य ऊतक वास्तुकला का संशोधन। वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले हड्डी मेटास्टेसिस के माउस मॉडल मुख्य रूप से प्राथमिक ट्यूमर की सामान्य साइट में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन, हृदय के बाएं वेंट्रिकल में इंट्रावस्कुलर इंजेक्शन या पूंछ नसों (पार्श्व या पृष्ठीय पुच्छल नसों) में परिधीय रूप से इंजेक्शन, या ट्यूमर सेल निलंबन3 के प्रत्यक्ष इंट्रा-ऑसियस इंजेक्शन पर निर्भर करते हैं। हालांकि, हड्डी मेटास्टेसिस मॉडल में सुधार करने की कोशिश करने वाली हालिया रिपोर्टों ने इलियाक, पुच्छल या ऊरु धमनियों 19,20,21 में इंजेक्शन की वकालत की है। इन सभी विधियों में हड्डी मेटास्टैटिक कैस्केड के भीतर एक या अधिक चरण शामिल हैं, प्रत्यक्ष इंट्रा-ओसेस इंजेक्शन को छोड़कर या हमारे मामले में एक ट्यूमर एलोग्राफ्ट के आरोपण को छोड़कर, जो केवल अंतिम ऊतक संशोधन को मॉडल करता है। इसलिए, यह हमारी तकनीक की एक अंतर्निहित सीमा है। एक अतिरिक्त सीमा यह है कि जैसा कि वर्तमान में वर्णित है, इसके लिए एक मध्यवर्ती माउस होस्ट में एलोग्राफ्ट्स का प्रचार करने की आवश्यकता होती है, जिसके लिए अतिरिक्त चूहों के उपयोग की आवश्यकता होती है और इसके परिणामस्वरूप एक ट्यूमर का आरोपण होता है जो 100% शुद्ध ट्यूमर कोशिकाएं नहीं है। एलोग्राफ्ट में चमड़े के नीचे के स्थान पर बढ़ने वाले ट्यूमर द्वारा प्रदान किए गए कुछ स्ट्रोमल योगदान होंगे। इस चमड़े के नीचे स्ट्रोमल योगदान को कम करने का एक संभावित विकल्प एक जैविक सब्सट्रेट जैसे बाह्य मैट्रिक्स या मचान में चमड़े के नीचे कोशिकाओं का इंजेक्शन होगा। वैकल्पिक रूप से, ट्यूमर की प्राथमिक साइट में ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन, इसके बाद ट्यूमर हटाने और ग्राफ्ट तैयारी की जा सकती है।
ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंट्रा-ओसेस इंजेक्शन के बाद प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर या हड्डी मेटास्टेसिस मॉडलिंग के मौजूदा तरीकों की तुलना में इस रिपोर्ट में उल्लिखित विधि के महत्वपूर्ण फायदे हैं। जैसा कि चर्चा की गई है, हमने और अन्य लोगों ने फेफड़ों के प्रत्यक्ष एम्बोलाइजेशन और सेल निलंबन 8,13 के इंट्राटिबियल इंजेक्शन के बाद कभी-कभी तत्काल मृत्यु देखी है। यह मज्जा गुहा में ट्यूमर कोशिकाओं के दबाव वाले इंजेक्शन से उत्पन्न होता है, जिसके बाद ट्यूमर कोशिकाएं अस्थि मज्जा संवहनी साइनसोइड्स के माध्यम से परिधीय रक्त की आपूर्ति में प्रवेश करती हैं और शिरापरक वापसी द्वारा फेफड़ों में ले जाई जाती हैं। ये घटनाएं यांत्रिक रूप से लोगों और जानवरों में कुल संयुक्त आर्थ्रोप्लास्टी से जुड़े मज्जा गुहा में प्रत्यारोपण के दबाव वाले प्लेसमेंट से जुड़े फुफ्फुसीय या शिरापरक थ्रोम्बोम्बोलिज्म के साथ देखी जाती हैं। हम और अन्य अनुमान लगाते हैं कि फेफड़ों के लिए यह एम्बोलिक घटना सेल-लाइन विशिष्ट (अप्रकाशित अवलोकन) हो सकती है। हालांकि, इन एम्बोलिक आर्टिफिक्चुअल मेटास्टेस12 के निर्माण को सीमित करने के लिए बहुत विस्तृत कदम उठाए गए हैं। प्रारंभ में, पर्याप्त ट्रिप्सिनाइजेशन और इंजेक्शन के लिए एक समान एकल सेल निलंबन का निर्माण होना चाहिए, जिसे सेल क्लंपिंग को रोकने के लिए बर्फ पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। सुई को समीपस्थ टिबियल ग्रोथ प्लेट के माध्यम से ठीक से रखा जाना चाहिए, जिसके बाद मज्जा गुहा में छोटे इंजेक्शन वॉल्यूम (~ 10 μL) और प्रतिरोध-मुक्त इंजेक्शन किए जाने चाहिए। इसके बावजूद, फेफड़ों और अन्य अंगों में ट्यूमर सेल वितरण, इंट्रा-ओसेस और इंट्रावस्कुलर इंजेक्शन तकनीकों के बाद बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग द्वारा आसानी से देखा जा सकता है, यह सुझाव देते हुए कि यह संभव है कि फेफड़ों और अन्य अंगों में इस बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल को उत्पन्न करने वाली कोशिकाएं दूर के मेटास्टेसिस (अप्रकाशित अवलोकन) को जन्म दे सकती हैं।. हमने पाया है कि इस तकनीक का एक और लाभ यह है कि एक एकल ट्यूमर अध्ययन आबादी के भीतर एक समान हड्डी साइट में बढ़ता है, जिससे पशु-से-पशु परिवर्तनशीलता कम हो जाती है। यह एक समान अध्ययन आबादी की स्थापना और उपचार समूहों के बीच तैयार तुलना को सक्षम बनाता है। यह हड्डी मेटास्टेसिस के विपरीत है जो ऑर्थोटोपिक या इंट्रावस्कुलर इंजेक्शन के बाद विकसित होता है, जहां कोशिकाओं के लिए विभिन्न कंकाल साइटों पर मेटास्टेसाइज करना और विभिन्न कैनेटीक्स के साथ बढ़ना संभव है, जिससे अध्ययन समूहों के बीच तुलना चुनौतीपूर्ण हो जाती है। हमारे ट्यूमर एलोग्राफ्ट्स के आरोपण के बाद एक शारीरिक साइट में ट्यूमर की वृद्धि अन्य अंग प्रणालियों या प्राथमिक ट्यूमर के बोझ में मेटास्टेसिस के कारण चूहों को हटाने की संभावना से भी बचती है, जैसा कि इंट्रावस्कुलर और ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन तकनीकों के साथ देखा जा सकता है। इसके अलावा, हमने ट्यूमर एलोग्राफ्ट प्रत्यारोपण के बाद 100% एन्ग्राफमेंट देखा है, जो एक समान अध्ययन आबादी का समर्थन करता है और उचित नमूना आकार संख्या प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त चूहों के अनावश्यक उपयोग से बचता है। यह हड्डी में ट्यूमर सेल निलंबन के पर्क्यूटेनियस इंजेक्शन के बाद अपूर्ण और गलत इंजेक्शन की सीमा को भी दूर करता है।
इस तकनीक में बहुमुखी प्रतिभा की एक बड़ी डिग्री है जिसके परिणामस्वरूप संशोधन हुए हैं जो वर्तमान में हमारे शोध में उपयोग किए जा रहे हैं और भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए महान उपयोगिता की क्षमता है। प्रारंभ में, जबकि हम समीपस्थ टिबिया को हमारे इंट्रा-ओसेस इम्प्लांटेशन साइट के रूप में नियोजित करते हैं, प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर या हड्डी मेटास्टेसिस की अन्य सामान्य साइटों का उपयोग आसानी से किया जा सकता है, जिसमें डिस्टल फीमर और समीपस्थ ह्यूमरस शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं। हालांकि, इन साइटों के साथ-साथ श्रोणि और रीढ़ जैसे क्षेत्रों के लिए सर्जिकल दृष्टिकोण को समीपस्थ टिबिया की तुलना में धीरे-धीरे अधिक व्यापक शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, श्रोणि, रीढ़, खोपड़ी, त्रिज्या और उल्ना जैसी साइटों को ट्यूमर आरोपण के लिए पर्याप्त हड्डी के स्टॉक से लाभ नहीं होता है। मौखिक ट्यूमर जैसे हड्डी-आक्रामक विकृतियों के लिए, हड्डी से सटे या ऑरोफैरिंक्स के भीतर ट्यूमर एलोग्राफ्ट्स का प्लेसमेंट भी आक्रामक ट्यूमर 3,22 की प्रगति को पुन: उत्पन्न कर सकता है। इन विट्रो और विवो प्रयोगों में अक्सर सेल प्रकार की रुचि पर विभिन्न सेल प्रकारों के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए सह-संस्कृति या सह-इंजेक्शन तकनीकों का उपयोग किया जाता है। इसलिए, चमड़े के नीचे के ट्यूमर बनाने के लिए एक साथ दो या दो से अधिक सेल प्रकारों के इंजेक्शन के लिए क्षमता मौजूद है, जिसे बाद में इस तकनीक का उपयोग करके हड्डी में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं का उपयोग अकेले या अन्य सामान्य या आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं के साथ संयोजन में किया जा सकता है ताकि ट्यूमर एलोग्राफ्ट्स बनाया जा सके। सटीक चिकित्सा में बढ़ती रुचि और मानव कैंसर के इन विट्रो और विवो मॉडल बनाने के साथ, चूहों में रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट प्रत्यारोपण लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है। हाल ही में, स्तन कैंसर हड्डी मेटास्टेसिस के एक मॉडल का वर्णन किया गया है जहां रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स कोनग्न चूहों में चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित मानव हड्डी डिस्क में ऑर्थोटोपिकल रूप से मेटास्टेसाइज्ड किया गया था। इससे, रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स को हमारे मॉडल का उपयोग करके सीधे हड्डी में प्रत्यारोपित किया जा सकता है, बिना चमड़े के नीचे प्रसार के लिए एक मध्यवर्ती मेजबान की आवश्यकता के। यह ट्यूमर कैनेटीक्स के तेजी से मूल्यांकन और केवल एक रोगी बायोप्सी से संभावित रूप से कई उपचार संयोजनों का मूल्यांकन करने की क्षमता की अनुमति देगा, जिससे एलोग्राफ्ट तैयारी के लिए एक बड़े ट्यूमर द्रव्यमान की आवश्यकता नहीं होगी। कैंसर अनुसंधान में ऑर्गेनोइड्स के बढ़ते उपयोग को हमारे मॉडल24 में भी नियोजित किया जा सकता है। इसके लिए टिबियल कॉर्टेक्स में छेद के माध्यम से इन सेल समुच्चय के सुई या पिपेट इंजेक्शन की आवश्यकता होगी। इसलिए, हम हड्डी और मज्जा गुहा के बाहर ऑर्गेनॉइड प्रवास की संभावना को सीमित करने के लिए कॉर्टिकल दोष (जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है) को सील करने की सिफारिश करेंगे। जैसा कि हमने प्रदर्शन किया है, कोशिकाओं को ऑप्टिकल (बायोलुमिनेसेंस या फ्लोरेसेंस) या उन्नत (डिजिटल रेडियोग्राफी, μCT, या μMRI) इमेजिंग द्वारा लेबल और ट्रैक किया जा सकता है जो समय के साथ ट्यूमर के विकास के आकलन की अनुमति देता है। इससे जानवरों की संख्या को कम करने का लाभ भी होता है क्योंकि समय के साथ एक ही जानवर की छवि बनाई जाती है।
सारांश में, यह रिपोर्ट हड्डी में ठोस ट्यूमर ग्राफ्ट आरोपण का उपयोग करके प्राथमिक हड्डी ट्यूमर और हड्डी मेटास्टेसिस मॉडलिंग की हमारी तकनीक को प्रदर्शित करती है।
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Disclosures
डॉ हिल्ड्रेथ को एनआईएच द्वारा पुरस्कार संख्या K01OD026527 के तहत वित्त पोषित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि एनआईएच के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करे।
Acknowledgments
लेखक इस तकनीक के विकास में डॉ बेथ चैफी, डीवीएम, पीएचडी, डीएसीवीपी के महत्वपूर्ण योगदान को स्वीकार करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
References
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